中國沿海鯻科魚類DNA條形碼研究及新記錄種三線鯻分類地位探討

陳 璐，黃伯炎，薛 丹，呂金磊，楊喜書，章 群

(暨南大學生態系，熱帶亞熱帶水生態工程教育部工程研究中心，廣州 510632)

中國沿海鯻科魚類DNA條形碼研究及新記錄種三線鯻分類地位探討

陳 璐，黃伯炎，薛 丹，呂金磊，楊喜書，章 群

(暨南大學生態系，熱帶亞熱帶水生態工程教育部工程研究中心，廣州 510632)

鯻科魚類是廣泛分布于印度-西太平洋常見經濟魚類，由于不同物種間外部形態較為相似，且種內有一定變化，物種鑒定存在一定困難。為明確中國鯻科魚類的分類地位，對中國鯻科魚類進行了詳細的形態計測，并測定了3屬共62 ind魚類COI基因5’端652 bpCOI序列，結合GenBank中三線鯻3個地點9條序列，發現我國除已報道的3屬4種鯻科外，新發現目前僅見于廣東的三線鯻，是中國鯻科魚類的新紀錄。在基于Kimura-2-paramter 的鄰接樹上，5種鯻科魚類均獨立成支。種間遺傳距離18.34%(15.9%～20.1%)約為種內遺傳距離0.72%(0.1%～2.7%)的24.93倍，形成較為明顯的條碼間隙。三線鯻可按地理來源分為西太平洋和印度洋-地中海2個譜系，具有明顯的譜系結構和地理結構；譜系間遺傳距離為5%(0.2%～5.6%)為譜系內遺傳距離0.85%[譜系A為0.6%(0～1.7%)，譜系B為1.1%(0.2%～5.6%)]的5.88倍, 譜系間與譜系內遺傳距離倍數略低于大多數物種(種間是種內遺傳距離10倍)，但遠高于其種內遺傳距離一般小于2%的范圍。同時,鯻科內種間在形態上存在諸如側面體型細長扁平或肥厚、臀鰭是否帶隱約散點斑紋、背鰭硬棘的Ⅲ-VI或Ⅶ-Ⅷ間是否有黑色斑點、頭部至背鰭前端略帶藍灰或黃綠光澤、身體背部淺灰或淺棕色等區別。分子和形態差異表明，印度-西太平洋分布的三線鯻可能是2個亞種乃至2個種。由于本文分析的三線鯻的數量和地理范圍有限，其準確的分類地位仍需要更多的形態計測和核基因數據等研究加以確定。

三線鯻； DNA條形碼； 形態分類

鯻科(Terapontidae)魚類隸屬鱸形目(Perciformes)，主要分布在東自薩摩亞、南至澳洲的印度-太平洋水域，西至紅海，北至日本南部，在中國分布于東海和南海。鯻科魚類是海洋生態系統的重要組成部分，也是頗受漁民喜愛的經濟魚類[1-2]。據NELSON[3]報道，全世界鯻科魚類共有16屬52種；根據現有資料記載，中國僅有細鱗鯻(Teraponjarbua)、鯻 (Terapontheraps)、尖吻鯻(Rhynchopelatesoxyrhynchus)及列牙鯻(Pelatesquadrilineatus) 3屬4種，本文在研究中國鯻科魚類時，發現目前僅見于廣東的三線鯻(Teraponputa)，是中國的新紀錄。近年來隨著海洋環境污染和過度捕撈的日益加劇，海洋魚類資源急劇衰退[4-5]，許多魚類已因過度開發而種質資源瀕臨枯竭乃至滅絕[6]，中國鯻科魚類資源已出現衰退，鯻和細鱗鯻產量大不如從前[4-5, 7]，尖吻鯻在中國南海屬少有，三線鯻數量更為稀少。

