0#柴油和東海平湖原油對黑鯛血細胞DNA損傷的研究

董 冉，沈新強，蔣 玫，李 磊，楊杰青，許高鵬

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090； 2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306)

0#柴油和東海平湖原油對黑鯛血細胞DNA損傷的研究

董 冉1,2，沈新強1，蔣 玫1，李 磊1，楊杰青1,2，許高鵬1,2

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090； 2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306)

采用單細胞凝膠電泳技術(SCGE)，以砂濾過的清潔海水為對照組，研究0#柴油(0.015 mg·L-1、0.03 mg·L-1、0.06mg·L-1)和東海平湖原油(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.12 mg·L-1)在不同暴露時間(3 d、7 d、15 d和21 d)對黑鯛血細胞核DNA損傷作用。結果顯示，黑鯛血細胞DNA損傷程度與兩種石油有顯著的劑量-效應和時間-效應關系。實驗第3天，0#柴油和東海平湖原油試驗組就檢測到DNA損傷，主要以1級損傷為主。隨0#柴油和平湖原油濃度的增高和脅迫時間的延長，彗尾DNA相對含量(Tail DNA%)和彗尾長度/核直徑(TL/D)值均呈上升趨勢，DNA損傷級別逐漸升高?；謴蛯嶒灲Y束后，中、高濃度組0#柴油(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1)和平湖原油(0.06 mg·L-1、0.12 mg·L-1)的彗尾DNA相對含量(Tail DNA%)和彗尾長度/核直徑(TL/D)值無法恢復至對照組水平(P<0.05)。從DNA損傷程度來推測，0#柴油的生物毒性大于平湖原油。研究表明，魚類血細胞DNA損傷可作為監測海洋石油污染的生物標志物。

0#柴油； 平湖原油； 黑鯛； DNA損傷； 彗星實驗

近年來，以海洋溢油為主的海洋污染日趨嚴重，石油污染不僅可以影響受污染海域的整個海洋生態系統，破壞其生態平衡，導致海洋生物數量減少乃至滅絕[1-2]。目前有關石油污染的研究主要集中在其對海洋生物抗氧化酶活性影響等方面，陳榮等[3]、余群等[4]的研究顯示0#柴油會對僧帽牡蠣(Ostreacucullata)和真鯛(Pagrosomusmajor)的抗氧化酶系統產生影響，董冉等[5]發現0#柴油和平湖原油能引起黑鯛(Sparusmicrocephalus)肝臟、鰓和肌肉中不同種類抗氧化酶活性變化，李磊等[6]發現石油不僅影響黑鯛肝臟中7-乙氧基異吩噁唑酮-脫乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase，EROD)活性，還影響黑鯛的CYP1A1mRNA表達。近年來，越來越多國內外學者把研究重點放在分子遺傳學改變方面，如DNA初級損傷、基因異常表達等。 HAMOUTENE等[7]研究了石油烴對蛤蜊(Myaarenaria)和紫貽貝(Mytilusedulis)的DNA損傷效應，結果表明與重油相比，輕質油對兩種生物血淋巴細胞和消化腺細胞造成DNA損傷程度更為嚴重。金春華等[8]發現，大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)血細胞DNA 的損傷程度和鎘污染脅迫之間同時存在時間-效應和劑量-效應關系。TABAN等[9]在分散原油對海膽(Strongylocentrotusdroebachiensis)和貽貝(MytilusedulisL.)的DNA損傷研究中也指出，DNA損傷可以作為分子生態毒理學指標。但目前針對不同種類的石油對海洋魚類DNA損傷的對比研究還較為少見。

水污染遺傳毒性監測中最常用的技術是單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，又稱彗星實驗(comet assay)，該技術較以往的傳統方法更為穩定、靈活性更高、應用也更為簡便[10-11]。

