富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠缺血再灌注損傷指標及炎性因子水平的影響

魏偉++邵洪波++張桂華++李晰++張慶富++馮建科

[摘要] 目的 探討富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠缺血再灌注損傷指標、白細胞介素-8（IL-8）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。 方法 選取SPF級雄性大鼠60只，采用隨機數字表法分為四組，即使用生理鹽水進行腹腔注射的高壓電燒傷實驗組、腹腔注射富氫鹽水治療高壓電燒傷的治療組、單純腹腔注射生理鹽且無高壓電燒傷的空白對照組，以及腹腔注射罌粟堿治療高壓電燒傷的陽性對照組，每組15只。治療后，檢測血漿中6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）水平，并檢測電燒傷組織黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、TNF-α及IL-8水平。 結果 治療組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。治療組大鼠組織SOD水平顯著低于空白對照組（P < 0.01），顯著高于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）；治療組大鼠組織XOD及MDA水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。治療組大鼠組織TNF-α及IL-8水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。 結論 富氫鹽水治療高壓電燒傷大鼠可有效保護受損區，最大限度地降低缺血再灌注損傷，且有效抑制細胞氧化應激，控制炎性因子表達可能是富氫鹽水發揮生物學功能的主要機制。

[關鍵詞] 富氫鹽水；高壓電燒傷大鼠；缺血再灌注損傷；白細胞介素-8；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0022-05

[Abstract] Objective To investigate influence of hydrogen rich saline on ischemia reperfusion injury indexes， IL-8， TNF-α levels in high voltage burn rats. Methods 60 male SPF rats were selected and divided into four groups by random number table method. There were intraperitoneal injection of saline as high-voltage burn experimental group， intraperitoneal injection of hydrogen rich saline as high voltage burn treatment group， injection of physiological saline without high voltage burn as blank control group， intraperitoneal injection of papaverine with high-voltage burn as positive control group. Each group had 15 rats. After treatment， plasma 6-Keto-PGF1α， TXB2 levels were detected. XOD， MDA， SOD， TNF-α and IL-8 levels of high voltage burn tissues were detected. Results Plasma 6-Keto-PGF1α， TXB2 levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. SOD level in treatment group was significantly lower than that in blank control group （P < 0.01）， which were significantly higher than that in experimental group and positive control group （P < 0.01）. XOD， MDA levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. TNF-α， IL-8 levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. Conclusion Hydrogen rich saline in the treatment of high voltage burn rats can effectively protect the damaged area and maximum degree of reduction ischemia reperfusion injury， which can also effective inhibition of cellular oxidative stress and control of inflammatory factor expression. Which may be the main mechanism of hydrogen rich saline.

[Key words] Rich hydrogen saline； High voltage burn rats； Ischemia reperfusion injury； IL-8； TNF-α

一般情況下，將流通過人體誘發的電接觸燒傷、電弧燒傷以及閃電燒傷等統稱為電燒傷，其中臨床中最為常見的為電接觸燒傷。電燒傷與傳統意義上的燒傷存在明顯的臨床特征，?？稍诨颊邉摽诎l現明顯的誘發燒傷的電流出入口[1-2]。一般情況下，在患者電燒傷創面可見較為明顯的平滑肌纖維變性壞死和小動脈中層彈力纖維斷裂等病理性變化，造成炎性細胞在受損血管處大量聚集，改變微環境，甚至造成患者形成血栓[3-4]。有研究證實，在電燒傷患者患處其如細胞黏附分子、一氧化氮（NO）、內皮素（ET）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子等情況出現明顯異常，導致血管進一步損傷，并可能誘發患處微循環障礙，造成組織缺氧缺血[5-7]。富氫鹽水是在經脫氣、低溫、注入及加壓處理后所制備的一類具有廣泛生物活性的物質，Cai等[8]研究發現，富氫鹽水可以預防并治療由腦缺血誘發的臟器和組織功能障礙。但在使用富氫鹽水對高壓電燒傷進行治療的作用機制仍有諸多空白。本文旨在探討富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠治療后其缺血再灌注損傷指標、IL-8以及TNF-α的水平，為進一步的深入研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

