黏著斑激酶在骨肉瘤中的表達及臨床意義*

任可姚楠陸軍施鑫吳蘇稼馬捷王宸

·臨床研究與應用·

黏著斑激酶在骨肉瘤中的表達及臨床意義*

任可①姚楠②陸軍①施鑫③吳蘇稼③馬捷④王宸①

目的：探討骨肉瘤組織中黏著斑激酶（focaladhesion kinase，FAK）的表達情況及其與臨床病理特征和預后的關系。方法：收集1999年12月至2011年l2月東南大學附屬中大醫院和南京軍區南京總醫院收治的經手術病理確診的骨肉瘤標本113例，免疫組織化學檢測病灶中FAK表達量及磷酸化水平，并通過RNA干擾觀察改變FAK的表達與激活水平對骨肉瘤細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲活動的影響。結果：70例標本（61.95%）FAK過表達，其中42例（37.17%）pFAK陽性。FAK表達譜與性別、年齡、AJCCⅡA/ⅡB期、病灶部位、術式、術前化療效果等臨床病理參數均無顯著相關性。生存分析顯示FAK的過表達及其磷酸化顯著縮短了總生存時間（overallsurvival，OS）和無轉移生存時間（metastasis-free survival，mFS），其與術前化療效果是預測骨肉瘤生存時間和轉移早晚的兩個獨立預后因素。細胞學實驗則顯示FAK的表達和激活可以促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移及侵襲活動，并能抑制凋亡。結論：FAK的過表達及其磷酸化與骨肉瘤惡性程度密切相關，可為生存期及預后判斷提供一定參考。

骨肉瘤 黏著斑激酶 預后 遷移 侵襲

骨肉瘤是青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，其侵襲性強，肺轉移早，預后差［1-2］。20世紀70年代出現的新輔助化療是骨肉瘤治療中里程碑式的進步，但不少患者仍會出現原發或繼發性化療耐藥并發生肺轉移，而這正是骨肉瘤治療失敗的主要原因［3-4］。所以，探查骨肉瘤的發生發展機制并尋找傳統治療之外的新靶點具有重要意義。

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種非受體酪氨酸激酶，位于細胞和細胞外基質結合部位整合素（integrin）構成的灶性黏附復合體（focalad?hesion complex）上，調控多種細胞活動。397位酪氨酸殘基（Tyr397）是FAK主要的自身磷酸化部位，Tyr397磷酸化的FAK可與多種含SH2或SH3結構域的蛋白分子結合，通過整合素、FAK/Ras/MAPK、FAK/ Src/pl30CAS/JNK、FAK/PI3K、FAK-ROCK/RhoA等多條信號通路廣泛參與多種細胞學行為［5-7］。

近年來發現FAK與腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲、增殖及凋亡密切相關，并參與腫瘤的生長、復發、轉移、血管新生及血管生成擬態［5］。研究顯示，FAK在大腸癌、食管癌、子宮癌、乳腺癌和甲狀腺癌等惡性腫瘤中表達明顯增高并且是疾病的獨立預后因素［8-9］。因此，FAK可能作為臨床判斷腫瘤侵襲及預后的標志，以FAK及其介導的信號轉導通路為靶點的靶向治療也可能成為腫瘤治療的新方向。

然而，對于骨肉瘤中FAK的功能及其與侵襲、轉移和新血管形成等相關性的研究則鮮見報道，尤其缺少大樣本臨床研究。本研究擬觀察FAK表達水平與臨床病理特征之間的關系，分析病灶中FAK的表達和磷酸化對骨肉瘤患者生存時間及侵襲轉移的影響，初步探討FAK在骨肉瘤發生、發展中的作用及其與患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料收集1999年12月至2011年l2月東南大學附屬中大醫院和南京軍區南京總醫院收治的經手術病理確診的113例原發性骨肉瘤患者的存檔石蠟標本。納入標準：1）原發灶位于四肢骨骼；2）美國癌癥聯合會（AJCC）分期為Ⅱ期；3）組織學亞型為普通型；4）治療方案為新輔助化療-根治性手術-輔助化療；5）具備化療前活檢標本以便用于組織形態學觀測。排除標準：1）源發于中軸骨骼、顱骨、骨盆、肋骨和骨外組織的骨肉瘤；2）繼發性骨肉瘤；3）骨旁骨肉瘤和骨膜骨肉瘤等其他組織學亞型；4）初診時發現跳躍性病灶或遠處轉移灶；5）初診前已有放療或化療史；6）隨訪期間失訪的患者。

