4種環境源性脅迫對異育銀鯽血漿生化指標的影響

單 娜, 林聽聽, 來琦芳, 李功政,周 凱,厲成新,仲啟鋮,馬慶男,么宗利,劉進紅

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，中國水產科學研究院鹽堿水域漁業工程技術研究中心，上海 200090； 2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 3.光明漁業有限公司，江蘇大豐 224153)

4種環境源性脅迫對異育銀鯽血漿生化指標的影響

單 娜1,2, 林聽聽1, 來琦芳1, 李功政3,周 凱1,厲成新3,仲啟鋮1,馬慶男3,么宗利1,劉進紅3

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，中國水產科學研究院鹽堿水域漁業工程技術研究中心，上海 200090； 2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 3.光明漁業有限公司，江蘇大豐 224153)

以異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)幼苗[(136.70 ± 7.98 )g]為實驗對象，監測4種環境源性脅迫(高pH 9.2、低溶氧2 mg·L-1、高亞氮2 mg·L-1和高氨氮4 mg·L-1)下第3、7、10、15 天血漿內皮質醇(COR)、葡萄糖(GLU)、I型干擾素(IFN)、白細胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、免疫球蛋白M(Ig M)、補體3(C3)以及丙二醛(MDA)的變化規律。結果顯示：COR經高pH、高亞氮和高氨氮脅迫時顯著升高，而SOD顯著降低，Ig M經高亞氮和高氨氮脅迫時亦顯著升高，表明COR、SOD和Ig M可能是廣源性的脅迫狀態指示指標，COR和Ig M的升高以及SOD活力的降低指示異育銀鯽可能處于被脅迫狀態。GLU、IFN和C3只經高氨氮脅迫時顯著升高，且響應幅度劇烈，表明GLU、IFN和C3可能是靈敏且狹源性的應激指示指標，高水平指示機體可能處于氨氮應激狀態。IFN和MDA經高亞氮和高氨氮脅迫時，表現出不同的響應趨勢：氨氮脅迫時IFN和MDA顯著升高，但亞氮脅迫時則顯著降低，表明IFN和MDA響應模式可能具有特異性，不適合指示綜合應激狀態。

異育銀鯽； pH； 溶氧； 亞氮； 氨氮； 生化免疫指標

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是一種改良的鯽魚新品種，是我國淡水養殖的重要品種之一，有不易脫鱗、生長快、出肉率及成活率高等優點，市場需求旺盛、價格穩定、養殖效益明顯，深受養殖戶的喜愛，已成為我國鯽魚養殖中的主要品系[1-2]。然而近些年，異育銀鯽出現大規模病害如鰓出血、孢子蟲病、大紅鰓等[3-5]。究其原因是多方面的：一則是由于苗種質量參差不齊[6]；二則是環境因素，如氣候異常導致養殖水質環境惡化等[7]；三則是不合理養殖如密度過高、過量投餌而致水質變壞、病原滋生等[8]。惡化水質的長時間刺激，會使得魚體長期持續處于應激狀態，勢必削弱養殖鯽魚的免疫力和抗逆力，從而導致魚體出現生長緩慢、發病率高等問題[9]。因此，除了優化養殖技術、改善環境外，從源頭上提高魚體的質量，培育出高質量的幼苗，從而增強其對不良環境的適應性，也是解決目前鯽魚養殖現狀的一個良策[10]。而鯽魚體質的提高，其前提就是建立一套鯽魚體質評估方法或者篩選出幾個可用于指示鯽魚健康水平的指標。

魚類屬于低等脊椎動物，其免疫方式可以分為非特異性免疫和特異性免疫[11]。魚類免疫防御過程主要由免疫組織細胞和體液活性免疫因子協同完成[12]。血細胞是魚類主要的免疫細胞之一，是抵御病原性和非病原性刺激的最初防線和主要屏障。血細胞通過增生、凝集、吞噬、包囊、黑化、結節等方式，同時將活性物質釋放至血液中來氧化殺傷病原和非病原，起到免疫防御的作用[13]。越來越多的研究表明：魚體受到環境和病原刺激時，其血液中的生化免疫指標會發生顯著變化；更有甚者，部分指標具有指示應激水平的效果[14]。因此，本研究選取4個在鯽魚養殖過程中最常見的環境脅迫因子(高pH、低溶氧、高氨氮、高亞氮)作為刺激源，研究脅迫下血漿中生化免疫指標的變化，以期篩選出可用于指示鯽魚應激水平的指標，為后續的鯽魚體質評估打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗用魚來自于光明食品集團上海市海豐標準化養殖池塘，暫養于體積200 L、直徑2 m的圓形魚缸，暫養期間水溫為(24.8 ± 0.6)°C，氨氮濃度為(0.133 ± 0.017)mg·L-1，亞氮濃度為(0.163 ± 0.018)mg·L-1，水體pH值為8.14 ± 0.12。持續充氣，保證水中溶氧高于5 mg·L-1，每天早上8點投喂復合飼料一次，投餌后3 h吸走殘餌糞便，每天換水1/3。暫養一周后，選取健康的異育銀鯽400 ind用于實驗，實驗用魚平均體質量(136.70 ± 7.98 )g，平均體長(16.71 ± 0.49 )cm。