準確的物種鑒定是深入開展種質資源保護與開發利用的基礎。傳統的形態分類因直觀快速而一直作為物種分類法的主流，但單純依賴外部形態，可能會因為一些物種在不同發育時期和不同的環境下出現的表型可塑性，而忽視物種在進化過程中因個體差異的積累而逐漸演變為潛在亞種乃至新種的可能性，導致錯誤的鑒定。因此有必要在傳統形態鑒定的基礎上尋求更為客觀的方法。2003年HEBERT等[2]提出DNA條形碼的概念，即通過一段易于擴增測序的標準基因序列進行物種鑒定。線粒體DNA具有進化速率快、幾乎不重組的特點，其中細胞色素 C 氧化酶亞基Ⅰ(COI)基因5’端長652 bp左右的序列變異水平合適，種間最小遺傳距離明顯大于相應的種內最大遺傳距離，可以用于鑒定大部分動物物種。2005年WARD等[8]發現澳洲207種魚COI基因序列的種間種內遺傳差異顯著，可用作DNA條形碼鑒定大部分魚類物種；近年基于COI基因序列分析的研究發現了大量的隱存種或新種[9-11]。

鯻科魚類鰭棘、體側條紋及鰭條等外部形態較為相似，背鰭肛門附近的射線、黑色縱紋的條數和顏色深淺及斷續程度因個體發育多有變異，導致部分種類的體側條紋的位置和數量既有一定的過渡性，又有一定的種間差異，如三線鯻與鯻的軀體節點距離、背鰭及尾鰭斑紋位置、橫紋或腹部的顏色等相近，與細鱗鯻、尖吻鯻及列牙鯻則均在背鰭起點前下方有明顯大黑斑，導致準確的物種分類存在一定困難[1, 12]。國外關于三線鯻的研究主要集中在食性及其營養層級和重金屬富集化等方面[13-15]。由于三線鯻是廣泛分布于印度-西太平洋、南印度洋和印澳群島等地的兩側洄游型魚類，不同地理群體的外部形態存在一定差異，特別是在鰭棘、體側條紋及鰭條等特征上變化較大，背鰭鰭膜的比例和彎曲度不一，體長與體高比變化較大(約為2.4～3.6倍)，背部顏色深淺不定，體側上縱紋條數、粗細及斷續不定，背鰭硬棘上黑斑范圍、背鰭前端藍灰光澤深淺不一；腹部乳白色或灰白程度不同。雖然這些差異多被認為是個體間的差異，但并無客觀的比較。為此本文測定了中國鯻科5種魚類DNA條碼區序列，結合GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和BOLD(http://www.barcodinglife.org)數據庫中菲律賓、印度、以色列的三線鯻序列，共分析了5種71條序列；再結合形態計測，對比Fishbase(http://www.fishbase.org/)上已有的形態數據，以期明確中國鯻科特別是三線鯻2個分支的分類地位，為種質資源保護利用和海洋生態研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料來源

本研究中，中國鯻科魚類標本于2004年8月6日～2015年8月6日采集于福建平潭、福清，廣東碣石、大亞灣、陽江、硇州島、湛江、烏石，廣西東興，通過Fishbase、VARI[1]、《中國魚類系統檢索》[16]、《臺灣魚類檢索》[17]等綜合比較確定種名后，將標本放入95%乙醇中，保存于暨南大學生態系標本室。本研究所使用的鯻科魚類經測定最終確認共有3屬5種62 ind，其中三線鯻12 ind，目前僅見于湛江市烏石鎮附近海域(表1)。

1.2 形態測量方法

參照BEDDOW等[18]方法計數側線鱗、側線上鱗、背鰭前鱗、側線下鱗、圍尾柄鱗、背鰭條、胸鰭、腹鰭條和臀鰭條；測量體長、體高、頭長、頭高、吻長、眼徑、尾柄長、尾柄高、背鰭長、胸鰭長、腹鰭長、臀鰭基長、臀鰭長、眼間距等14個常規性狀；通過9個解剖學坐標點：A吻端、B頭背部末端、C胸鰭起點、D背鰭起點、E背鰭基部末端、F腹鰭起點、G臀鰭起點、H尾鰭背部起點、I尾鰭腹部起點構建框架結構，測量AB，AC， BC，BD，BF， CD，CF，DF，DE，DG， EF，FG，EG，EH，EI， GH，GI，HI等18個框架結構測量性狀間距離，精確到0.1 mm(圖1)；通過SPSS軟件對32個度量特征進行主成分分析、判別分析和聚類分析。摘錄魚體外觀互相共有或特有的11個外表特征，作分類數據錄入3D Chart Mobile Pro(http://www.advance-media.com)，輸出形態特征雷達圖。

