聚酰胺-胺/納米羥基磷灰石的合成、表征以及對牙本質小管的封閉作用

林軒東，謝方方，郝宇紅，秦鶴嘉，龍金東

廣西醫科大學 附屬口腔醫院牙體牙髓科，南寧 530021

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·論 著·

聚酰胺-胺/納米羥基磷灰石的合成、表征以及對牙本質小管的封閉作用

林軒東，謝方方，郝宇紅，秦鶴嘉，龍金東

廣西醫科大學 附屬口腔醫院牙體牙髓科，南寧 530021

目的 合成并表征同時具有有機、無機材料特性的納米復合生物材料聚酰胺-胺/納米羥基磷灰石(PAMAM/n-HAP)，并觀察其對牙本質小管的封閉作用。方法 采用Pramanik水化學反應的方法制備PAMAM/n-HAP，并通過透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀對其表征和驗證。最終應用PAMAM/n-HAP封閉脫礦的牙本質小管，并應用掃描電子顯微鏡對其修復牙本質小管的效果進行評價。結果 傅里葉變換紅外光譜儀顯示1244 cm-1和1650 cm-1出現了PAMAM所特有的強振動峰，同時透射電子顯微鏡顯示n-HAP的表面出現10 nm厚的低襯度包裹層，證實了PAMAM/n-HAP的成功合成。掃描電子顯微鏡顯示應用PAMAM/n-HAP能夠有效地降低牙本質小管的直徑，填充空虛的牙本質小管，封閉牙本質小管。結論 PAMAM/n-HAP作為一種新型的納米復合生物材料具有良好的生物活性，能夠借助表面的羧基與暴露的膠原纖維發生特異性結合，從而能夠在較深的位置穩定封閉牙本質小管，提示PAMAM/n-HAP可能成為一種新型的脫敏材料應用于臨床。

聚酰胺-胺/納米羥基磷灰石；牙本質過敏；牙本質小管

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：163-168

牙本質過敏被定義為暴露的牙本質受到冷、熱、機械或化學刺激所產生的短暫而尖銳的疼痛，并且牙本質過敏不能夠單純歸入到牙體缺損或病理性疾病的類別[1]。牙本質過敏通常是由酸蝕、磨損或磨耗、牙齦退縮以及牙周治療等引起。1960年最先提出的流體動力學學說認為正是因為暴露的牙本質小管受到刺激引起牙本質小管液的流動最終引起疼痛?；诖嗽?，目前臨床使用的脫敏材料大多是應用無機材料，例如氟化物[2]、草酸鹽[3]等,通過單純機械沉積作用封閉牙本質小管。近年來，納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HAP)/聚合物生物復合材料因同時具有有機材料和無機材料的優點而成為骨修復材料的新的熱點[4]。本研究初步探討人工合成的聚酰胺-胺(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)/n-HAP納米復合生物材料對牙本質小管的封閉作用。

材料和方法

PAMAM/n-HAP納米復合生物材料的制備 1 g表面官能團為羧基的聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM-COOH，美國Sigma公司)慢慢溶解于100 cm3的三蒸水中，并使用磁力攪拌器(雙數顯恒溫磁力攪拌器 85- 2B，江蘇省金壇市友聯儀器研究所)攪拌30 min以確保PAMAM-COOH完全溶解。之后，6 g n-HAP(60 nm，上海華藍化學科技有限公司)逐步加入至PAMAM-COOH溶液中，并使用磁力攪拌器攪拌過夜。最后使用大功率超聲設備(KQ5200V超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司)對此混合物進行超聲振蕩處理30 min。終產物通過過濾分離并使用雙蒸水清洗3次去除游離的PAMAM-COOH，最后置于50℃的真空干燥箱過夜。

PAMAM/n-HAP 納米復合生物材料的表征 用透射電子顯微鏡(H- 7650，HI TACHI)在100 kV的加速電壓條件下測試n-HAP晶體形貌和改性n-HAP形貌 。同時使用傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司) 對復合材料的有機無機相鍵合進行表征。

脫礦牙本質模型的制備：獲得患者的知情同意后，搜集廣西醫科大學口腔頜面外科因正畸需要而拔除的新鮮第三磨牙90顆，經顯微鏡觀察，無白斑、無缺損、無齲壞，使用醫用刀片去除表面的軟組織，并使用3%的次氯酸鈉去除牙齒表面的細菌，最終浸泡于4℃條件下0.05%的麝香草酚溶液中，于拔牙后1個月內使用。本研究采用Mordan等[5]的實驗方法制備牙本質脫礦模型。用高速渦輪機的金剛砂車針在水冷的條件下,將各離體牙均以垂直于牙體長軸方向于釉牙骨質界冠方2～3 mm處切割4 mm×4 mm×1 mm大小的牙本質磨片，每顆牙制備1個。使用600、800、1000目的碳化硅砂紙逐級打磨拋光。拋光后的牙本質磨片浸泡于0.5 mo1/L的EDTA(pH 8.0)脫礦30 min。每個脫礦后使用去離子水沖洗3次,并且使用大功率超聲設備震蕩10 min以去除游離的礦化物，制備完成的脫礦牙本質磨片浸泡于PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)中，4℃保存。

