孫金鵬,田濤,陳玲,劉燕春,孔繼昌
(1滄州中西醫結合醫院,河北滄州061000;2華北石油管理局總醫院;3滄州市醫學高等??茖W校)
非小細胞肺癌組織中Slitrk5的表達及意義
孫金鵬1,田濤2,陳玲3,劉燕春2,孔繼昌2
(1滄州中西醫結合醫院,河北滄州061000;2華北石油管理局總醫院;3滄州市醫學高等??茖W校)
目的 觀察非小細胞肺癌(NSCLC)組織中Slitrk5的表達情況,探討其與患者臨床病理特征的關系。方法 收集69例NSCLC患者手術切除的癌組織及癌旁組織,采用qRT-PCR法檢測Slitrk5 mRNA表達,免疫組化染色法觀察Slitrk5蛋白表達情況,Western blot法檢測Slitrk5蛋白表達量,并分析Slitrk5蛋白高表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系。結果 癌組織中Slitrk5 mRNA及蛋白表達均顯著高于癌旁組織(P均<0.05)。Slitrk5蛋白高表達在NSCLC患者不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結轉移間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 Slitrk5在NSCLC肺癌組織中高表達,可能與NSCLC的發生相關。
非小細胞肺癌;神經跨膜蛋白;Slitrk5;腫瘤分化程度
Slitrk蛋白家族是一類調節神經細胞突起生長的因子,能夠控制軸突生長、調節神經元生長發育,在神經元細胞中過表達時,會導致軸突生長受到抑制。近年研究發現,Slitrk蛋白家族與腫瘤的發生發展有關。Slitrk3和Slitrk4在腦腫瘤中高度表達,尤其是在惡性程度高的腫瘤中,Slitrk4高表達更為明顯[1];Slitrk3在淋巴瘤組織中表達上調[2],在胃腸道間質瘤中的表達上調,且與胃腸道間質瘤的分級和預后相關[3];Slitrk6在膀胱癌、肺原發癌和轉移性癌、乳腺癌和膠質母細胞瘤中呈陽性表達[4],可作為晚期胃腸腫瘤一個潛在的治療靶點[5],同時也是尿路上皮癌生物標志物ASG-15ME的靶基因[6]。然而有關Slitrk5在實體瘤中作用的研究較少。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型,患者一經確診多為晚期,預后極差[7]。分子靶向治療對NSCLC的診療具有重要意義。本研究觀察了Slitrk5在NSCLC組織中的表達,并探討其與NSCLC臨床病理特征的關系,旨在為NSCLC的分子靶向治療提供依據。
1.1 臨床資料 選取2013年1月~2016年1月滄州中西醫結合醫院住院手術的69例NSCLC患者,男45例、女24例,年齡35~81歲、中位年齡60歲。均經術后病理檢查確診,術前未進行化放療。根據2004版WHO肺腫瘤分類標準,鱗癌30例、腺癌30例、腺鱗癌6例、大細胞肺癌3例;伴周圍淋巴結轉移52例,無周圍淋巴結轉移17例;TNM分期Ⅰ期7例,Ⅱ~Ⅲ期62例。取手術切除的癌組織和相應的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥2 cm),4%甲醛中性緩沖液固定,常規石蠟包埋,4 μm連續切片。
1.2 Slitrk5 mRNA檢測 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。取組織標本,用TRIzol試劑提取總RNA,反轉錄合成cDNA。以各組cDNA為模板,進行qRT-PCR反應。Slitrk5上游引物:5′-TATTTACACACCACCCCGGC-3′,下游引物:5′-TGGGACACTCCAAAGGCAC-3′;內參GAPDH上游引物:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′,下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反應體系:模板2 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 7 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸30 s,72 ℃后延伸7 min,共40個循環。使用2-ΔΔCt分析法進行數據分析。以目的基因與內參基因表達比值表示目的基因表達量,實驗重復3次。
1.3 Slitrk5蛋白定性檢測 石蠟標本60 ℃烘烤2 h,采用EnVision二步法進行免疫組化染色。雙氧水阻斷內源性過氧化物酶,加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中,90 ℃微波抗原修復8 min;5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h;Slitrk5鼠抗人一抗(1∶200)室溫孵育1 h后4 ℃過夜;聚合物增強劑室溫孵育20 min,酶標抗鼠聚合物室溫孵育25 min,常規DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照,已知陽性片作陽性對照。以細胞膜呈棕色染色為陽性細胞。在光學顯微鏡×400視野下,每個樣本選取5個視野,觀察陽性細胞所占比例,無陽性細胞計0分,1%~10%計1分,11%~50%計2分,51%~80%計3分,>80%計4分。以≥3分為高表達,<3分為低表達。
