Orionin對急性肝衰竭小鼠的保護作用及其對肝組織細胞因子水平的影響*

鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

·肝衰竭·

Orionin對急性肝衰竭小鼠的保護作用及其對肝組織細胞因子水平的影響*

鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

目的探討冬凌草甲素（Oridonin）對脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）聯合誘導的急性肝衰竭（ALF）小鼠的保護作用及其對肝組織細胞因子水平的影響。方法取150只小鼠，隨機分成5組，每組30只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型，設生理鹽水對照組、Oridonin對照組、LPS/D-Gal誘導模型組和LPS/D-Gal處理及不同劑量Oridonin干預組。采用Real-time PCR法檢測肝組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平。結果模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30），而兩個Oridonin干預組小鼠48 h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30，P＜0.01）；組織病理學檢查顯示模型組小鼠肝細胞呈大塊或/和亞大塊壞死，肝小葉結構消失，殘存肝細胞腫脹、空泡變性，肝竇腫脹充血，炎細胞浸潤。Oridonin干預組小鼠肝細胞壞死、空泡變性和炎細胞浸潤等較模型組有明顯的改善；模型組小鼠血清ALT和AST水平分別為（345.3± 54.1）U/L和（500.2±53.5）U/L，明顯高于對照組的［（42.3±0.6）U/L和（117.1±9.8）U/L，P＜0.01］，兩個Oridonin干預組分別為（303.9±39.5）U/L和（340.6±2.8）U/L及［（130.2±38.3）U/L和（209.8±36.2）U/L，P＜0.05］；模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），而兩個Oridonin干預組肝組織TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著低于模型組（P＜0.01）。結論Oridonin對LPS/D-Gal誘導的ALF小鼠具有顯著的保護作用，其作用機制可能與降低肝組織細胞因子水平有關。

急性肝衰竭；脂多糖；D-氨基半乳糖氨；冬凌草甲素；細胞因子;小鼠

急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）病情兇險，死亡率高，目前尚無有效防治方法[1]。因此，探尋能改善ALF預后的治療新策略具有重要的臨床意義。ALF病情進展與炎性細胞因子過度釋放及由此介導的肝細胞凋亡和壞死密切相關[1-3]。冬凌草甲素（oridonin）是從中藥冬凌草中分離出來的活性雙萜類化合物，具有廣泛的抗腫瘤和抗炎等生物活性[4-7]?；贏LF是一種炎癥相關性疾病，oridonin具有廣泛強大的抗炎效應，提示oridonin可能對ALF具有保護作用。本研究以脂多糖/D-氨基半乳糖氨（Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-Gal）誘導小鼠ALF為模型，探討oridonin的保護作用，并初步探索其保護作用是否與抑制肝組織細胞因子的分泌水平有關。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與藥物6～8周齡，雌性SPF級，體質量為20～22 g的C57/BL6小鼠購自中國科學院上海生命科學研究院，在清潔級動物實驗中心喂養（標準動物飼料及飲水，環境溫度為21±2℃,12 h的明暗交替光照時間）。所有動物實驗均符合本校動物倫理委員會的有關規定。D-Gal和LPS（E. Coli,菌株O111:B4）購自美國Sigma公司。Oridonin購自美國Selleck公司。蘇木素-伊紅染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。ReverTra Ace qPCR RT Kit購自日本Toyobo公司，SYBR@ Green Real-time PCR Master Mix購自上海ExCell Bio公司。

1.2 ALF模型的建立取150只小鼠，隨機分成5組，每組30只。a組（正常對照組）：給予生理鹽水0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的生理鹽水；b組（藥物對照組）：給予Oridonin（將oridonin溶于生理鹽水，0.2 mg/只）0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的生理鹽水；c組（模型組）：給予LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只）/生理鹽水0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的LPS/D-Gal混合溶液；d組和e組（藥物干預組）：給予Oridonin（0.2 mg/只）/LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只），其中d組給予Oridonin（0.2 mg/只）0.5 ml腹腔注射，1 h后給予同等體積的LPS/D-Gal混合溶液腹腔注射，e組給予Oridonin 0.5 ml腹腔注射，1次/4 d，共3次，最后一次在給藥后1 h給予同等體積的LPS/D-Gal混合溶液腹腔注射。觀察并記錄各組小鼠存活情況，1次/6 h，計算小鼠48 h存活率。另取25只小鼠，隨機分成5組，每組5只，分組和藥物處理方法同上。在腹腔注射LPS/D-Gal后6 h，經眼球采血，分離血清，保存于-80℃，備檢。取肝組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，經過常規脫水、浸蠟、包埋，制成5μM切片，行HE染色。另取肝組織經液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，備檢。