人工唾液的配制：按照Fusayama等[6]的實驗方法：Na2S·9H2O 0.005 g、NaCl 0.400 g、KCl 0.400 g、NaH2PO4·H2O 0.690 g、CaCl2·H2O 0.795 g、蒸餾水1000 ml，在使用前使用1 mo1/L的NaOH將其pH值調節至7.2，高溫高壓滅菌后保存。

牙本質小管的封閉實驗：(1) 對照組A(n=10)：牙本質磨片使用微量移液器(大龍醫療設備有限公司)將25 μl去離子水處理實驗面，加入到牙本質磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，連續處理7 d后保存于37℃的人工唾液中。(2) 實驗組B(n=10)：牙本質磨片使用微量移液器將25 μl PAMAM/n-HAP糊劑(0.5 g PAMAM/n-HAP與1 ml去離子水調配制成)加入到牙本質磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，連續處理7 d后保存于37℃的人工唾液中。(3) 實驗組C (n=10)：牙本質磨片使用25 μl n-HAP糊劑(0.5 g n-HAP與1 ml去離子水調配制成)處理實驗面，加入到牙本質磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，連續處理7 d后保存于37℃的人工唾液中。每次處理后，牙本質磨片靜置5 min并使用去離子水沖洗2 min。最后每個樣本置于含有5 ml 人工唾液的密封PE管中，并保存于37℃恒溫水浴箱(上海藍豹實驗儀器有限公司)。人工唾液每24小時更換1次。

掃描電子顯微鏡 觀察3組的樣本經過7 d的封閉實驗后，使用掃描電子顯微鏡(Hitachi，SU8020，10 KV，USA)觀察脫礦牙本質磨片的封閉作用。掃描電鏡表征前，每個牙本質磨片使用去離子水沖洗2 min并置于50℃條件的真空干燥箱24 h徹底干燥，每組隨機選擇4個牙本質磨片噴金后在10 kV的加速條件下觀察橫斷面以及縱斷面的牙本質小管的形貌特征和微觀結構。

結 果

n-HAP以及PAMAM/n-HAP晶體形貌的透射電子顯微鏡觀察結果 在200 000倍的透射電子顯微鏡表征下，n-HAP晶體為短棒狀，直徑 20～30 nm，長度為60～80 nm，多數晶體顆粒容易聚合呈團簇狀，n-HAP的界面清晰，而PAMAM/n-HAP納米復合生物材料的表面可以看到約為10 nm厚的低襯度有機分子層有序地包裹著n-HAP(圖1)。

n-HAP：納米羥基磷灰石；PAMAM：聚酰胺-胺n-HAP：nano-hydroxyapatite；PAMAM：polyamidoamine dendrimers

圖 1 n-HAP(A)和PAMAM/n-HAP(B)的透射電鏡圖(× 200 000)

Fig 1 Transmission electron microscopy photographs of n-HAP (A) and PAMAM/n-HAP (B)(×200 000)

圖 2 n-HAP、PAMAM/n-HAP 納米復合生物材料的紅外光譜圖

Fig 2 Fourier transform infrared spectroscopic spectra of n-HAP and PAMAM/n-HAP

牙本質小管的橫斷面掃描電子顯微鏡觀察結果 對照組A基本所有的牙本質小管均為暴露狀態，牙本質小管的直徑并無明顯的縮窄。實驗組B幾乎所有的牙本質小管均被致密的棒狀成簇的外源性晶體(PAMAM/n-HAP)所封閉，牙本質小管的邊界不清，高倍電鏡圖(×25 000)顯示牙本質小管內均一致密的封閉晶體出現不規則的斷裂痕跡，可能由于真空干燥箱的高溫作用引起的脫水膨脹斷裂引起。實驗組C牙本質小管口發現不規則的晶體沉積物，然而牙本質小管的直徑并無明顯的縮窄，管內仍然空虛，高倍鏡下(×25 000)牙本質小管內壁的膠原纖維表面可見棒狀晶體沉積，同時小管深處也可見部分沉積封閉的礦化物，但是管腔內大部分空間仍然敞開(圖3)。