通過病歷和通信聯系，收集記錄患者的性別、年齡、原發灶部位、術式（保肢/截肢）、腫瘤最大直徑、術前化療的腫瘤壞死百分率。隨訪時間截止到2015年12月31日，隨訪終點為死亡、失訪或生存至截止日期，隨訪期間的失訪者算作刪失值。自確診至患者死亡之間的時間定義為總生存時間（overall survival，OS），自手術之日至發生轉移之間的時間為無轉移生存時間（metastasis-free survival，mFS）。

1.1.2 主要試劑兔抗人FAK多克隆抗體（C-20）購自美國Santa Cruz公司，1:100稀釋；兔抗人磷酸化FAK［pY397］單克隆抗體購自美國Invitrogen公司，1:100稀釋；Envision試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司；CCK-8檢測試劑盒及BCA蛋白含量檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 組織形態學觀察1）蘇木精-伊紅（HE）染色113例骨肉瘤標本和22例正常松質骨組織標本以4%的多聚甲醛溶液固定，4%EDTA-2Na溶液脫鈣，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后連續切片，HE染色，在BH-2光學顯微鏡Olympus下作光鏡觀察，篩選結構典型的取材部位。2）免疫組織化學染色石蠟標本以4μm厚切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水后，微波熱修復，修復完畢后加抗人FAK或FAK［pY397］一抗，4℃過夜。根據Elivision plus染色試劑盒要求滴加相應的試劑并孵育，DAB顯色，蘇木素復染，最后予脫水、透明及封片。采用乳腺癌組織作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。3）免疫組織化學結果判定隨機選擇5個有代表性的高倍鏡視野，每個視野記數100個腫瘤細胞。FAK免疫組織化學染色評分標準為：當陽性細胞百分率≥90%且染色強度（不著色、臨界著色、著色淺、中等著色和強烈著色分別為0、1、2、3、4分）≥3時，視為FAK過表達和pFAK磷酸化陽性［10-11］。

1.2.2 細胞學試驗1）細胞培養人骨肉瘤細胞株143B和MG-63購自美國組織細胞庫（Manassas，VA，USA）。細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen）、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，5% CO2培養箱37℃培養。融合度至90%后消化傳代。實驗用細胞均在對數生長期。2）細胞轉染及Western blot驗證設計4條siRNA［12-14］，由Qiagen GmbH（Hilden，Germany）公司合成：非特異性（錯義）siRNA（5'-AATTCT CCGAACGTGTCACGT-3'）；FAK siRNA，F1（5'-GGUUC AAGCUGGAUUAUUU-3'）；FAK siRNA，F2（5'-CCGGTC GAATGATAAGGTGTA-3'）；FAK siRNA，F3（5'-GGAAA UACAGUUUGGAUCU-3'）。確認最佳轉染效率后，根據lipo fectamineTM2000試劑盒操作手冊對143B和MG-63細胞株進行轉染，培養48 h后，細胞懸液加入RIPA裂解液，離心，BCA法稀釋，加入上樣緩沖液。8%的SDS-PAGE電泳，將蛋白質條帶轉移至PVDF膜上。含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉，依次加入一抗及HRP標記的二抗，暗室曝光后Imageproplus（IPP）軟件分析結果，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值進行比較分析。3）細胞增殖實驗未轉染及轉染siRNA的骨肉瘤細胞分別接種于96孔板中，每孔1×105細胞/mL，培養24 h后每孔加入10μLCCK-8，酶標儀在450 nm下測定各孔OD值。4）細胞凋亡檢測143B和MG-63細胞懸液以2×105細胞/孔接種于6孔板，24 h后離心收獲全部細胞，重懸后加入5μLAnnexin V-FITC和10μLPI，冰孵15min，流式細胞儀分析檢測。5）細胞遷移和侵襲實驗制備2×105細胞/mL的細胞懸液。Transwell小室的下室加入500μL含5%FBS的DMEM；遷移實驗時將200μL細胞懸液加入上室，侵襲實驗時先將80μLMatrigel（80μL）（BDBiosciences）加入上室37°C孵育1 h，待形成凝膠后再向上室加入200μL細胞懸液。培養24 h后（MG-63的侵襲實驗是48 h），用棉簽去除凝膠，4%多聚甲醛固定20min，蘇木素室溫染色3～5min。顯微鏡下隨機選擇6個視野（200倍）計數染色細胞并計算平均值。所有實驗均進行5次獨立的實驗。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，計數資料應用χ2檢驗，生存分析采用Ka?plan-Meier法，并應用Cox比例風險模型分析獨立預后因素。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤中FAK的免疫組織化學染色情況及其與臨床病理參數之間的關系