本研究以黑鯛為目標生物，通過彗星實驗探究了0#柴油和平湖原油對黑鯛血細胞DNA的損傷效應，探討其作為石油烴污染生物標志物的可行性，從而為溢油污染的毒性機理研究提供科學參考，進一步為石油污染的監測和海洋漁業資源的保護提供基礎資料。

1 材料與方法

實驗用油為市售0#柴油，原油產自平湖油氣田。實驗海水為經過濾的天然海水，鹽度21～22，pH 8.20，經沉淀和砂濾后，充分曝氣24 h以上備用。受試黑鯛由江蘇省海洋水產研究所提供，實驗前馴養一周，狀態穩定后選取的健康個體進行實驗，體重平均為(6.75±1.15) g。

將0#柴油和東海平湖原油分別與過濾海水按1∶10(V∶V)配比，置于磁力攪拌機上，連續高速攪拌24 h后靜置3 h分離出水相，作為實驗用的0#柴油和東海平湖原油水溶分母液(water soluble fraction，WSF)，注入棕色母液貯瓶中，4 ℃冰箱保存2～3 h[12]。使用紫外分光光度計法測定石油烴的含量[13]。

1.1 實驗方法

選用體積90 L的玻璃箱體，每個箱體投放70 ind黑鯛，實驗溶液總體積為40 L。將0#柴油和東海平湖原油水溶分母液和天然海水按比例混合，設置不同實驗濃度梯度：0#柴油 (0.06 mg·L-1、0.03 mg·L-1、0.015 mg·L-1)東海平湖原油(0.12 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.03 mg·L-1)，經沙濾的天然海水作為對照組，每組設3個平行樣。實驗期間24 h連續充氧，水溫為23.60～25.40 ℃。每天100%更換實驗溶液一次，并及時清除排泄物以及活力不好的黑鯛個體。黑鯛餌料為配合飼料，每天 8∶00和18∶00分別投喂一次，投喂量為黑鯛體質量2%。脅迫實驗進行15 d，15 d后將實驗溶液全部換成清潔砂濾海水進行為期6 d的恢復實驗。

1.2 血細胞樣品制備

分別于實驗第3天、7天、15天和21天各取3 ind黑鯛，采用斷尾法取黑鯛外周血10 μL，迅速加入0.2 mL的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.4)中制成血細胞懸液，置于4 ℃冰箱中保存3 d后檢測。

1.3 彗星實驗

膠板制備(烤膠法)[14]：在燒杯里配置100 mL 0.6%正常熔點瓊脂糖，煮沸后，放入磨砂玻片并取出，室溫涼干。37 ℃下，取75 μL低熔點膠與25 μL血淋巴混勻，用槍直接把凝膠吹到玻片上，4 ℃放置10 min。裂解：將玻片放入裂解液(2.5 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris-base，pH=10)，用前加TritonX-100 和DMSO，4 ℃裂解2 h，取出玻片，用0.2 mol·L-1pH=7.4 的磷酸鈉緩沖液漂洗。解旋：將玻片放入水平電泳槽中, 倒入新鮮的電泳緩沖液(0.3 mol·L-1NaOH、1 mmol·L-1Na2EDTA, pH>13)，4 ℃避光放置20 min 以解旋。電泳：調整電壓為25 V，調整液面高度使電流達到300 mA，4 ℃避光電泳20 min。電泳結束，用磷酸鈉緩沖液漂洗玻片。中和：用預冷的中和液(0.4 mmol·L-1Tris-base， pH 7.5)； 4℃漂洗3次，每次10 min。染色和觀察：在膠板上滴加核酸染料gene finder，染色15 min 后，在Nikon80i 熒光顯微鏡200倍下，進行顯微攝影，每組3個平行，每個平行組采集60 cell細胞進行拍照和數據分析[15]。