1.3 血清ALT和AST水平檢測使用日立7180全自動血生化分析儀檢測。

1.4 肝組織細胞因子mRNA水平檢測采用RT-PCR法，以Trizol法提取肝組織RNA，經紫外分光光度計測定RNA純度，取吸光度A260/A280為1.8～2.0的RNA用于逆轉錄，采用Real-time PCR試劑盒行PCR擴增，每個反應體系共20μl，包括DNA模板（10 ng/μl）1.4μl，SYBR 10μl，引物1.6μl（10μM）和ddH2O 7μl。反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸25 s，40個循環。以GAPDH為內參照，運用2-△△CT法分析結果。所有引物均由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，其序列分別為：TNF-α：正義鏈，5’-CTCCCAGGTATATGGGCT CA-3’，反義鏈：5’-CCA GGT TCT CTT CAA GGG AC-3’；IL-1α：正義鏈，5’-AGT ATC AGC AAC GTC AAG CAA-3’，反義鏈：5’-TCC AGA TCA TGG GTT ATG GAC TG-3’；IL-1β：正義鏈，5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGT G-3’，反義鏈：5’-TGG ATG CTC TCA TCA GGA CAG-3’；IL-6：正義鏈，5’-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3’，反義鏈：5’-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3’；GAPDH：正義鏈，5’-TCC AAG GAG TAA GAA ACC CTG GAC-3’，反義鏈，5’-GTTATTATGGGGGTCTGGGAT GG-3’。

1.5 統計學處理應用GraphPad Prism 6.0行統計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采取獨立樣本t檢驗，兩個和兩個以上樣本率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05和P＜0.01分別表示差異具有顯著性和非常顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 Oridonin可顯著提高ALF小鼠存活率在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30）；經Oridonin干預的d組和e組小鼠48h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30，P＜0.01，圖1），表明Oridonin可明顯提高ALF小鼠的存活率。

圖1 各組小鼠存活率比較正常對照組及藥物對照組小鼠48 h存活率為100%（30/30）；在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30），經Oridonin干預的d組和e組小鼠48 h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30）

2.2 Oridonin顯著改善ALF小鼠肝組織損傷正常對照組及藥物對照組肝組織細胞及肝小葉結構完整；在LPS/D-Gal處理6 h后，模型組小鼠肝組織呈大塊或/和亞大塊壞死，小葉結構消失，殘存肝細胞腫脹、空泡變性，肝竇腫脹充血，炎細胞浸潤；Oridonin干預組小鼠肝細胞壞死、空泡變性及炎細胞浸潤等較模型組有明顯的改善（圖2）。

圖2 肝組織病理學表現（HE，200×）a：正常對照組，b：藥物對照組；c：模型組；d和e：藥物干預組

2.3 各組小鼠血清ALT和AST水平比較在LPS/D-Gal處理6 h后，模型組小鼠血清ALT和AST水平分別為（345.3±54.1）U/L和（500.2± 53.5）U/L，顯著高于對照組的（42.3±0.6）U/L和（117.1±9.8）U/L，P＜0.01）；Oridonin干預的d組血清ALT和AST水平分別下降為（303.9±39.5）U/L和（340.6±2.8）U/L，Oridonin干預的e組血清ALT和AST水平分別顯著下降為（130.2±38.3）U/L和（209.8±36.2）U/L（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組血清轉氨酶水平變化比較與正常對照組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.01

2.4 各組小鼠肝組織炎癥因子mRNA水平比較見圖4，提示Oridonin對LPS/D-Gal誘導的小鼠肝組織炎癥因子水平具有顯著的阻抑作用。

圖4 肝組織細胞因子mRNA水平變化與正常對照組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.01

3 討論

LPS/D-Gal誘導的ALF與臨床ALF病理過程相似，是研究ALF的經典動物模型[11-13]，也是篩選ALF治療新藥的重要手段。因此，利用此動物模型，我們探討了Oridonin對ALF小鼠的保護作用及其可能的機制。