113例骨肉瘤患者包括男性71例（62.8%）和女性42例（37.2%）；年齡5～56歲，中位年齡20.3歲；隨訪時間7～160個月，中位隨訪時間56個月；5年的總體生存率為51.1%。113例骨肉瘤標本中有70例（61.95%）FAK過表達，染色部位主要在瘤細胞的胞漿，胞膜偶有染色（圖1）；其中42例（37.17%）pFAK染色陽性。正常松質骨標本和陰性對照均未見FAK過表達及磷酸化。統計分析顯示，骨肉瘤中FAK或pFAK與患者的性別、年齡、AJCCⅡA/ⅡB期、腫瘤部位、術式（保肢/截肢）、術前化療的腫瘤壞死百分率等臨床病理參數均無顯著相關性（表1）。

圖1 骨肉瘤與正常松質骨組織的FAK免疫組織化學染色和磷酸化FAK染色Figure 1 Immunohistochem icalstainingof FAK(A,B,E,and G)and pFAK(C,D,F,and H)proteins in osteosarcoma cellsand normalcancellousbone tissues

2.2 FAK的表達與骨肉瘤患者預后的關系

根據骨肉瘤中FAK是否過表達及其磷酸化狀態，患者分為3組：FAK-/pFAK-（A）；FAK+/pFAK-（B）；FAK+/pFAK+（C）。3組的中位OS分別是86、56、39個月，中位mFS則分別是69、45、24個月。相應3組的5年總生存率分別是78.4%、44.9%、25.8%，而5年無轉移生存率分別是55.0%、27.6%、16.9%。這提示FAK的過表達及其磷酸化可能預示患者生存時間較短，轉移發生較早。

采用Kaplan-Meier生存分析各項臨床病理特征，結果證實FAK的過表達及其磷酸化顯著縮短了OS和mFS（圖2）。進一步行Log-rank成對比較，結果顯示OS在A組和B組之間（P=0.016）、B組和C組之間（P=0.012）以及A組和C組之間（P＜0.001）均有顯著性差異。類似的mFS在A組和B組之間（P=0.042）、B組和C組之間（P= 0.001）以及A組和C組之間（P＜0.001）均有顯著性差異。另外，Kaplan-Meier生存分析還顯示術前化療效果對患者的OS和mFS亦有顯著影響（圖2），但其他臨床病理特征與患者生存期及轉移均無相關（表2）。進一步采用Cox風險比例回歸模型分析顯示，除FAK分組的B、C兩組之間mFS差異不顯著之外，FAK的過表達及其磷酸化和術前化療效果是預測骨肉瘤生存時間和轉移早晚的兩個獨立預后因素（表3）。