1.3 DNA提取及PCR擴增

取背部肌肉約100 mg,晾干后用酚/氯仿法[19]提取總DNA，使用本實驗室自行設計引物COIF: 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGGCAATYACDCGCTGAT-3’；COIR: 5’-CAGGAAACAGCTATGACNACYTCNGGRTGNCCRAAGAA-3’擴增線粒體COI基因5’端目標片斷。PCR反應體系和反應時間參照薛丹等[20]的方法，將經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的擴增產物送往華大基因切膠純化，經ABI-3730自動測序儀測序。

表1 樣品相關信息Tab.1 Source of isolates and sequence of 72 individuals used in this study.

圖1 鯻科魚類的框架結構圖[16] [參照T. theraps(Cuvier et Valenciennes)]Fig.1 Morphometrics measurement of Terapontidae [sensu T. theraps (Cuvier et Valenciennes) ]

1.4 數據分析方法

結合GenBank、BOLD下載的三線鯻序列，利用MEGA 6.0軟件進行人工校對和序列比對，計算堿基組成、轉換與顛換、簡約位點及變異位點，以Kimura 2-parameter(K2P)模型計算種內和種間遺傳距離，構建鄰接(Neighbor-Joining)樹，經1 000次重復抽樣(Bootstraps)檢測置信度。將序列數據上傳到ABGD網站(http://wwwabi.snv.jussieu.fr/public /abgd /abgdweb. html)，使用默認設置值進行ABGD法(automatic barcode gap discovery)[21]分類。

2 結果與分析

2.1 中國三線鯻的形態特征

本文所獲的三線鯻形態特征如下(圖2)：頭背平直，側面體型呈細長梭形，體長與體高比約為3.2～3.6；唇部略鈍，吻長等于眼徑；吻微凸不帶肉質；牙尖錐型，兩頜牙多行，外行牙多為擴大；尾鰭略分叉。背鰭Ⅺ-10，背鰭硬棘部與軟條部完全分離；胸鰭Ⅲ-10，腹鰭I-5，臀鰭III(8 - 9)；體被細櫛鱗，側線完全，側線上鱗70 - 85。液浸標本背部黑褐色，從眼上方至背鰭硬棘部下方的背部略帶灰藍光澤；體側有3～4條細長黑色水平縱紋，第3條由眼前方起穿過魚體腹部中央延續至尾柄側面中央，與尾鰭中央帶重疊，但第4條起始于吻部，在腹部斷續隱約延至尾鰭。背鰭硬棘III -VI上有黑斑，軟鰭部有豎紋黑帶2～3條；臀鰭肛門附近具黑帶；尾鰭上下葉有5條黑色縱紋，著色深淺不定，各鰭底色淡黃。

圖2 采集于中國廣東省烏石的三線鯻Fig.2 T．Puta collected from Wushi, Guangdong Province, China

2.2 鯻科形態測量多元分析

5種魚類計數特征詳見表 2。從11項主要形態特征雷達圖上看(圖3)，三線鯻與鯻最為相像，僅前者體被櫛鱗、而后者體被粗櫛鱗有所不同。三線鯻與尖吻鯻共有5項相似特征，而與列牙鯻則僅有3項特征一致。在主成分散點圖(圖4)上，第一主成分(軀體節點距離特征)三線鯻除了與細鱗鯻重疊較多之外，與其余種類區分較好；第二主成分(頭部特征)三線鯻與另外幾種沒

圖3 基于形態特征構建的鯻科群體雷達圖Fig.3 Radar chart based on the morphological features of Terapontid species

表2 鯻科5種間的分節特征比較Tab.2 Comparative summaries of meristic characters of populations in Teraponidae

注：框架內的數值為平均值

Note：Data in brackets are mean values

有明顯區分，說明三線鯻與鯻科其余魚類的最大區別是軀體節點距離特征。在判別函數圖(圖4)中，三線鯻、尖吻鯻100%被判別正確；列牙鯻的判別率達99%；鯻的判別率為93.5%，細鱗鯻判別率最低(89.5%)。因此，綜合原始判別的正確率為95.7%。鯻與細鱗鯻在主成分分析、判別散點圖中區域重疊嚴重，5種魚類在軀體分節特征、頭部特征上差異參差不齊，較難用單一計測特征來完全區分不同物種。