1.4 數據處理

先通過T檢驗方法進行組間差異比較，再采用SPSS 軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，同時采用LSD多重比較法檢驗各濃度組與對照組之間差異的顯著性。用CASP 軟件分析彗星圖像，計算出彗尾長度、彗尾DNA相對含量(Tail DNA%)等參數，并以彗尾長度/核直徑(TL/D)值衡量損傷程度作為DNA損傷指標，比值在0.3以下為輕微損傷或1級損傷，0.3～0.6之間為中級損傷或2級損傷，大于0.6為嚴重損傷或3級損傷[16]。

2 結果與分析

2.1 DNA損傷形態

圖1為不同濃度0#柴油和東海平湖原油脅迫15 d后黑鯛血細胞的彗星圖片。其中平湖原油低、中濃度組(0.03、0.06 mg·L-1)與對照組無顯著差異，因此圖中僅以高濃度組(0.12 mg·L-1)為例進行分析。由圖1可見，對照組的血細胞核大小均一，呈現圓形的、邊緣光滑、規則的熒光頭部，無拖尾現象(圖1-a)，這表明細胞未發生DNA斷裂。其余濃度組則引起不同程度的核DNA 損傷，0.03 mg·L-1和0.06 mg·L-10#柴油脅迫下，黑鯛血細胞核有彗星狀的尾從核中伸向陽極, 形成一個緊連熒光頭部的尾部(圖1-b和圖1-c)，0.06 mg·L-1濃度組的彗尾更長；高濃度組的平湖原油(0.12 mg·L-1)染毒后，有一定數量的凋亡細胞出現，彗星頭部小，尾巴大且呈偏圓狀(圖1-d)。

2.2 DNA損傷指標

不同濃度0#柴油和東海平湖原油染毒組對血細胞彗尾DNA相對含量的影響見表1。由表1可見，各濃度組血細胞彗尾DNA相對含量隨著處理時間的延長持續上升。0#柴油中、高濃度組(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1)在從第7天就對血細胞DNA造成顯著損傷(P<0.05)，低濃度組(0.015 mg·L-1)對各個時間點血細胞DNA的損傷均不顯著。東海平湖原油只有高濃度組(0.12 mg·L-1)第15天時對黑鯛血細胞DNA損傷效果顯著(P<0.05)，其余試驗組對血細胞DNA均未造成顯著性損傷?；謴蛯嶒灲Y束后，兩種油的高濃度組彗尾DNA相對含量仍顯著高于對照組水平(P<0.05)。

圖1 0#柴油和東海平湖原油暴露后第15天對黑鯛血細胞DNA 損傷的彗星圖像(200×)Fig.1 Comet assay images of DNA damage in hemolymph cell of Sparus microcephalus exposed to No.0 diesel oil and Pinghu crude oil on the 15th d

表1 0#柴油和東海平湖原油處理后的黑鯛血細胞彗尾DNA相對含量(%) (n=3)Tab.1 Percentage of damaged DNA with tail treated by No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

注：*表示與對照組對比有顯著差異(P<0.05)

Note:*means significant differences from the control at the same sampling time(P<0.05)

以彗尾DNA相對含量和兩種石油烴污染物濃度作線性回歸分析，得到表2所示的效應方程。由表2看出，黑鯛血細胞彗尾DNA相對含量與0#柴油和東海平湖原油存在一定的濃度-效應正相關關系，其相關系數均達到0.85以上。

表2 黑鯛血細胞彗尾DNA相對含量和0#柴油和東海平湖原油濃度效應方程Tab.2 Correlation coefficients between percentage of damaged DNA with tail and concentration of No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

2.3 DNA損傷程度

表3為0#柴油和東海平湖原油處理后的黑鯛血細胞受損DNA的TL/D值。第7天時低、中濃度組0#柴油(0.015、0.03 mg·L-1)和東海平湖原油(0.03、0.06 mg·L-1)對黑鯛血細胞造成的DNA損傷程度以2級為主(<0.6)，高濃度組0#柴油(0.06 mg·L-1)和東海平湖原油(0.12 mg·L-1)以3級損傷為主(>0.6)，損傷率大于80%；第7天后各試驗組DNA損傷程度繼續上升，除低濃度組以外，其余試驗組DNA損傷嚴重，損傷程度明顯高于對照組(P<0.05)。第21天恢復實驗以后，中、高濃度組TL/D值與對照組仍有顯著差異(P<0.05) 。