2.3 siRNA轉染降低了FAK和pFAK的表達

為研究FAK的細胞學效應，MG-63和143B細胞株均分別轉染了非特異錯義siRNA（陰性對照組）和3種FAK siRNA（干擾組），并通過Western blot檢測轉染效果。3個干擾組（F1，F2和F3）的MG-63與陰性對照組及空白對照組的MG-63相比，FAK表達降低了62%～70%；Tyr397磷酸化的FAK（pFAK）表達也降低了67%～75%（圖3）。143B細胞株FAK和pFAK表達下降情況與MG63相似。

2.4 FAK表達降低對細胞增殖及凋亡的作用

增殖檢測結果顯示，FAK siRNA（F1，F2和F3）干擾組的MG-63和143B細胞OD值明顯低于相應的陰性對照組和空白對照組，而陰性對照組和空白對照組之間OD值無顯著差異（表4）。凋亡檢測顯示，陰性對照組和空白對照組的凋亡率明顯低于3個干擾組。這表明抑制FAK的表達可誘導骨肉瘤細胞的凋亡并抑制其增殖（表5，圖4）。

2.5 FAK的下調抑制了骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

轉染FAK siRNA的3個干擾組遷移到Transwell膜上的細胞數明顯少于陰性對照組及空白對照組（圖5），侵襲實驗中也觀察到同樣的結果（圖6），這顯示FAK及pFAK的過表達在骨肉瘤細胞的遷移及侵襲中發揮重要作用。

表1 AJCC分期Ⅱ期的骨肉瘤患者FAK表達譜與臨床病理特征之間的關系Table 1 Association of clinicopathologicaldataand FAKexpression profiles in patientsw ith stage IIAJCCstage extrem ityosteosarcoma

圖2 FAK表達水平及術前化療效果不同的各組患者OS和mFS的Kaplan-Meier單因素分析Figure 2 Kaplan-Meier analysis of overalland metastasis-free survival for patientsw ith different FAKexpression levels and different histological responses to pre-operative chemotherapy

表2 骨肉瘤患者OS和mFS的Kaplan-Meier單因素分析Table 2 Univariate analysesof factorsassociatedw ith OSand MFS

表3 骨肉瘤患者預后的多因素生存分析Table 3 Multivariate analysisof factorsassociated w ith OSand MFS

圖3 Western blot檢測RNA干擾對于骨肉瘤細胞FAK蛋白表達及磷酸化水平的影響Figure 3 Protein expression and phosphorylation of FAKin siRNA-treated osteosarcoma,control,andmock group cells

表4 FAK的siRNA轉染對骨肉瘤細胞增殖的影響Table 4 Effectof FAKsiRNA transfection on cellproliferation

表5 FAK的siRNA轉染對骨肉瘤細胞凋亡的影響Table 5 Effectof FAKsiRNA transfection on cellapoptosis

圖4 FAK表達對骨肉瘤細胞凋亡的影響Figure 4 Effectof inhibiting FAKexpression on apoptosisofosteosarcoma cells.

圖5 FAK表達對骨肉瘤細胞遷移能力的影響Figure 5 Effect of inhibiting FAKexpression onm igration ofosteosarcoma cells

圖6 FAK表達對骨肉瘤細胞侵襲能力的影響Figure 6 Effect of inhibiting FAKexpression on invasion of osteosarcoma cells

3 討論

骨肉瘤缺乏有效的臨床預后指標。FAK是調節細胞行為的關鍵因子，而Tyr397的磷酸化則是其將細胞外基質的刺激轉化為遷移、黏附、增殖等下游細胞行為過程中的信號樞紐［5］，正是這些細胞活動導致了腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成［15］?，F觀察到消化道腫瘤、肝癌、肺癌、泌尿系統腫瘤和宮頸癌等FAK的過表達與預后不良之間存在密切關聯［8-9，16-17］，但骨肉瘤標本中FAK的表達水平與患者的臨床病理特征及生存時間的關聯尚未得到直接論證。為此，需在組織學和細胞學水平進行探討。