1.2 實驗設計

選取pH、溶氧、氨氮和亞氮為脅迫因子，每個脅迫因子的脅迫強度均在參考、歸納和總結以往研究資料以及預實驗的基礎上設定[15-16]，對異育銀鯽具有明顯的脅迫作用。具體強度值設定如下：pH 9.2、溶氧 2 mg·L-1、亞氮 2 mg·L-1、氨氮 4 mg·L-1。

將實驗魚分為5組，分別為對照組、pH組、溶氧組、亞氮組、氨氮組。其中高 pH、高亞氮、高氨氮分別是通過在養殖用水中添加一定量的氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化銨配制而成，而溶氧組是通過調節充氣筏控制而成。實驗用水提前一天配好。每組設3個平行，每個平行20 ind魚，每個平行在盛有200 L實驗用水的養殖桶中進行。實驗期間每天早上8點投喂一次，3 h吸走殘餌糞便，取樣前48 h停止投喂。實驗期間每天換水1/3。實驗周期為15 d(2015年6月15～29日)，實驗開始時第0、3、7、10、15天取樣，每個時間點各取3 ind。

1.3 樣品處理和測定

采集的魚用肝素鈉浸潤的5 mL注射器尾靜脈取血2～3 mL·ind-1，血液于4 ℃、3000 r·min-1條件離心10 min取上清， -80 °C凍存備用。皮質醇(COR)、葡萄糖(GLU)、I型干擾素(IFN)、白細胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、免疫球蛋白M(IgM)、補體3(C3)、丙二醛(MDA)和血漿總蛋白的測定均采用南京建成檢測試劑盒。

1.4 數據處理

實驗數據以平均值 ± 標準誤(Mean ± SE)表示。脅迫實驗組與對照組的差異性采用單因素方差分析，若有顯著性差異，再做Duncan多重比較，所使用的統計軟件為SPSS 19.0。

2 結果與分析

2.1 皮質醇(COR)

各環境脅迫下，COR呈現先升高后降低的變化趨勢(圖1)。前7 d，各脅迫組與對照組無顯著差異(P>0.05)。之后pH、亞氮和氨氮對COR的脅迫作用開始顯現，到第10天達到峰值，第15天恢復到對照值，其中氨氮的脅迫效果最為明顯，其次是pH。溶氧脅迫在整個實驗過程中都與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 葡萄糖(GLU)

GLU在4種脅迫下，只對高氨氮脅迫有顯著響應(P<0.05)(圖2)，該脅迫效果從第3 天開始顯現，然后緩慢加強，于第10天以后維持在一個高的水平。其它3個脅迫組 基本與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.3 白介素-2(IL-2)

與GLU變化趨勢相似，氨氮脅迫后IL-2急劇升高，至第15天仍顯著高于對照水平(P<0.05)。而其它3個脅迫組(除溶氧組第15天外)與對照組在整個實驗期間基本無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖1 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿皮質醇的變化規律Fig.1 Variations of COR in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

圖2 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿葡萄糖的變化規律Fig.2 Variations of GLU in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

2.4 補體3(C3)

C3的變化規律同GLU、IL-2類似，只對氨氮有明顯的脅迫響應(P<0.05)(圖4)，該響應從第3 天開始顯現，并一直維持在一個很高的水平。此外，C3在第7天對亞氮有響應，濃度水平顯著高于對照組(P<0.05)，剩余脅迫組在其它時間點與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

2.5 型干擾素(IFN)

隨著時間的變化，4種環境脅迫下除pH組的血漿IFN水平與對照組無顯著性差異外(P<0.05)，其它3組都有顯著性變化(P<0.05)。氨氮組先升高后降低再升高，其中在第3天和第15天時顯著高于對照組(P<0.05)；亞氮組先降低后升高，從第3 天到第15 天都顯著低于對照組水平(P<0.05)；而溶氧組的血漿IFN水平只有在第3天時顯著高于對照組水平，之后緩慢降低(圖5)。

2.6 免疫球蛋白M (Ig M)

pH組和溶氧組對Ig M的影響在整個實驗周期內均無顯著差異(P>0.05)；而亞氮組則從第7 天開始一直顯著高于對照組(P<0.05)；與亞氮不同的是，氨氮組在第7 天則是顯著低于對照組，在第10 天和第15 天 才開始高于對照組(P<0.05)(圖6)。