1.4 Slitrk5蛋白定量檢測 采用Western blot法。取新鮮冰凍肺癌組織和癌旁組織,用RIPA裂解液提取蛋白,BCA法測定濃度,取50 μg蛋白進行電泳,SDS-PAGE電泳后電轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗鼠抗人Slitrk5抗體/鼠抗人β-Tubulin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,加二抗HRP標記的抗兔IgG抗體(1∶5 000)孵育1 h,ECL化學發光法顯色。采用Image J分析圖像,以Slitrk5/β-Tubulin灰度比值表示Slitrk5蛋白的相對表達量。
2.1 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達比較 Slitrk5 mRNA在癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為5.32±0.57、1.26±0.37,二者比較P<0.05。其中55例(79.7%)癌組織中Slitrk5 mRNA表達高于癌旁組織。
2.2 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達情況比較 Slitrk5蛋白在癌組織中的高表達率為72.5%(50/69),在癌旁組織中的高表達率為15.9%(11/69),二者比較P<0.05。
2.3 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達量比較 Slitrk5蛋白在癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為0.768 3±0.265 0、0.218 9±0.072 2,二者比較P<0.05。
2.4 Slitrk5蛋白高表達與患者臨床病理參數的關系 Slitrk5蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型及有無淋巴結轉移均無關(P均>0.05)。見表1。
Slitrk蛋白家族在氨基酸鏈末端的跨膜結構域有2個富含亮氨酸的重復序列結構,并與軸突導向因子Slit高度同源,其C末端結構與神經營養受體原肌球蛋白受體激酶(Trk)具有高度同源性[8,9],Slitrk蛋白可以介導類似于Trk受體的一些生物功能,如神經突向外生長和樹突細化,突出形成和神經元存活[10,11]。人類Slitrk5蛋白是一種Ⅰ型跨膜蛋白,包含958個氨基酸,定位于中樞神經系統突觸,介導突觸的形成[12,13]。Slitrk5主要在神經組織表達,具有調節神經突活動的作用。前人對Slitrk5的研究主要集中在精神疾病領域[14]。新近研究發現,Slitrk5作為TrkB信號共受體,可以通過調控TrkB的內吞后回收,從而促進腦源性神經營養因子(BDNF)依賴的信號轉導[15]。BDNF/TrkB信號轉導途徑及其下游信號通路(PI3K/Akt、MAPK和PLC)與腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移密切相關[16]。Slitrk5的同源蛋白Slitrk3、Slitrk5、Slitrk6均已證明在腫瘤組織中表達異常,與腫瘤的發生發展相關,但目前尚無有關Slitrk5在實體瘤中表達情況的報道。
表1 Slitrk5蛋白高表達與患者臨床病理特征的關系(例)
本研究顯示,Slitrk5蛋白在NSCLC組織中的高表達率為72.5%,顯著高于癌旁組織;qRT-PCR、免疫組化染色及Western blot檢測發現,Slitrk5在癌組織中的mRNA及蛋白表達均高于癌旁組織,但Slitrk5蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、病理分型、淋巴結是否轉移無關。表明Slitrk5在NSCLC組織中表達升高,Slitrk5蛋白高表達可能與NSCLC的發生相關,但與NSCLC的發展及轉移無明顯相關。這種不相關性可能與基礎細胞的增殖、存活能力相關,但還需要進一步的研究來驗證。除此之外,Slitrk5蛋白在NSCLC惡性過程的分子機制和功能還尚不清楚,還需要深入研究。
綜上所述,NSCLC組織中Slitrk5高表達,可能與NSCLC的發生有關,Slitrk5可作為NSCLC的分子靶向治療的相關靶點,在NSCLC基因治療中具有一定的臨床應用前景。
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2016-06-28)