食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達及其與預后的相關性

劉博，呂洋，劉軍超，李坤，李秀娟，喬海霞

(1河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000；2河北北方學院)

食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達及其與預后的相關性

劉博1，呂洋1，劉軍超1，李坤1，李秀娟2，喬海霞2

(1河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000；2河北北方學院)

目的 探討ASPP2、p53、E-cad在食管鱗癌組織中的表達，分析其與預后的相關性。方法 采用免疫組化SP法檢測136例食管鱗癌及37例正常食管黏膜組織中ASPP2、p53、E-cad的陽性表達情況，分析其與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系，采用單因素Kaplan-Meier法及Cox多因素比例風險模型分析ASPP2、p53、E-cad的表達與患者術后生存的關系。結果 ASPP2、p53、E-cad在食管鱗癌組織中的陽性率分別為49.3%、89.7%、46.3%，在正常食管黏膜組織中的陽性率分別為94.6%、21.6%、78.4%(P均<0.05)。ASPP2、p53、E-cad的異常表達均與食管鱗癌的淋巴結轉移情況有關，ASPP2、E-cad的異常表達與腫瘤的組織學分級和TNM分期有關，E-cad的異常表達與腫瘤浸潤深度有關(P<0.05或<0.01)。食管鱗癌組織中，ASPP2與p53呈負相關，ASPP2與E-cad呈正相關，p53與E-cad呈負相關(r分別為-0.295、0.620、-0.169，P均<0.05)。ASPP2、E-cad是影響食管鱗癌術后生存的獨立因素。結論 ASPP2、p53、E-cad異常表達在食管鱗癌的淋巴結轉移中可能起協同作用，且ASPP2、E-cad與食管鱗癌的預后密切相關，聯合檢測ASPP2、p53、E-cad有助于判斷食管鱗癌患者的預后。

食管鱗狀細胞癌；p53凋亡刺激蛋白；p53；上皮型鈣黏蛋白；免疫組織化學；預后

食管癌是常見的上消化道惡性腫瘤。食管鱗癌是食管癌最常見的組織學類型[1]。p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族[2，3]是近年新發現的一個與腫瘤相關的基因家族，由ASPP1、ASPP2和ASPP家族抑制成員(iASPP)共同組成。其中ASPP2是迄今為止發現的ASPP家族中結構最完整的蛋白質[4]。ASPP2與p53關系密切，二者結合能夠特異性增強凋亡基因的表達[5]。上皮型鈣黏蛋白(E-cad)是一種Ca2+依賴性跨膜蛋白，具有調節細胞與細胞及細胞外基質之間的黏附性，繼而保持組織結構完整性的作用。E-cad亦是腫瘤轉移的抑制因素[6]。本研究通過檢測食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad蛋白的表達變化，分析其與患者臨床病理特征的關系及與預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學院附屬第一醫院2008年1月～2009年12月行手術切除的原發性食管鱗癌患者136例，男91例、女45例，年齡27～80歲、中位年齡61歲?；颊咝g前均未接受放化療，具有完整的臨床病理及隨訪資料。取手術切除的癌組織136例作為觀察組，距癌組織>5 cm的正常食管黏膜組織37例作為對照組。

1.2 ASPP2、p53、E-cad蛋白檢測 采用SP免疫組化染色法。取癌組織和正常食管黏膜組織，4 μm厚連續切片，脫蠟，H2O2封閉，高壓抗原熱修復。滴加一抗(ASPP2、p53、E-cad的抗體稀釋比例均為1∶100)，4 ℃孵育24 h后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 染色結果判斷 ASPP2蛋白定位于細胞質和(或)細胞核，p53蛋白定位于細胞核，E-cad蛋白定位于細胞膜，以出現均勻一致的棕黃色為細胞染色陽性。隨機選取5個高倍視野，計數陽性細胞占細胞總數的百分比，<10%計0分，10%～<50%計1分，50%～<75%計2分，≥75%計3分；細胞著色強度無色計0分，灰黃色計1分，金黃色計2分，棕黃色計3分。將陽性細胞百分比評分與著色強度評分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關，生存分析采用Kaplan-Meier法，預后因素分析采用Cox成比例危險率模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌與正常食管黏膜組織中ASPP2、p53、E-cad蛋白表達情況比較 食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad的陽性率分別為49.3%(67/136)、89.7%(122/136)、46.3%(63/136)，正常食管黏膜組織中的陽性率分別為94.6%(35/37)、21.6%(8/37)、78.4%(29/37)，三者在食管鱗癌與正常食管黏膜組織中的表達比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.2 ASPP2、p53、E-cad表達與臨床病理特征的關系 ASPP2、p53、E-cad的異常表達均與食管鱗癌的淋巴結轉移情況相關(P均<0.05)，ASPP2、E-cad的異常表達與腫瘤的組織學分級和TNM分期相關(P均<0.05)，E-cad異常表達還與食管鱗癌的浸潤深度相關(P=0.001)。見表1。