2.7 丙二醛(MDA )

氨氮組和亞氮組MDA水平有顯著性變化(P<0.05)，其中氨氮脅迫下，MDA從第3 天開始顯著升高，之后一直維持在一個高水平直至第15 天回落至對照組水平；而亞氮脅迫下，MDA 從第7 天到第15天均顯著低于對照值。其它兩脅迫組與對照組在整個實驗周期內均無顯著差異(P>0.05)(圖7)。

2.8 超氧化物歧化酶(SOD)

pH脅迫組中SOD活力與對照組無顯著差異(P<0.05)；而其它3個脅迫組均能顯著降低SOD活力，特別是氨氮組，SOD活力從第3 天開始顯著降低，直至第15 天仍未恢復至對照水平；溶氧組這種降低效果只出現在第3 天，之后回升保持在對照組水平；而亞氮組則是在第3 天和第7 天降低，之后同樣恢復至對照組水平(圖8)。

圖3 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿白介素-2的變化規律Fig.3 Variations of IL-2 in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

圖4 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿補體3內的變化規律Fig.4 Variations of C3 in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

圖5 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿I型干擾素內的變化規律Fig.5 Variations of IFN in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

圖6 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿IGM內的變化規律Fig.6 Variations of LGM in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

3 討論

關于魚類應激指標方面，國內外做了大量的工作，篩選出的相關應激指標涉及多個方面：如行為方面的呼吸頻率、游泳能力、應激狀態恢復時間等；形態方面的體色、眼暗、肝體指數等；生理方面的皮質醇、葡萄糖、乳酸鹽等[17-20]。然而，并非所有魚受應激時會在形態外觀上呈現出明顯的差異，另外在行為上呈現出差異時可能表明魚體已達嚴重應激狀態[21]。因此，從生化免疫角度去篩選應激指標也是一種很有效的途徑。魚類是典型的變溫和變滲型低等脊椎動物，極易受到各種環境源性和病原性的脅迫[22]。輕度應激會限制養殖魚類生長、繁殖等，嚴重時則會導致其機體免疫力和抗逆性下降，從而誘發疾病甚至死亡[23]。研究發現，血清/血漿生化免疫指標可以反映出機體受環境脅迫后的代謝水平，進而被廣泛用于判斷魚類的營養狀況、疾病預警等方面[24]。目前，關于魚類在應激狀態下免疫指標的變化研究越來越多，但是大多數是某一單個刺激因子的不同梯度水平脅迫對血漿生化指標的影響[25]，而本實驗則采取了4種常見的異育銀鯽幼魚脅迫因子，研究脅迫下異育銀鯽血漿生化免疫指標的變化趨勢，旨在篩選出能夠指示異育銀鯽應激狀態的指示性指標，為其體質評估和疾病的預防提供資料。

本研究發現COR經高pH、高亞氮和高氨氮脅迫時顯著升高，而SOD顯著降低，另外Ig M經高亞氮和高氨氮脅迫時亦顯著升高，表明COR、SOD和Ig M可能是廣源性的應激指示指標，高COR、高Ig M和低SOD指示機體可能處于應激狀態。研究發現，應激狀態下，眾多血液指標會發生波動，其中以皮質醇最為靈敏[26-28]。眾多研究也發現在各種不同脅迫情況下，各種魚的COR均顯著升高，如表1。

圖7 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿MDA內的變化規律Fig.7 Variations of MDA in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

圖8 4種環境源性脅迫因子脅迫下異育銀鯽血漿SOD內的變化規律Fig.8 Variations of SOD in the plasma of Carassius auratus gibelio under four environmental stresses

表1 血漿皮質醇相關研究Tab.1 Relevant studies of plasma COR

SOD是機體內重要的抗氧化酶，能夠通過歧化反應清除機體細胞內所生成的氧自由基，降低其對細胞的損害，使受損細胞得到及時的修復，是抗氧化防御體系的第一道防線[37]，其活性與水生生物的免疫水平密切相關[38]。所以，監測SOD活性的變化可反映出機體清除自由基的自我保護能力大小，對于增強吞噬細胞的防御能力以及整個機體的免疫功能具有重要作用[39]。因此，SOD經常被用作環境脅迫潛在指標[40]。田照輝等[41]發現西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)遭受熱應激時、王琨[30]發現鯉(Cyprinuscarpio)幼魚在高氨氮脅迫下、韓春艷等[42]發現奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)在氨氮脅迫下、葉俊[43]發現草魚(Ctenopharyngodonidellus)在亞硝酸鹽脅迫下、趙海濤[44]發現南方鯰(Silurusmeridionalis)幼魚在高濃度氨氮長時間脅迫下、臧學磊[45]發現尼羅羅非魚(OreochromisNiloticus)在高氨氮和高亞氮脅迫下，SOD均顯著降低。

