HDAC5對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響

張勇 楊晨 王心治 熊玉寶 吳曙華

·基礎研究·

HDAC5對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響

張勇 楊晨 王心治 熊玉寶 吳曙華

目的：探討HDAC5在胃癌細胞中的表達及其對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響。方法：通過Western blot檢測HDAC5和Twist1在胃癌細胞株及正常胃黏膜上皮細胞中的表達。使用MTT及流式細胞術分別檢測HDAC5和Twist1對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響。結果：HDAC5和Twist1在胃癌細胞株中的表達量均明顯高于正常胃黏膜上皮細胞（P＜0.05）。沉默HDAC5的表達可使胃癌SGC-7901細胞中Twist1表達降低，并抑制其增殖、促進凋亡；而過表達HDAC5作用相反（P＜0.05）。此外，沉默Twist1可抑制SGC-7901細胞的增殖、促進其凋亡（P＜0.05）。結論：HDAC5可能通過上調Twist1的表達水平促進胃癌細胞的增殖、抑制凋亡，從而促進胃癌的發生發展。

胃癌 增殖 凋亡 HDAC5 Twist1

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，其發病率居第4位，死亡率居第2位［1］。有研究顯示，2008年全球胃癌新發989 600例，其中大約一半的病例發生于東亞地區，特別是中國［2-3］。胃癌的發生發展是一個多基因、多因素、多階段的動態演變過程，涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細胞生物學行為的改變等［4］。目前，早期胃癌主要的治療方式是手術、化療和放療。然而，胃癌根治術后約40%～60%的患者會發生復發或轉移，已轉移的患者平均生存期不到1年［5-6］。因此，進一步研究胃癌發生發展的分子機制可能為胃癌的早期診斷和治療提供新的策略，從而改善胃癌患者的預后。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases， HDACs）是通過調節組蛋白和非組蛋白的乙?；綇亩{節基因表達和染色質結構的酶［7］。HDACs家族由18個蛋白組成，根據其同源性和結構的不同可分為Ⅰ～Ⅳ類［8］。越來越多的研究表明HDACs家族可通過表觀遺傳學調節基因表達從而影響腫瘤的發生、發展和轉移等［9-10］。HDAC5屬于HDACs家族中的第Ⅱ類，其對腫瘤細胞增殖、凋亡及細胞周期等的影響已經在多種腫瘤中被證實，如髓母細胞瘤［11］、肝癌［12］和大腸癌［13］等。然而，HDAC5在胃癌發生發展中的作用目前尚缺乏報道。本實驗通過觀察HDAC5在細胞中的表達水平及其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，探討HDAC5在胃癌發生發展中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞株（MGC-803、MKN-45、SGC-7901和AGS）及正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）均購自中國生命科學研究院上海細胞庫。RPMI1640培養液及胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。蛋白提取試劑盒及ECL發光試劑盒購自江蘇凱吉生物公司。HDAC5和Twist1的一抗購自英國Abcam公司，相應的二抗及β-actin的一抗、二抗均購自美國Sigma公司?？俁NA提取試劑盒TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自北京天根公司。pcDNA3.1（+）質粒購自廣州銳博生物公司，小干擾RNA si-HDAC5和si-Twist1及RT-PCR的上下游引物由上海生工生物公司設計合成。Lipofectamine2000購自美國Invitro?gen公司。噻唑藍（MTT）試劑盒購自北京鼎國生物技術有限責任公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自美國Sigma公司，細胞凋亡試劑盒購自美國eBiosci?ence公司。FACScan流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養胃癌細胞株（MGC-803、MKN-45、SGC-7901和AGS）及正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）均使用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養液，置于37℃、含5%CO2的培養箱中進行培養。2～3 d換代1次，取對數期生長的細胞進行實驗。

1.2.2 Western blot檢測使用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。蛋白定量并煮沸后進行SDSPAGE電泳并轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。磷酸緩沖鹽溶液PBS洗膜3次后分別用HDAC5、Twist1及β-actin的一抗4℃孵育過夜。PBST洗膜3次后二抗常溫孵育1h，再次用PBST洗3次后行ECL顯影。