3 討論

DNA損傷是評價環境污染物遺傳毒性的重要參數之一。MITCHELMORE等[17]認為污染物會影響DNA的轉錄過程從而引起DNA切口數量的減少，并引起DNA損傷。也有研究[18-21]指出，有機污染物進入生物體內后，在生物轉化酶的作用下進行生物轉化，親脂性底物在細胞色素P450酶系代謝作用下轉化為更具極性的中間代謝產物，這些中間代謝產物與DNA結合會造成DNA的損傷，該轉化過程中往往伴隨著活性自由基的大量產生，這些自由基若不能被生物體內的抗氧化防御系統及時清除，則會造成過量，從而對機體產生氧化脅迫，攻擊核酸產生氧化損傷，使DNA雙鏈、單鏈發生斷裂或損傷，導致其缺失部分遺傳信息，從而引發毒性效應。

表3 0#柴油和東海平湖原油處理后的黑鯛血細胞受損DNA的TL/D值Tab.3 TL/D value of damaged DNA treated by No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

注：*表示為與對照組對比有顯著差異(P<0.05)

Note:*means significant differences compared to the control at the same sampling time(P<0.05)

許多研究已表明，水生生物不同組織中DNA損傷效應隨暴露濃度的增加和處理時間的延長，表現出一定的劑量-效應關系關系。例如王曉艷等[22]研究發現，低濃度(0.08 mg·L-1)石油烴在短時間內即可對扇貝血細胞DNA造成損傷， DNA損傷程度與石油烴濃度呈明顯的劑量-效應關系，當石油烴濃度≥0.88 mg·L-1時，DNA嚴重損傷，恢復實驗后DNA損傷程度也有不同程度的恢復，但整體較對照組顯著。周海龍等[23]的研究也表明，多氯聯苯、苯并[a]芘、滴滴涕等典型的持久性污染物對紫貽貝不同組織中DNA損傷作用均存在較為明顯的劑量-效應關系。本研究結果也發現0#柴油和東海平湖原油對黑鯛血細胞的DNA損傷呈現劑量-效應關系。不同濃度的0#柴油和東海平湖原油處理下，黑鯛血細胞DNA受到了不同程度的鏈斷裂和損傷，損傷效應表現為：隨0#柴油和東海平湖原油濃度的增高，損傷的細胞數逐漸增多且損傷程度加重(圖1)。由表1和表3可見，實驗從第3天開始，0#柴油和東海平湖原油試驗組就檢測到DNA損傷，隨著處理時間的延長，黑鯛血細胞彗尾DNA相對含量和TL/D值均呈上升趨勢，DNA損傷級別也逐漸升高；第21天恢復實驗以后，中、高濃度組與對照組仍有顯著性差異(P<0.05)，低濃度組由于損傷較輕，在恢復實驗期間機能逐步恢復，與對照組差異不顯著。表2表明，黑鯛血細胞彗尾DNA相對含量與兩種石油的濃度均呈現正相關。郁昂等[24]報道的0#柴油對僧帽牡蠣鰓和消化腺的DNA損傷效應也與本實驗相一致。由此推斷，魚類DNA損傷可以作為石油污染評價的毒性效應指標之一。