魚類的免疫球蛋白M是一種特異性體液免疫因子，在體液免疫中發揮重要作用，可以中和毒素和病毒的毒性作用，是評價魚體免疫應答反應的重要指標[46]。謝明媚等[47]發現銀鯧(Peprilusmedius)幼魚在急性溫度脅迫時、楊啟蓮等[48]發現大黃魚(Larimichthyscrocea)在溫度脅迫時，Ig M均顯著升高。

另外，本研究也發現GLU、IFN和C3只經高氨氮脅迫時顯著升高，且響應幅度劇烈，表明GLU、IFN和C3可能是靈敏且狹源性的應激指示指標，高水平指示機體可能處于氨氮應激狀態。氨氮對魚體危害極大，它是誘發魚病的主要環境因子[49]。胡毅等[50]發現青魚(Mylopharyngodonpiceus)幼魚在氨氮脅迫下，王琨[30]發現鯉在氨氮脅迫下血糖顯著升高；此外，臧學磊[45]和陳家長等[49]都發現尼羅羅非魚在氨氮脅迫下C3活性明顯升高，但脅迫達到一定強度時C3則降低，而本實驗中高氨氮脅迫下，異育銀鯽C3活性一直處于高水平，這種差異可能由不同魚類對氨氮耐受性的差異所致。

綜上所述，在本實驗條件下，血漿COR、SOD和Ig M可能是異育銀鯽廣源性的應激指示指標，GLU、IFN和C3可能是其靈敏的氨氮脅迫指示指標，但這些候選指標的進一步篩選還需深入研究。

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Effects of four environmental stresses on biochemical indexes in the plasma of gibel carpCarassiusauratusgibelio

SHAN Na1,2, LIN Ting-ting1, LAI Qi-fang1, LI Gong-zheng3, ZHOU Kai1, LI Cheng-xin3, ZHONG Qi-cheng1, MA Qing-nan3, YAO Zong-li1, LIU Jin-hong3

(1EngineeringTechnologyResearchCenterforSaline-alkalineWaterFisheries,EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China;2CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;3BrightfisheriesCo.,Ltd.,DafengJiangsu224153,China)

In recent years, the problems such as uneven quality of juveniles, unstable production and large-scale disease occurence have been frequently emerged in the culture of gibel carpCarassiusauratusgibelioin our country. Establishment of the techniques for fish health evaluation or screening out several immune-related indexes for indicating the fish healthy status is useful to relieve these problems. In the present study, the effects of four environmental stresses (high pH of 9.2, low dissolved oxygen of 2 mg·L-1, high nitrite nitrogen of 2 mg·L-1and high ammonia nitrogen of 4 mg·L-1) on immune indexes (cortisol (COR), glucose (GLU), interferon (IFN), interleukin-2 (IL-2), superoxide dismutase (SOD), immunoglobulin M (Ig M), complement 3 (C3) and malondialdehyde (MDA)) in the plasma of theC.auratusgibeliojuveniles [(136.70 ± 7.98) g] were carried out. Stressed carps were sampled at the 0 d, 3 d, 7 d, 10 d and 15 d after stress. The results showed that COR significantly increased under pH, nitrite nitrogen and ammonia nitrogen stresses, while SOD significantly reduced under pH, nitrite nitrogen and ammonia nitrogen stresses, meanwhile, Ig M significantly increased under nitrite nitrogen and ammonia nitrogen stresses, indicating that these three immune indexes may be the broad-spectrum indicators for stressed status. High values of COR and Ig M, and low value of SOD may indicate fish under the stress condition. GLU, IFN and C3 strongly increased only under the ammonia nitrogen stress, indicating these three immune indexes may be the narrow-spectrum indicators for stressed status. High values of GLU, IFN and C3 may indicate fish under the stressed condition. Additionally, IFN and MDA increased under ammonia nitrogen stress, but decreased under nitrite nitrogen stress, indicating these two immune indexes may be not suitable for indicating the carp stressed status.

Carassiusauratusgibelio; pH; dissolved oxygen; nitrite nitrogen; ammonia nitrogen; biochemical and immune indicators

1004-2490(2017)02-0162-11

2016-04-19

上海市科技興農重點攻關項目“海豐濱海鹽堿池塘養殖關鍵技術研究與示范”；滬農科攻字(2015)第1-6號

單 娜(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事水產養殖學研究。E-mail:danna_7047@hotmail.com

來琦芳，研究員。E-mail: laiqf@ecsf.ac.cn

S 964.3

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