1.2.3 質粒構建及細胞轉染從胃癌SGC-7901細胞中提取的總RNA通過反轉錄后獲得含有HDAC5片段的cDNA，經過PCR擴增，并將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收后和表達載體pcDNA3.1進行酶切、鏈接構建pcDNA3.1-HDAC5重組質粒。PCR的引物為：上游5'-GGAATTCATGAAGTTGGAGGTGTT CGTC-3'；下游5'-CCTCGAGCGCTACTCAGGCTAGG AGCGTCTCCAC-3'。si-HDAC5和si-Twist1及質粒均利用Lipofectamine2000，按照說明書進行轉染，均設有對照組與實驗組。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖轉染48h后的SGC-7901細胞用胰酶消化并計數，以3×103個細胞/孔接種于96孔板中，置于37℃、含5%CO2的培養箱中進行培養。分別于0、24、48、72、96 h時加入濃度為0.01mol/L的 MTT 20μL，繼續培養4 h后棄掉培養液，并加入150μL二甲基亞砜（DMSO）溶解懸浮顆粒。用酶標儀在450nm波長處測定其吸光度（optical density，OD）值，即0D450。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡轉染后的細胞用胰酶消化并調整細胞密度后制成單細胞懸液，離心，棄上清；用PBS洗滌沉淀后離心，用1mL 1×Binding Buffer重懸細胞，再次離心，棄上清。加入10μLAn?nexin-V（20μg/mL）室溫下避光反應30min，再加入5μL PI（50μg/mL）避光反應10min，再加入400μL Bind?ing Buffer，立即使用FACScan流式細胞術檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。所有數據均用x±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HDAC5和Twist1在胃癌細胞株中的表達情況

通過Western blot檢測胃癌細胞株（MGC-803、MKN-45、SGC-7901和AGS）及正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）中HDAC5和Twist1的表達情況。結果提示4個胃癌細胞株中HDAC5和Twist1的表達量均明顯高于GES-1。胃癌細胞株MGC-803、MKN-45、SGC-7901和AGS中HDAC5表達量相對GES-1平均分別為2.48、3.17、3.70、2.62；Twist1的表達量相對GES-1平均分別為3.72、3.33、3.37、1.72，差異均具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 HDAC5對胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響

向胃癌SGC-7901細胞轉染小干擾RNA沉默HDAC5（si-HDAC5）及其空白對照（control），并通過Western blot檢測轉染效率（圖2A）。轉染后的細胞使用MTT檢測細胞的增殖情況，MTT的結果提示轉染si-HDAC5使SGC-7901的增殖能力明顯降低，從48h開始差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2B）。流式細胞術檢測到轉染si-HDAC5后SGC-7901細胞的凋亡率較對照組明顯增加，平均分別為20.27%和11.18%，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2C，D）。

2.3 HDAC5對胃癌SGC-7901細胞中Twist1表達量的影響

為了探索HDAC5對Twist1表達量的影響，分別向SGC-7901細胞轉染si-HDAC5和HDAC5過表達質粒。轉染后收集細胞蛋白行Western blot檢測Twist1的表達量。結果提示轉染si-HDAC5后Twist1的表達量較對照組明顯降低；相反，過表達HDAC5后Twist1的表達量明顯高于對照組（圖2A）。

圖1 HDAC5和Twist1在胃癌細胞株中的表達Figure 1 Expression ofHDAC5 and Tw ist1 in gastric cancer cell lines

圖2 HDAC5對胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響Figure 2 EffectsofHDAC5 on the proliferation and apoptosisof the gastric cancer cell line SGC-7901

2.4 Twist1對胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響

胃癌SGC-7901細胞轉染Twist1小干擾RNA（si-Twist1）后行Western blot檢測到Twist1的表達量明顯降低（圖3A）。MTT和流式細胞術檢測結果提示沉默Twist1后SGC-7901細胞的增殖能力明顯降低、凋亡率增加，差異具有統計學意義。另外，過表達HDAC5使SGC-7901細胞的增殖能力升高、凋亡率降低，差異具有統計學意義（P＜0.05、圖3B，C，D）。

圖3 Twist1對胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響Figure 3 Effectsof Tw ist1 on the proliferation and apoptosisof the gastric cancer cell line SGC-7901

3 討論

胃癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，胃癌的發生與多種因素相關，如飲食習慣、環境因素、慢性胃炎和幽門螺桿菌感染等［14］。盡管近年來其治療手段取得了新的進展，胃癌的死亡率仍然居高不下，主要是因為胃癌的早期診斷率較低［15］。因此進一步研究胃癌發生發展的分子機制將有利于胃癌的早期診斷和治療。許多研究表明HDAC家族是細胞增殖、凋亡及細胞周期的重要調節因子，其異常表達與腫瘤的發生發展密切相關［16］。進而，多種HDAC的抑制劑被證實可抑制腫瘤細胞的生物學行為，如HDAC抑制劑（S）-8可通過破壞HDAC6-PP1復合物抑制黑色素瘤細胞的生長和促進其凋亡［17］；HDAC抑制劑WJ可通過促進c-Cbl的表達抑制肺癌細胞的增殖［18］。作為HDACs家族中的第Ⅱ類，HDAC5在多種腫瘤的發生發展中也發揮了重要的作用。本研究旨在探討HDAC5在胃癌細胞中的表達情況及其對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響。首先，通過Western blot檢測到4個胃癌細胞株中HDAC5的表達量均明顯高于正常胃黏膜上皮細胞，提示HDAC5可能在胃癌的發生發展中起到重要的作用。其次，通過小干擾RNA沉默HDAC5后研究其對SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響，結果提示沉默HDAC5使SGC-7901細胞的增殖能力降低、凋亡率增加；相反，過表達HDAC5后可促進SGC-7901細胞的增殖、抑制其凋亡。以上實驗結果表明HDAC5可通過促進胃癌細胞的增殖、抑制凋亡從而促進胃癌的發展。