本實驗研究中， 0#柴油和東海平湖原油雖均能引起黑鯛血細胞DNA損傷，但相同濃度的0#柴油和東海平湖原油試驗組比較而言，0#柴油試驗組的黑鯛彗尾DNA相對含量(Tail DNA%)和TL/D值更高，DNA損傷更嚴重(表1和表3)，這表明0#柴油對黑鯛血細胞的遺傳毒性更為顯著，蔣玫等[25]研究了0#柴油和平湖原油脅迫對縊蟶的毒性效應，通過計算分析IBR數值也發現，0#柴油生物毒性大于平湖原油生物毒性。此外，國外學者的研究也表明原油毒性更小，TATEM 等[20]在不同油類對河口甲殼類動物的毒性研究中發現原油毒性比成品油毒性小，并指出石油產品的毒性與芳族烴含量密切相關，尤其是萘和相關烴類影響最大。RICE等[26-27]通過研究多種海洋生物對油類的敏感程度發現，無論是魚類還是節肢動物、軟體動物等，原油對大多數海洋生物的毒性效應都小于2#燃油；吳彰寬等[28]分析了不同油類對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)受精卵、仔蝦和幼蝦三個發育時期的影響，結果表明輕柴油的毒性大于原油。已有研究[29]發現0#柴油中僅有20%～30%的組分是芳香烴，而平湖原油中芳香烴約占25%～35%，可能正是因為兩者的芳香烴含量不同致使對黑鯛的毒性效應有所差異[30]，而其它組分的影響還有待進一步研究和驗證。

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Effects of the No.0 diesel oil and Pinghu crude oil on the DNA damage of hemolymph cell inSparusmicrocephalus

DONG Ran1, 2, SHEN Xin-qiang1, JIANG Mei1, LI Lei1, YANG Jie-qing1, 2, XU Gao-pen1,2

(1.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China; 2.CollegeofMarineSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Individuals ofSparusmicrocephaluswere exposed to various concentrations of water-soluble fraction of the diesel NO.0 (0.015 mg·L-1, 0.03 mg·L-1, 0.06mg·L-1) and the crude oil from Pinghu sea area (0.03 mg·L-1, 0.06 mg·L-1,0.12 mg·L-1) to evaluate the DNA damage made by the diesel NO.0 and the crude oil from Pinghu sea area on the marine fish. Hemolymph cells were collected fromSparusmicrocephalusunder different exposure time(3 d,7 d,15 d and 21 d)，and comet assay was used to detect the DNA damage of hemolymph cells. The results showed that there was dose-effect relationship between the DNA damage and the oil concentration. The DNA damage degree increased with increasing of the concentration of diesel NO.0 or crude oil from Pinghu sea area. Only in the 3rd day after exposed to the two oil pollutants, slight damage to hemolymph cells was detected, but mainly on the 1 level. However, with increasing of the oil concentration and prolonging of the stress time, the relative content of tail DNA and the ratio of tail length to nucleus diameter tended to increase, which indicated that DNA damage level was increasing gradually. When recovery period was over, tail DNA percentage (DNA%) andTL/Dof the diesel NO.0 exposure groups under the concentration of 0.03 mg·L-1and 0.06 mg·L-1were still significantly different from the control group (P<0.05) , so were those induced by the crude oil from Pinghu sea area exposure groups of 0.06 mg·L-1and 0.12 mg·L-1. Based on the DNA damage degrees made by different groups，it could be concluded that the toxic effects made by the diesel NO.0 was more serious than those made by the crude oil from Pinghu sea area. The comet assay is proven to be a useful tool to evaluate the genotoxicity of environmental contamination like oil, and the DNA damage of fish hemolymph cell could be a biomarker to monitor the marine oil pollution．

diesel NO.0; crude oil from Pinghu sea area;Sparusmicrocephalus; DNA damage; comet assay

1004-2490(2017)02-0173-08

2016-03-28

中國水產科學研究院基本科研業務費(2014A02XK01);農業部應對溢油關鍵技術專項(2012-2014);中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2014T06)

董 冉(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為水環境毒理學。E-mail: 197668825@qq.com

沈新強，研究員。E-mail:xinqiang_shen@hotmail.com

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