在5種魚類的32個可量性狀平均值(圖5)聚類圖上，鯻、細鱗鯻與尖吻鯻3者先聚類，說明在度量特征上最為相似；再與三線鯻聚類，說明三線鯻與上述3種鯻科魚類的度量特征存在一定的差異；列牙鯻最后聚類加入，與鯻科其余4種最不相似。表明雖然三線鯻與鯻科其余魚類在形態測量的多元分析下出現不同程度上的重疊，但仍可憑自己的特征被分出。

2.3 分子實驗結果

2.3.1COI基因序列

在71條COI基因652 bp序列中, 沒有插入和缺失,多態位點195個，簡約信息位點190個；平均堿基組成為 T: 28.9%、C: 29.5%、A: 22.8%、G: 18.9%。A+T含量(51.7%)高于C+G含量(48.4%)，呈現出明顯的堿基組成偏向性，與WARD等[8]的硬骨魚研究一致，顛換比(R)為2.64，表明COI基因序列的突變未達到飽和，適合系統發育分析[22]。

2.3.2 分子鑒定

在鄰接樹上(圖5，右圖)，5種魚類均獨立成支，種間遺傳距離18.34%(15.9%～20.1%)約為種內遺傳距離0.72%(0.1%～2.7%)的 24.93倍。三線鯻進一步分為2個Clade，Clade間的遺傳距離5%是Clade內平均遺傳距離(0.85%)的5.88倍；排除三線鯻后，種間平均遺傳距離為17.7%(16.1%～20.1%)為種內平均遺傳距離0.23%(0.1%～0.5%)的77.09倍，表明存在明顯的條碼間隙[23-24]。詳見表3。在通過ABGD軟件的遞歸分析(圖6)中，所有≤1.29%的先驗距離(將鯻科數據分為了≥7個假設種)不僅小于一般種內距離(2%)，且與本文所得的形態和分子結果不符。但當2.15%為先驗遺傳距離時, 鯻科數據被分成了5個假設種，與上述形態學與分子結果分析相對應，因此該假設比圖中其余假設更為可信。

圖4 主成分得分散點分布圖(左)和鯻科內可量性狀的判別函數得分(右)Fig.4 Scatter plot of component factor score(left)and discriminant scores(right) of measurement parameters among Terapontidae

圖5 基于形態量度的聚類圖(左)和COI序列K2P模型的鯻科NJ樹(右)Fig.5 Dendrogram(left) and K2P-based NJ tree(right) of Terapontid species constructed by metrical characteristics and COI sequences respectively

表3 基于K2P模型的種間(對角線下)和種內(對角線)遺傳距離Tab.3 Inter-specific(blow diagonal) versus intra-specific(diagonal) K2P genetic distances from individual species of the Teraponidae

圖6 鯻科魚類ABGD分析Fig.6 Automatic barcode gap discovery(ABGD) analyses for Terapontidae

3 討論

3.1 DNA條形碼研究輔助形態鑒定

在11項形態特征雷達圖中，三線鯻與鯻僅前者被細櫛鱗、而后者體被粗櫛鱗不同；在可量特征聚類樹上，三線鯻則與鯻-細鱗鯻-尖吻鯻3種聚成的一支距離較遠；在主成分分析散點圖上，三線鯻軀體節點距離特征與細鱗鯻重疊較多；表明鯻科種間可數和可量性狀部分存在多方面的不同程度重疊，特別是三線鯻與細鱗鯻在主成分分析散點圖、判別函數散點圖上的可量性狀比例重疊，三線鯻與鯻在形態特征雷達圖上的相似，容易模糊種間關系，造成形態鑒定的誤判。由于三線鯻在之前的國內檢索文獻內并沒有被記錄，且本實驗室所獲數量亦少，我們在最初分類時就曾將其誤判為鯻。本研究的分子序列分析結果顯示中國三線鯻與其它地區的三線鯻在鄰接樹上聚類成一支(bootstrap支持率100%)，與鯻科其它魚類差異顯著，筆者仔細比對VARI等[1]的分類檢索，并對鯻科魚類進行了詳細的形態測量后，發現形態描述與VARI等[1]描述較為一致，可見形態鑒定仍具有其實用性；同時說明DNA條形碼對形態學鑒定有輔助作用，能校正或確定傳統形態學結果，并闡釋近緣物種間的親緣關系。