我們選擇在LPS/D-Gal刺激前，給予Oridonin預處理[14-18]。結果顯示，給予Oridonin預處理可明顯提高ALF小鼠48 h存活率，表明Oridonin對ALF具有顯著的保護作用。我們進一步研究了LPS/D-Gal處理6 h后模型組小鼠肝組織呈大塊和/或亞大塊壞死伴血清ALT/AST顯著升高，提示小鼠ALF模型構建成功，Oridonin干預組小鼠不僅血清ALT/AST水平明顯降低，而且肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤也顯著減輕，提示Oridonin對LPS/D-Gal誘導的ALF小鼠具有顯著的保護作用。

ALF發病機制與損傷因素誘導的炎性細胞因子過度釋放及其引起的肝組織急性炎癥反應密切相關[12，15，19]。有研究報道，Oridonin可以抑制LPS和β-淀粉樣蛋白刺激的神經小膠質細胞一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6等炎癥因子釋放，同時伴有對NF-κB信號通路的抑制[7，20]，說明Oridonin可能對炎癥相關性疾病具有保護作用。為了探討Oridonin對ALF小鼠的保護機制，我們評估了在ALF發病中起關鍵作用的促炎細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6基因水平變化。研究發現在LPS/D-Gal誘導的ALF小鼠肝組織TNF-α、IL-1α、IL-β和IL-6 mRNA水平顯著上調，Oriodnin預處理則可顯著抑制上述炎癥因子的上調，提示Oriodnin對ALF的保護作用可能與抑制肝臟炎癥反應有關。

我們的研究首次證實Oridonin對ALF具有顯著保護作用，其機制可能與抑制肝臟炎癥反應有關，預示Oridonin在ALF臨床干預方面可能具有潛在的應用價值。

[1]Jedicke N，Struever N，Aggrawal N，et al.Alpha-1-antitrypsin inhibits acute liver failure in mice.Hepatology，2014，59（6）: 2299-2308.

[2]Guicciardi ME，Malhi H，Mott JL，et al.Apoptosis and necrosis in the liver.Compr Physiol，2013，3（2）:977-1010.

[3]Brenner C，Galluzzi L，Kepp O，et al.Decoding cell death signals in liver inflammation.J Hepatol，2013，59（3）:583-594.

[4]Gao SY，Li J，Qu XY，et al.Downregulation of cdk1 and cyclinb1expressioncontributestooridonin-inducedcellcycle arrestatG2/MphaseandgrowthinhibitioninSGC-7901 gastric cancer cells.Asian Pacif J Cancer Prevent，2014，15（15）:6437-6441.

[5]Wong AM，Zhang Y，Kesler K，et al.Genomic and in vivo evidence of synergy of a herbal extract compared to its most activeingredient:rabdosiarubescensvs.oridonin.ExpTher Med，2010，1（6）:1013-1017.

[6]Zhen T，Chen Z，Chen SJ.Targeting of AML1-ETO in t（8;21）leukemia byoridonin generates a tumor suppressor like protein.Cancer Biol Ther，2012，4:127-138.

[7]Wang S，Yang H，Yu L，et al.Oridonin attenuates abeta1-42-induced neuroinflammation and inhibits NF-kB pathway.PLoS One，2014，9（8）:e104745

[8]Lee W M，Squires R H，Jr.，Nyberg S L，et al.Acute liver failure:summaryofaworkshop.Hepatology，2008，47（4）: 1401-1415.

[9]Michael D.Josephs FRB，Fukuzuka K.Lipopolysaccharide and D-galactosamine-inducedhepaticinjuryismediatedby TNF-α and not by Fas ligand.Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2000，278:1196-1201.

[10]SchwabeRF，BrennerDA.MechanismsofLiverInjury.I. TNF-alpha-inducedliverinjury:roleofIKK，JNK，andROS pathways.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290（4）:G583-589.