本研究發現113例骨肉瘤標本中FAK和pFAK的免疫組織化學染色評分差異顯著，且pFAK的陽性率明顯低于FAK，其原因可能是激活后的FAK與一些蛋白的物理性結合對其抗原產生了掩飾效應，從而降低了免疫反應特性［18-19］。單因素生存分析顯示FAK/pFAK表達譜與骨肉瘤患者的OS和mFS密切相關，A組（FAK-/pFAK-）預后最好，C組（FAK+/ pFAK+）最差，B組（FAK+/pFAK-）則居中。這提示FAK的過表達及其磷酸化在骨肉瘤的病程進展中發揮重要作用。而且，Cox比例風險模型分析進一步顯示FAK/pFAK表達譜是獨立預后因素之一。因此考慮FAK的表達水平及其磷酸化狀態具有鑒別高危骨肉瘤患者的潛在臨床應用價值。

遠處轉移是惡性腫瘤的主要死因，而瘤細胞的遷移和侵襲則是轉移的重要環節。遷移中的腫瘤細胞需與胞外基質（ECM）往復、協調的進行黏附和解離，黏著斑與肌動蛋白張力纖維的生成正是這一過程的原動力［20］。一方面，當細胞與ECM結合后，β1整合素聚集成簇形成黏著斑，FAK與黏著斑結合發生磷酸化且活性增加，通過FAK/Ras/MAPK等通路介導生長刺激信號，促進細胞骨架的重組，調控遷移。另一方面，整合素介導FAK的Tyr397自動磷酸化后，與Src家族PTK結合，形成FAK/Src復合物，FAK/Src復合物可能通過促進細胞尾部局灶黏附的分解，促進細胞遷移和存活［20-21］。不僅如此，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）和基質金屬蛋白酶（MMP）可通過降解ECM，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［22-23］。uPA和MMP的分泌過程也需FAK參與的多種信號傳導途徑的激活［24］。這些發現可以在一定程度上解釋FAK作為骨肉瘤患者潛在預后標記的原因和機理。細胞學實驗發現FAK表達量及其磷酸化水平的升高促進了143B和MG-63細胞的遷移和侵襲，用RNAi沉默FAK則產生顯著抑制效應。因此，本研究考慮激活后的FAK通過肌動蛋白細胞骨架的重構調控了黏著斑組裝和解離之間的動態平衡，并由此構成了骨肉瘤細胞遷移和侵襲的動力學基礎，進而加速了骨肉瘤的轉移。

既往研究還顯示FAK與細胞的生存關系密切。FAK的活化可激活PI3K信號通路，經PKB/AKT途徑對抗凋亡［25］。FAK還通過MAPK-ERK通路激活多種轉錄因子，代替錨定依賴性生存信號，促進腫瘤細胞的增殖和存活［26］。研究表明，ERK的激活可促進c-Fos基因轉錄，而且MAPK級聯反應活化的c-Jun N末端激酶（JNK）可以調節細胞循環G1期。JNK的活化又需要FAK與Src、p130Cas的結合以及與Crk的締和?；罨腏NK進入細胞核，使轉錄因子c-Jun磷酸化，與c-Fos形成AP-1（activator protein-1）轉錄因子復合物調節下游基因控制細胞的增殖過程［27］。本研究中，FAK siRNA抑制了143B和MG-63細胞的增殖，促進了凋亡。還有學者觀察到抑制FAK活性可誘導另一株骨肉瘤細胞SAOS-2發生凋亡［28］。因此，本研究認為FAK的表達及其磷酸化通過復雜的下游信號途徑對骨肉瘤細胞的生存和增殖發揮重要作用，并由此促進了疾病進展。

綜上所述，本研究在組織學和細胞學層面初步證實了FAK的過表達及其磷酸化與骨肉瘤的惡性程度存在顯著相關性，這可能與其促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移及侵襲活動有關。FAK/pFAK表達譜是骨肉瘤的一個獨立預后因素，可能為骨肉瘤患者的生存期及預后判斷提供一定參考。對FAK的深入研究不僅有助于揭示骨肉瘤發病機制，也可能為其臨床治療提供新方向和新靶點。