Twist1是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子，與腫瘤細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程密切相關，在腫瘤進展中發揮重要作用［19-20］。Twist1在腫瘤發展中的作用也被相繼報道，如Twist1可通過NF-κB信號通路調節乳頭狀甲狀腺癌的EMT［21］；Twist1可促進大腸癌細胞的增殖和抑制凋亡，且Twist1的高表達可使大腸癌患者的預后更差［22］。Twist1在胃癌中的研究也有報道，如Sung等［23］報道了Twist1與胃癌患者的不良預后密切相關；Qian等［24］研究發現Twist1可通過上調FoxM1的表達促進胃癌細胞的增殖。以上研究均表明Twist1在胃癌發生發展中起著重要作用。

本研究首先通過Western blot檢測到胃癌細胞株中Twist1的表達量明顯高于正常胃黏膜上皮細胞。其次高表達或沉默HDAC5可分別增加或降低Twist1在SGC-7901細胞中的表達量。最后，通過小干擾RNA沉默Twist1可使胃癌SGC-7901細胞的增殖能力減低，凋亡率增加。因此，以上結果表明HDAC5可能通過上調Twist1的表達水平從而促進胃癌SGC-7901細胞的增殖、抑制凋亡，參與胃癌的發生發展。然而，HDAC5在胃癌細胞中上調Twist1的機制尚不清楚，需要進一步的研究來揭示。Twist1作為一個促癌基因，可抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和侵襲等，其表達受到多種信號通路的調控，如NF-κB、IGF-1、TGF-β/Wnt信號通路以及MXC2和STAT3［25］。因此，HDAC5可能通過調控NF-κB、IGF-1、TGF-β/Wnt信號通路，或者MXC2和STAT3等上調HDAC5從而發揮其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，HDAC5在胃癌細胞中明顯高表達，且其高表達可通過上調Twist1的表達水平促進胃癌細胞的增殖、抑制凋亡，從而促進胃癌的發生發展。本研究結果提示HDAC5可能作為胃癌早期診斷的一個標志物，并可能為胃癌的治療提供新的策略。然而HDAC5對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響及與胃癌患者預后的相關性還需進一步探討。

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（2016-10-26收稿）

（2017-05-16修回）

（編輯：武斌校對：楊紅欣）

Effects of HDAC5 on the proliferation and apoptosis of the gastric cancer cell line SGC-7901

Yong ZHANG,Chen YANG,Xinzhi WANG,Yubao XIONG,Shuhua WU
Department of Emergency,Second Affiliated Hospital,Suzhou University,Suzhou 215000,China

ShuhuaWU;E-mail:peopledoctor@163.com

Objective:To investigate HDAC5 expression in gastric cancer cell lines and its effects on the proliferation and apoptosis of the gastric cancer line SGC-7901.Methods:The expression patternsof HDAC5 and Tw ist1 in gastric cancer cell linesand normalgastric mucosal cellswere detected byWestern blot.The effects of HDAC5 and Tw ist1 on the proliferation and apoptosis of SGC-7901 cells were analyzed by MTTand flow cytometry,respectively.Results:The expression of HDAC5 and Tw ist1 in gastric cancer cell lineswere significantly higher than that in normalgastricmucosal cells(P＜0.05).HDAC5 knockdown significantly down-regulated Tw ist1 expression,inhibited cellproliferation,and induced apoptosis in SGC-7901 cells,whereas HDAC5 overexpression exhibited an opposite effect (P＜0.05).Moreover,Twist1 knockdown significantly inhibited cellproliferation and induced apoptosis in SGC-7901 cells(P＜0.05).Conclusion:HDAC5may promote cellproliferation and inhibitapoptosis in gastric cancer cellsby upregulating Tw ist1 expression,thus promoting the initiation and developmentofgastric cancer.

gastric cancer,proliferation,apoptosis,HDAC5,Tw ist1

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.10.239

蘇州大學附屬第二醫院急診科（江蘇省蘇州市215000）

吳曙華peopledoctor@163.com

張勇專業方向為急診醫學的基礎和臨床研究。

E-mail：hmscsj@yeah.net