使用的60只SPF級體重為（220±34）g的雄性大鼠，均購買自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號為DK103144，該研究經實驗動物倫理委員會批準，全部大鼠均在室溫24～26℃環境中進行培養。將全部大鼠依照隨機數字表法分為四組，即高壓電燒傷實驗組（腹腔注射生理鹽水，實驗組）、高壓電燒傷富氫鹽水治療組（腹腔注射富氫鹽水，治療組）、假高壓電燒傷組（單純腹腔注射生理鹽水且不通電，空白對照組）和高壓電燒傷罌粟堿治療組（腹腔注射罌粟堿溶液，陽性對照組），每組15只。研究中使用的6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）及血栓素B2（TXB2）均購買自南京生工生物有限公司，大鼠TNF-α及白細胞介素-8（IL-8）均購買自南京福麥斯生物技術有限公司。TC-30-20KVA型調壓器、TDJ-10KVA型變壓器均購買自得福電氣有限公司，PG270A型電流表購買自申華儀表有限公司。

1.2 造模方法

實驗組、治療組及陽性對照組全部45只大鼠均采用如下方法進行高壓電燒傷造模：用生理鹽水稀釋戊巴比妥鈉粉劑和己酮可可堿粉劑，制作成1%注射液，備用，用75%乙醇擦拭大鼠腹部正中皮膚，用5 mL注射器吸取配置好的1%注射液，按照40 mg/kg給予大鼠腹腔注射，觀察大鼠的麻醉程度，待大鼠完全麻醉后，用手術剪刀去除大鼠左上肢、右下肢和胸腹部的被毛，用電動剃須刀將殘余被毛剃除，將準備好的大鼠固定于絕緣臺面上，將2個1 cm ×1 cm電極銅片分別置于大鼠左上肢、右下肢的備皮區，將室內溫度控制在20℃左右，適度控制在40%RH，穿戴好絕緣防護服后，確定高壓電路連接無誤，給予大鼠電擊，電流入口與電流出口分別作為造模時的電流入口及出口，選擇2 kV電壓作為造模時的電擊電壓，（1.80±0.20）A作為造模的電擊電流強度，通電時間3 s。造模過程中，大鼠電流出入口創傷面積為1 cm2。

造模成功條件如下：電擊即刻，可見大鼠全身肌肉明顯痙攣，關閉電路并接觸電極后，可見電極固定區域毛皮和肌肉發生碳化為黑色，有灼焦氣味，部分大鼠創口深度可達骨骼處，且部分大鼠甚至出現肢體脫落或斷裂等，對少數心跳驟停大鼠立即開展心臟外按壓復蘇，以確保高壓電燒傷大鼠造模成功。

1.3 方法

在0.4 MPa大氣壓下將氫氣通入250 mL的袋裝生理鹽水中，在通入氫氣4 h后達到過飽和狀態，7 d后，抽出袋中氣體后再次以相同條件下通入氫氣以制備富氫鹽水，并使用氣相色譜法檢測結果顯示，富氫鹽水濃度為0.6 mmol/L。

本研究中所有大鼠依照分組不同采用不用的干預方式。實驗組：該組大鼠在造模成功后腹腔注射4 mL生理鹽水，作為模型對照組即實驗組。治療組：該組大鼠在造模成功后依照Parkland公式進行換算，依照4 mL/kg劑量使用富氫鹽水對大鼠進行腹腔注射。陽性對照組：該組大鼠在造模成功后依照3.18 mg/kg的劑量使用4 mL生理鹽水溶解并進行腹腔注射?？瞻讓φ战M：該組大鼠不進行造模，且僅腹腔注射4 mL生理鹽水進行干預。

1.4 檢測指標

在治療1周后，去眼球取血，對血漿中的6-Keto-PGF1α、TXB2水平進行測定，由于兩者性質較不穩定，因而采用放射免疫分析法對兩項指標進行檢測，嚴格參照試劑盒說明書進行操作檢測，并由計算機系統自動處理結果。大鼠電燒傷組織的黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）三項指標嚴格參照試劑盒說明書進行檢測，測量吸光度并計算缺血再灌注組織的XOD、MDA及SOD活力。使用雙抗夾心法（ABC-ELISA）檢測組織中TNF-α及IL-8水平，其具體操作過程嚴格依照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件包對數據進行統計分析，以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平比較

四組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；治療組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠組織SOD、XOD及MDA水平比較

四組大鼠組織SOD、XOD及MDA水平比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；治療組大鼠組織SOD水平顯著低于空白對照組（P < 0.01），顯著高于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）；治療組大鼠組織XOD及MDA水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠組織TNF-α及IL-8水平比較

四組大鼠組織TNF-α及IL-8水平比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；治療組大鼠組織TNF-α及IL-8水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表3。