[11]Luo M，Zhao A，Li J，et al.Acute liver injury attenuation of a novel recombinant sTNFR through blocking hepatic apoptosis. Immunopharmacol Immunotoxicol，2015，37（3）:295-300.

[12]Silverstein R.D-galactosamine lethality model:scope and limitations.J Endotoxin Res，2004，10（3）:147-162.

[13]Tunón M J.An overview of animal models for investigating thepathogenesis andtherapeutic strategies inacutehepatic failure.World J Gastroenterol，2009，15（25）:3086.

[14]Gill RQ，Ark S.Acute liver failure.J Clin Gastroenterol，2001，33（3）:191-198.

[15]Li X，Gou C，Yang H，et al.Echinacoside ameliorates D-galactosamine plus lipopolysaccharide-induced acute liver injury in mice via inhibitionof apoptosis andinflammation.ScandJ Gastroenterol，2014，49（8）:993-1000.

[16]Zhan Y，Wang Z，Yang P，et al.Adenosine 5'-monophosphate ameliorates D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury through an adenosine receptor-independent mechanism in mice.Cell Death Dis，2014，5:e985.

[17]PanCW，ZhouGY，ChenWL，etal.Protectiveeffectof forsythiasideAonlipopolysaccharide/d-galactosamine-induced liver injury.Int Immunopharmacol，2015，26（1）:80-85.

[18]Zhang J，Xu L，Zhang L，et al.Curcumin attenuates D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury and mitochondrial dysfunction in mice.J Nutr，2014，144（8）:1211-1218.

[19]AdamsDH，JuC，RamaiahSK，etal.Mechanismsofimmune-mediated liver injury.Toxicol Sci，2010，115（2）:307-321.

[20]Xu Y，Xue Y，Wang Y，et al.Multiple-modulation effects of oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophicfactorsinLPS-activatedmicroglia.IntImmunopharmacol，2009，9（3）:360-365.

（收稿：2016-10-14）

（本文編輯：陳從新）

Effect of oridonin on hepatic cytokine levels in mice with LPS/D-Gal-induced acute liver failure

Deng Yilin，Yu Heguo，Shi Min，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital Affiliated to Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

ObjectiveTo investigate the effectoforidonin on hepatic cytokinelevelsinmicewith polysaccharide（LPS）/D-galactosamine（D-Gal）-induced acute liver failure.Methods150 mice were randomly divided into five groups（30 in each group），e.g.，normal，oridonin control，model，oridonin-intervened，and oridoninintervened for 12 days.ALF model was established in C57BL/6 mice by intraperitoneal injection of LPS/D-Gal. ResultsThe 48 h lethality rate in LPS/D-Gal-induced group reached an extremely high level of 100%. However，the 48 h survival rates in two oridonin-intervened groups were 64.5%（19/30）and 80.6%（24/30，P<0.01）；The damage in liver tissues was ameliorated in mice pretreatedwith oridonin as compared with that in the model group；Serum ALT and AST levels in model group were（345.3±54.1）U/L and（500.2±53.5）u/L，significantly higher than those in control group[（42.3±0.6）U/L and（117.1±9.8）U/L，P<0.01]or in oridonin-treated group[（303.9± 39.5）U/L and（340.6±2.8）U/L or[（130.2±38.3）U/L and（209.8±36.2）U/L，P<0.05]；Administration of oridonin in mice with LPS/D-Gal-induced ALF significantly decreased mRNA levels of hepatic TNF-α，IL-1α，IL-1β and IL-6 compared with in model group（P<0.01）.ConclusionOridonin has a protective effect on mice with LPS/DGal-induced ALF，and the mechanism might be related to inhibition of hepatic cytokine activities.

Acute liver failure；Lipopolysaccharide；D-galactosamine；Oridonin；Cytokines；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.010

國家自然科學基金資助項目（編號：81400631/81570549）

200092上海市上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科（鄧怡林，石翠翠，范建高，李光明）；同仁醫院消化內科（施敏）；上海市計劃生育科學研究所（于合國，刁華）

鄧怡林，女，25，碩士研究生。主要從事肝損傷及肝纖維化的防治研究。E-mail:yilindeng1991@163.com

李光明，E-mail:ligm68@126.com