3.2 中國三線鯻的分類地位

COI基因序列分析表明，鯻科5種魚類各自獨立成支，平均種間遺傳距離(18.34%)是種內遺傳距離(0.72%)的24.93倍；排除三線鯻后，種間平均遺傳距離為17.73%(范圍在16.1%～20.1%)，種內平均遺傳距離為0.23%(范圍在0.1%～0.5%)，種間可達種內的77.09倍；滿足HERBERT等[23]提出的“10×規則”，確定了鯻科內各物種的有效性。值得注意的是，在鄰接樹上三線鯻分為中國-菲律賓、印度-以色列等2個分支，分支間遺傳距離高達5%(1.4%～5.3%)，是分支內遺傳距離0.85%(0.6%～1.1%)的5.88倍。據HERBERT等[25]對13 320個物種的COI基因分析中的總結，多數物種種內遺傳距離小于1%，少有大于2%；但三線鯻的種內遺傳距離為2.7%(0～5.6%)?？梢娙€鯻分支間與分支內的遺傳距離倍數小于HERBERT等[25]提出的“10×規則”，但三線鯻種內遺傳距離大于指出的一般物種的種內遺傳距離；推測2個分支的分類地位如下：

1)可能是同一種的不同亞種。首先，2個分支分別局限于西太平洋、印度洋-地中海域，這種異域分布(allopatric distribution)模式在沙重牙鯛(Diplodussargussargus)[26]、虹鱒(Onchorynchusmykiss)[27]中也有報道。印度洋與西太平洋之間存在的安曼達海和馬六甲海峽在晚更新世內冰期-間冰期的海平面反復升降，可能導致棲息海域的片段化，成為不同地域間基因交流的地理隔離[28]。2個海域的三線鯻群體間形態差異已有一定程度的表現，如側面體型細長扁平或肥厚；臀鰭是否有隱約散點斑紋；尾鰭邊緣有凹緣或平截；背鰭硬棘部與軟條部連續或分開；背鰭硬棘的III -VI或Ⅶ-Ⅷ間帶黑色斑點；頭部至背鰭前端略帶藍灰或黃綠光澤；身體背部淺灰或淺棕色。印度-西太平洋分布的多鱗鱚(Sillagosihama)[29]、南洋銀漢魚(Atherinomoruslacunosus)[30-31]及花斑蛇鯔(Sauridaundosquamis)[32]等外部形態上也出現相似程度的差異。由于隔離時間短，三線鯻不同海域間的分子差異[5%(1.4% ～5.3%)]不足以達到“10×規則”；且由于mtDNA屬母系遺傳，可能核基因仍未完成譜系揀選，冰期結束后仍可進行基因交流。本文三線鯻2個分支與斑帶蝴蝶魚(Chaetodonpunctatofasciatus)的復合種情況類似，平均種間差異只有1.62%(范圍在0.78%～2.5%)[33]。這從分子和形態的層次都顯示了存在兩海域間的三線鯻個體差異可能已達亞種水平。

2)三線鯻的2個分支可能為近期分化的物種。寧平[34]發現日本金線魚印度沿海組群和中國南海組群間的遺傳距離為3.12%(>2%)，認為有隱存種的存在；在沙丁魚[9]、金槍魚屬[35]、石斑魚屬[36]中COI基因序列不僅種間差異低(如石斑魚屬在COI上的平均種間差異低至3.4%)，且種內差異也非常小，但屬內的每個種仍會聚類為一個獨立分開的集合。這類種內種間較小的遺傳差異一般被認為是同屬內物種的特征而非同種內的種群分化[24]。這種在鄰接樹上按種獨立分開且伴有較小的遺傳距離的現象與本文結果類似。三線鯻分支間的遺傳距離(5%)是分支內的平均遺傳距離(0.85%)的5.88倍，雖然還沒達到“10×規則”，但已遠大于一般的種內遺傳距離(2%)。由于不同物種生理生態習性和進化歷史不同而呈現不同的種間遺傳距離，并不是所有的物種都能滿足“10×規則”，因此不能排除三線鯻2個分支是2個物種的可能性。