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（2017-01-05收稿）

（2017-05-07修回）

（編輯：楊紅欣校對：武斌）

Clinical significance of expression and phosphorylation of FAK in human osteosarcoma

Ke REN1,Nan YAO2,Jun LU1,Xin SHI3,Sujia WU3,Jie MA4,Chen WANG1
1Department of Orthopaedics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China;2Laboratory of TranslationalMedicine, Jiangsu Province Academy of TraditionalChinese Medicine,Nanjing 210028,China;3Department of Orthopedics,Nanjing GeneralHospital,Nanjing University,SchoolofMedicine,Nanjing 210002,China;4Departmentof Pathology,Nanjing GeneralHospital,Nanjing University,SchoolofMedicine,Nanjing210002,China

ChenWANG;E-mail:chenwang_southeast@126.com

Objective:To exam ine expression patternsof focaladhesion kinase(FAK)and itsactivated form,phosphorylated FAK(pFAK), in human osteosarcoma and to investigate the correlation of FAKexpressionw ith clinicopathologicalparametersand prognosis.Functional consequence ofmanipulating FAKprotein levelswasalso investigated in human osteosarcoma cell lines.Methods:Immunohistochemical stainingwasused to detect FAKand pFAK levels in pathologicallyarchivedmaterials from 113 patientswith primaryosteosarcoma.Kaplan-Meier survivaland Cox regression analyseswere used to evaluate prognoses.The role of FAK in cytologicalbehaviorofMG63 and 143B human osteosarcoma cell lineswasstudied via the FAKprotein knockdown with siRNA.Cellproliferation,m igration,invasiveness,and apoptosiswere assessed using cell counting kit-8,Transwell,and Annexin V/PIstainingmethods.Results:Both FAK and pFAKwere overexpressed in osteosarcoma patients.Tumor cellsexhibited cytoplasm icity and occasionalmembranous immunoreactivity for FAK.A totalof42 cases(37.17%)mainly showed expressed pFAKin cytoplasm ofosteosarcoma cells.No overexpression stainingofanti-FAKand anti-pFAKantibodieswasobserved in normalcancellousbone tissuesornegative controls.Significantdifferenceswere observed in overall survivalbetween FAK-/pFAK-and FAK+/pFAK-groups(P=0.016),FAK+/pFAK-and FAK+/pFAK+groups(P=0.012),and FAK-/pFAK-and FAK+/ pFAK+groups(P＜0.001).Allgroupsshowed similarmetastasis-free survival.Cox proportionalhazard analysisshowed that FAKexpression profile isan independent indicatorofboth overallandmetastasis-free survival.siRNA-based knockdown of FAKsignificantly reducedm igration and invasion ofMG63 and 143Bcellsand affected proliferation and apoptosis in osteosarcoma cells.Conclusion:Osteosarcomamalignancies in vitro and in vivo were correlated w ith overexpression and phosphorylation of FAK.These findingssuggest that FAKplaysan important biological role in osteosarcoma carcinogenesis.This study providesa betterunderstanding ofdiagnostic and prognostic relevance of FAK overexpression and phosphorylation in osteosarcoma patients.Therefore,FAKand pFAKcan be used as independent predictorsofoverall andmetastasis-free survivalin osteosarcoma patients.

osteosarcoma,focaladhesion kinase,prognosis,m igration,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.10.019

①東南大學附屬中大醫院骨科（南京市210009）；②江蘇省中醫藥研究院轉化醫學實驗室；③南京軍區南京總醫院骨科；④南京軍區南京總醫院病理科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81673017）和江蘇省自然科學基金項目（編號：BK2012775）資助

王宸chenwang_southeast@126.com

This workk was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81673017)and the Jiangsu Province Natural Science Foundation from the Science and Technology Departmentof Jiangsu Province ofChina(No.BK2012775)

任可專業方向為骨肉瘤血管生成擬態的研究。

E-mail：renke1997@sohu.com