討 論

圖 3 去離子水[A1(×2000)、 A2(×3000)、A3 (×25 000)]、PAMAM/HAP [B1(×2000)、 B2(×3000)、 B3(×25 000)]、n-HAP [C1(×2000)、C2(×3000)、C3 (×25 000)]處理7 d后的掃描電鏡圖

Fig 3 Scanning electron microscopic micrographs of the surface of dentin treated with deionized water [A1(×2000)，A2(×3000)，A3(×25 000)]，PAMAM/HAP [B1(×2000)，B2(×3000)，B3 (×25 000)]，n-HAP [C1(×2000)，C2(×3000)，C3 (×25 000)]after 7 days

A.去離子水處理7 d后的縱斷面電鏡圖(×1000)；B. PAMAM/n-HAP處理7 d后的縱斷面電鏡圖 (×1000)；C. n-HAP處理7 d后的縱斷面電鏡圖 (×1000)

A. vertical morphology of the surface of dentin treated with deionized water after 7 days (×1000)；B. vertical morphology of the surface of dentin treated with PAMAM/n-HAP after 7 days (×1000)；C. vertical morphology of the surface of dentin treated with n-HAP after 7 days (×1000)

圖 4 牙本質樣本縱斷面形貌

Fig 4 The vertical morphology of dentin samples

總之，PAMAM/n-HAP作為一種新型的具有生物活性的納米材料，能夠通過表面的羧基官能團規律地結合并且穩定到牙本質小管內部暴露的膠原纖維表面，從而封閉暴露的牙本質小管。單純依靠機械沉積作用的材料(n-HAP)雖然能夠借助尺寸優勢進入到牙本質小管內部，但是其與膠原纖維沒有實質性的結合作用，僅通過機械沉積作用不能夠穩定地封閉牙本質小管，在去離子水的沖洗作用下，n-HAP顆粒容易游離從而造成牙本質小管的不完全封閉作用。

目前，多種材料改性的n-HAP大多數應用于修復骨缺損，而本研究采用PAMAM與n-HAP結合形成的PAMAM/n-HAP材料應用于修復脫礦牙本質小管。本研究表明在n-HAP的表面通過添加PAMAM樹枝狀大分子，明顯增強了生物活性，從而穩定地封閉開放的牙本質小管。綜上，PAMAM/n-HAP納米復合生物材料具有良好的牙本質小管封閉作用，因此有望作為一種新型的脫敏材料應用于臨床，并可能成為口腔醫學領域最具開發價值的新材料之一。后期本課題組的研究將著重比較PAMAM/n-HAP納米復合生物材料與目前臨床應用的脫敏劑的封閉效果差異。

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Synthesis and Characterization of Polyamidoamine Dendrimers/Nano-hydroxyapatite and Its Role in Dentin Tubule Occlusion

LIN Xuandong，XIE Fangfang，HAO Yuhong，QIN Hejia，LONG Jindong

Department of Endodontics，Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

Corresponding author：XIE Fangfang Tel：0771- 2387834，E-mail：linxuandong@live.com

Objective To synthesis and characterization nano-composite biomaterials-polyamidoamine dendrimers/nano-hydroxyapatite (PAMAM/n-HAP)，which has the properties of both organic and inorganic materials，and then evaluate its role in dentin tubule occlusion. Methods PAMAM/n-HAP was characterized and validated by Fourier transform infrared spectrometry and transmission electron microscopy after its preparation via the Pramanik aqueous-based chemical method. Scanning electron microscope was used to evaluate its role in dentin tublule occlusion. Results The peak absorption bands were found at 1244 cm-1and 1650 cm-1in Fourier transform infrared spectroscopy. A relatively low-density coating (about 10 nm) appeared on the n-HAP. The results of Fourier transform infrared spectrometry and transmission electron microscopy confirmed the successful synthesis of PAMAM/n-HAP. The scanning electron microscope showed that PAMAM/n-HAP could effectively reduce the diameter of the dentin tubule and close dentin tubule. Conclusions PAMAM/n-HAP，as a newly synthesized biomaterial，has a good binding capacity with collagen fibers with the help of superficial carboxyl. It can induce effective dentinal tubule occlusion，indicating that PAMAM/n-HAP have great potential in clinical practice for dentin hypersensitivity.

polyamidoamine dendrimers/nano-hydroxyapatite；dentin hypersensitivity；dentin tubule

謝方方 電話：0771- 2387834，電子郵件：linxuandong@live.com

R781.1

A

1000- 503X(2017)02- 0163- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.02.001

2016- 09- 28)