本研究表明，三線鯻的形態特征易于與鯻科其它魚類混淆(特別是鯻和細鱗鯻)，且本研究所獲三線鯻數量較少，國內亦缺乏相關的資料，以致形態測量方法的多元性和鯻科形態特征上的相似性為實際的形態鑒定帶來了不可避免的困難乃至錯判。三線鯻的形態特征在DNA條形碼輔助校對下能與鯻科其它物種分開，表明其為一有效物種。印度-西太平洋分布的三線鯻由2個分支組成，可能其由2個不同的亞種組成乃至近期分化為2個物種?；诜N質資源保護、開發利用和海洋生態研究等需要，三線鯻應作為2個顯著進化單位被加以保護。由于本文僅分析了母系遺傳的線粒體基因，不能完整反映物種的遺傳信息，在以后的研究中仍需更廣泛的地理取樣，并開展詳細的形態測量，以明確三線鯻2個分支的分類地位。

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DNA barcoding of Terapontidae and taxonomic status of a new record ofTeraponputain costal waters of China

CHEN Lu, HUANG Bo-yan, XUE Dan, LV Jin-lei, YANG Xi-shu, ZHANG Qun

(InstituteofHydrobiology,JinanUniversity;EngineeringResearchCenterofTropicalandSubtropicalAquaticEngineering,MinistryofEducation;Guangzhou510632,China)

Terapontidae is a common economic fish,widely distributed in Indo-western Pacific.Due to the low interspecific variability and a degree of intraspecific differences, the accurate identification of Terapontidae is hardly achieved only by the external morphological charaters. To clarify the classification of Terapontid found in the coastal waters of China, all the putative species were subjected to the morphometric and molecular analysis. The 5' end ofCOI sequence(652 bp)from 62 terapontid individuals were sequenced, combined with 9Teraponputasequences from 3 sites in Indian Ocean and Mediterranean Sea downloaded from GenBank and BOLD as references. The results suggested thatT.putawas a new record in China, and the specimen was kept in the department of Ecology, Jinan University. The interspecific genetic distances [18.34%(15.9%-20.1%]) were 23.93 times greater than the intraspecific distances [0.72%(0.1%-2.7%)], indicating a clear barcoding gap between them. 5 terapontid species each could be independently divided into 5 monophyletic clades based on Kimura-2-parameters in the phylogenetic tree. Of whichT.putacould be further divided into 2 independent geographically-defined lineages: Western Pacific, and Indian-Mediterranean. As interlineage genetic distances [5%(0.2%-5.6%)] are 4.88 times greater than the intralineage distances {0. 85% [lineage A was 0.6% (0-1.7%)], lineage B was 1.1% (0.2%-5.6%)} inT.puta, which was slightly lower than the interspecific/intraspecific ratios, but a much higher than the intraspecific genetic distances (2%) for most species. Moreover, there are some visible morphological differences between the lineages ofT.putasuch as: body elongate and flat or thickening lateral, anal fin with faint scattered spots or not, dorsal fin with the black spots located between the third to the sixth or seventh to eighth spines or not, upper head to the front part of dorsal fin with or without bluish grey or yellowish-green lustre and the backside of body colored with light gray or brown. Overall, summaries of morphological measurements and molecular analyses suggested that the 2 lineages ofT.putamight belong to 2 subspecies or even 2 species. However, the insufficient sampling size, limited sampling area and the only maternal genetic data bring incomplete information in this study. So the species status identification work demands the further morphological and nuclear genetic studies based on more individual samplers from wider range of species.

Terapontidae；Teraponputa； DNA barcoding； morphomeristic taxonomy

1004-2490(2017)02-0121-10

2016-08-12

國家自然科學基金項目(41071034)；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(21613105)；歐盟 Erasmus Mundus TECHNOI博士后交流項目

陳 璐(1989-)，女，廣東湛江人，碩士研究生，從事生物化學與分子生物學研究。 E-mail:vic198987@gmail.com

章 群，副研究員。E-mail:tqzhang@jnu.edu.cn

Q 349

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