3 討論

當患者皮膚經電流通過后，由于物理學特性電流沿電阻最小路線運行，對患者的神經、血管、心臟、晶狀體和肌肉等產生直接損害，此外電流可以迅速地通過血管，故對血管造成極其明顯的損傷，特別是分散在身體各處的小動脈[9]。當電流通過血管時，造成患者血管內皮細胞受到嚴重損傷，甚至出現脫落和變性壞死。有研究發現，微循環障礙時高壓電燒傷早期的主要臨床癥狀，隨著時間的延長患者出血以及微栓等數目明顯增多[10-11]?，F階段電流損害機體的具體機制仍有諸多待解之謎，而微循環障礙時臨床工作中公認的病理性變化，因而針對微循環障礙進行有效干預和治療在高壓電燒傷的臨床實踐中具有重要意義。本研究也證實高壓電燒傷大鼠血清中TXB2和6-keto-PGF1α及組織中MDA、SOD、XOD、IL-8、TNF-α水平較正常大鼠均存在顯著性差異，因而其電燒傷患處微環境出現明顯變化[12]。

有研究指出，在血小板活化的生理過程中氧自由基扮演著重要的作用，其可大量生產TXA2并造成前列腺素I2（PGI2）的大量生產與釋放，起到抑制血小板聚集和擴血管的生理學作用[13]。TXA2是一類主要由血小板合成并釋放的一類強血管收縮物，還可以造成血小板聚集。在正常情況下，TXA2與PGI2處于動態平衡中，因而臨床中常依據兩者的比例分析患者血小板受損及活化程度[14]。本研究發現，使用富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠進行干預治療后，大鼠的TXB2（TXA2代謝產物）和6-keto-PGF1α（PGI2代謝產物）指標出現顯著性改善，且其改善程度明顯優于罌粟堿，但仍無法完全達到正常水平，這可能與治療時間不足有關。分析認為，富氫鹽水可以有效糾正血液中TXA2/PGI2的代謝失衡，并達到減輕細胞受損和降低炎性反應的目的，最大限度地起到維持細胞完整超微結構的目的。

SOD是機體內一類典型的具有清除自由基活性的酶，其在維持機體微環境平衡過程中起到十分重要的作用，其能夠有效地將超氧陰離子清除以達到保護細胞的目的[15]。XOD是經典的脫氫酶類，其在自由基的產生過程中起十分重要的作用，而MDA則是可以有效直接反映脂質過氧化和間接反映組織受損程度的生物標志物[16-18]。本研究發現，在富氫鹽水干預治療后，高壓電燒傷大鼠組織中SOD明顯高于模型組和罌粟堿組，XOD和MDA水平明顯低于模型組和罌粟堿組，但較正常大鼠組織中SOD水平仍偏低，XOD和MDA水平仍偏高。研究結果也反映，富氫鹽水可以有效提高機體氧自由基的清除能力，顯著降低炎性反應和脂質過氧化程度。有學者在對兔的肺部缺血再灌注模型進行研究時發現，富氫鹽水可以有效降低MDA和MPO水平，并提高肺部組織的SOD水平，與本研究結果相似[19]。

IL-8是現階段公認的一類中性粒細胞趨化因子，其在中性粒細胞的黏附、遷移和浸潤等生理變化過程中起到重要作用[20]。單核巨噬細胞合成并分泌的TNF-α是典型的前炎性因子，其以血管內皮細胞作為其主要的靶點[21]。IL-8和TNF-α可以使血管內皮細胞出現功能異常，導致血管通透性、張力等失控，導致血栓生成。通過研究發現，富氫鹽水治療后，高壓電燒傷大鼠組織中IL-8和TNF-α水平較模型組和罌粟堿組顯著性降低，但與正常大鼠仍存在一定差別，其可能與治療時間短有關，若延長治療時間有可能恢復至正常水平。其可以表明富氫鹽水治療后，損傷區的炎性反應明顯改善，已達到改善微環境并最終實現的治療目的。此外，Zheng等[22]在對腸缺血再灌注損傷模型進行研究時發現，使用富氫鹽水干預后患處的IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA以及MPO均顯著性降低，與本研究結果類似。

綜上所述，在使用富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠進行治療后，可有效起到保護受損區，最大限度地降低缺血再灌注損傷，且有效地抑制細胞氧化應激，控制炎性因子表達可能是富氫鹽水發揮生物學功能的主要機制，因而認為，富氫鹽水可用于高壓電燒傷患者的臨床治療，可能發揮良好的治療效果。但此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，仍需要進一步擴大再研究。同時富氫鹽水是否具有良好的安全性，是否會引發明顯的不良反應，而影響到治療效果，也是此次研究的繼續。此次研究采用了腹腔注射是否為最佳的用藥方案，也仍有待進一步探討研究。

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（收稿日期：2016-12-19 本文編輯：李亞聰）