表1 ASPP2、p53、E-cad的異常表達與食管癌患者臨床病理特征的關系(例)

2.3 食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達的關系 ASPP2與p53、p53與E-cad在食管鱗癌組織中的表達均呈負相關(r分別為-0.295、-0.169，P均<0.05)，ASPP2與E-cad呈正相關(r=0.620，P<0.05)。

2.4 ASPP2、p53、E-cad表達與食管鱗癌患者預后的關系 以死亡時間及死亡結局為應變量，各因子表達為自變量，單因素Kaplan-Meier法及Cox多因素比例風險模型分析ASPP2、p53及E-cad的表達對患者生存的影響，結果顯示，ASPP2和E-cad是影響食管鱗癌術后生存的獨立因素(P均<0.05)。見表2。

表2 Cox多因素回歸分析ASPP2、p53、E-cad表達與患者死亡的關系

3 討論

侵襲和轉移是腫瘤細胞、腫瘤微環境及宿主之間一系列多步驟、多因素相互作用的過程，是導致惡性腫瘤高病死率的主要原因。研究表明，腫瘤轉移相關基因包括腫瘤轉移促進基因(癌基因)和腫瘤轉移抑制基因(抑癌基因)。癌基因的激活和抑癌基因的失活決定著腫瘤細胞的轉移潛能。作為一種抑癌基因，ASPP2過表達可促進多種腫瘤細胞的凋亡并抑制其侵襲。茅慧[7]采用RT-PCR法檢測10株食管癌細胞系和1株食管正常上皮永生化細胞系中ASPP2 mRNA的表達，結果顯示，干擾ASPP2基因的表達可增強食管癌細胞的體外增殖能力。卜芳芳[8]采用免疫組化、qRT-PCR及Western blot方法檢測ASPP2在食管癌中的表達，發現其在食管癌原發瘤、淋巴結轉移灶以及食管癌細胞系中的表達均顯著下降，且其低表達與食管癌的轉移及預后不良相關。本研究結果顯示，ASPP2在食管鱗癌中的表達顯著低于正常食管黏膜，且其異常表達與食管鱗癌的組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移情況有關；生存分析結果顯示，ASPP2是影響食管鱗癌預后的獨立因素，與以往文獻報道一致。

p53可分為野生型和突變型兩種。野生型p53具有負調節細胞生長的能力，它可以檢測到細胞基因組的完整性，修復損傷的DNA，清除有癌變傾向的細胞，抑制腫瘤生長。ASPP2能夠與野生型p53結合，產生較強的抑癌作用[9]。本研究顯示，ASPP2與p53在食管鱗癌組織中的表達呈負相關，表明ASPP2能夠通過p53通路誘發腫瘤細胞凋亡增加，從而達到抑制腫瘤的作用[10]。

在腫瘤的浸潤、轉移中，腫瘤細胞通常從原發部位脫落，穿透基底膜及細胞外基質，再逐步浸潤至淋巴或血管中。因此細胞間連接結構的破壞是腫瘤轉移的關鍵步驟之一。E-cad是廣泛存在于上皮細胞中的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，能夠介導細胞間以及細胞與細胞外基質間的黏附反應，從而保持組織結構完整性。E-cad表達缺失將降低同種細胞間的黏附力，從而促進癌細胞侵襲、去分化和轉移[11]。本研究顯示，E-cad在食管鱗癌組織中的表達顯著低于正常食管黏膜，且其異常表達與食管鱗癌的組織學分級、TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移情況有關；生存分析顯示，E-cad是影響食管鱗癌患者預后的獨立因素，這與Chai等[12]及Uchikado等[13]的報道相符。相關分析顯示，ASPP2與E-cad在食管鱗癌組織中的表達呈正相關。卜芳芳[8]報道，下調內源性ASPP2表達后，E-cad mRNA及蛋白表達水平下降。本研究結果與其相符。

綜上所述，ASPP2、p53與E-cad的異常表達在食管鱗癌的淋巴結轉移過程中可能起協同作用，且ASPP2及E-cad表達與食管鱗癌患者的預后密切相關，聯合檢測ASPP2、p53與E-cad的表達有助于判斷患者預后。

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[13] Uchikado Y, Natsugoe S, Okumura H, et al. Slug expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(3):1174-1180.

河北省科技廳計劃項目(15277707D);河北省衛生廳科學技術指導項目(ZD20140220)。

呂洋(E-mail: yyang2bb@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.028

R735.1

B

1002-266X(2017)06-0080-03

2016-08-18)