p-STAT3通過上皮間質轉化影響結腸癌的轉移性研究*

韓聰孫保存趙秀蘭張艷輝古強劉芳趙楠吳麗麗

·基礎研究·

p-STAT3通過上皮間質轉化影響結腸癌的轉移性研究*

韓聰①孫保存①②③趙秀蘭①③張艷輝②古強①③劉芳①趙楠①吳麗麗③

目的：研究p-STAT3的活化在結腸癌中的表達與Snail、MMP2的相關性，及其在離體細胞實驗中激活受抑后對結腸癌細胞遷移能力的影響并探討其機制。方法：免疫組織化學染色檢測p-STAT3與Snail、MMP2的表達及其相關性，分析三者與TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移及分化程度之間的關系；MTT實驗篩選AG490對增殖無影響的濃度和時間，并用該濃度和時間進行后續實驗；采用Western blot法檢測AG490抑制p-STAT3活化后STAT3、Snail、MMP2蛋白表達情況；劃痕實驗觀察p-STAT3活化受抑后，結腸癌細胞遷移情況。結果：免疫組織化學染色結果表明，p-STAT3的表達與Snail、MMP2均存在相關性，且均與淋巴結轉移相關（P＜0.05）。在兩個結腸癌細胞系中，通過MTT實驗，選出10μM作為AG490的最佳作用濃度，并采用該濃度進行后續實驗。AG490抑制p-STAT3活化后Snail、MMP2表達明顯下降，而STAT3總蛋白表達無明顯變化。且當AG490抑制p-STAT3活化后，細胞的遷移能力明顯下降。結論：p-STAT3可以通過上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進結腸癌的轉移。

結腸癌 上皮間質轉化 p-STAT3 Snai l MMP2 AG490

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，嚴重危害人類生命健康，腫瘤的快速增殖、侵襲和轉移是導致患者預后較差的原因。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤的發生、發展以及侵襲和轉移中發揮重要作用。目前較為公認的調控EMT的轉錄因子主要包括Snail［1］、ZEB1［2］、Twist［3］等，近年來研究發現，信號轉錄因子和轉錄激活子3（signal transducer and activatorof transcription 3，STAT3）信號的異常激活也與腫瘤的EMT相關［4］。EMT的發生需要降解細胞外基質，金屬基質蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是降解細胞外基質的關鍵成員［5］。本研究采用免疫組織化學染色法檢測結腸癌組織中p-STAT3與Snail及MMP家族重要成員MMP2蛋白的表達和相關性，分析三者與TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移以及分化程度的關系，并利用細胞學實驗進一步闡述阻斷p-STAT3活化抑制結腸癌細胞轉移的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本選取2002年3月至2005年12月于天津醫科大學總醫院行手術切除，病理診斷為結腸癌且隨訪資料完整的患者組織標本65例。其中男性28例，女性37例，年齡為28～83歲；Dukes分期A/ B期26例，C/D期39例；淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移34例；遠處轉移37例，無遠處轉移28例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期25例，Ⅲ/Ⅳ期40例；高分化18例，中分化27例，低分化20例。所有病例均為手術標本且患者未接受放、化療。本實驗經過醫院倫理委員會審核通過，并經全部患者及其家屬知情同意。

1.1.2 細胞系人結腸癌細胞株HCT116、HT29細胞系購自中國醫學科學院基礎醫學院細胞資源中心。

1.1.3 實驗試劑IMDM（ISCOVE'smodified DMEM）、DMEM/F12（Dulbecco'smodified Eagle'smedium：nutrient mixture F-12）培養基及MTT試劑盒均購自南京凱基生物公司，胎牛血清FBS購自美國Gibco公司。AG490購自美國Selleck公司。兔抗人p-STAT3（Tyr705）抗體購自美國CST公司，鼠抗人STAT3抗體購自美國SantaCruz公司；兔抗人Snail抗體購自美國Abcam公司，兔抗人MMP2抗體購自美國ProteintechTM公司。兔抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色結腸癌組織石蠟標本連續切片脫蠟水化，使用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，微波修復，于室溫下血清封閉，一抗置于4℃冰箱過夜，次日常溫下孵育二抗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。陰性對照一抗用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）代替。采用Mattern積分法［6］判斷染色結果，陽性細胞百分率：每例標本隨機選取10個代表性的高倍視野（×400）分別計數100個腫瘤細胞的平均值，＜10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～100%為3分。染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分率得分和染色強度得分相加，結果＞3為陽性，≤3為陰性。

1.2.2 細胞培養本實驗中所有細胞均按照常規貼壁細胞培養模式進行培養，HCT116細胞系培養基為90%IMDM+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），HT29細胞系培養基為95%DMEM-F12+5%胎牛血清+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養箱中培養。待細胞融合約80%時，胰酶消化傳代以保持細胞增殖活力。

1.2.3 MTT實驗MTT法檢測AG490對HCT116、HT29細胞生長的影響。常規培養HCT116、HT29細胞進入對數期后，配制成5×104/mL的細胞懸液，取3塊96孔板，每孔加入100μL細胞懸液，實驗組分別加入終濃度為10、20、30、40、50μM的AG490培養液，各組溶液中二甲基亞砜（DMSO）體積分數不超過0.1%；對照組加入等量DMSO溶液，空白對照組僅加入完全培養基，不加細胞懸液。實驗組和對照組均設5個復孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱內分別培養24、48、72 h后，分別加入MTT 50μL繼續培養4 h，吸去孔內液體，加入150μLDMSO，置于搖床上低速振蕩5min，使紫色結晶物充分溶解，于酶標儀490 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值。實驗組：HCT116和HT29細胞分別用AG490處理（HCT116-AG490組、HT29-AG490組）；對照組：HCT116和HT29細胞加等量的DMSO處理（HCT116組、HT29組）。選出不影響細胞增殖的最適濃度及最佳作用時間進行后續實驗。

1.2.4 Western blot檢測細胞裂解液RIPA-SDS裂解細胞，提取細胞總蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠80 V恒壓電泳2 h，之后250mA恒流1.5 h將目的蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗，4℃孵育過夜；次日室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入相應二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，發光液A和B以1:1比例混勻后顯影。用Image-J測量每個條帶的灰度值，以β-actin為內參，根據目的條帶與內參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 劃痕實驗將對數增長期的HCT116、HT29細胞接種于六孔板，貼壁后，實驗組給予10μM AG490處理，對照組加等量的DMSO，作用48 h后，用100μL移液槍頭在各孔中央細胞表面垂直劃痕，PBS沖洗脫落的細胞，顯微鏡下拍照記為0，此后24、48 h分別拍照。觀察細胞遷移變化情況并測量遷移距離，計算遷移率。

1.2.6 細胞形態觀察AG490作用細胞48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并比較對照組和實驗組細胞形態變化。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，兩因素之間相關性采用Spearman相關性分析。符合正態分布的計量資料采用±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，不同時間點兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 p-STAT3、Snail、MMP2在結腸癌中的表達及其與TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移和分化程度的關系

p-STAT3的陽性染色主要表達于癌細胞核，少量表達于胞漿，而癌組織間質呈現陰性，Snail的陽性染色主要定位于癌細胞核，MMP2的陽性染色主要定位于癌細胞胞漿（圖1）。p-STAT3、Snail、MMP2的陽性表達率分別是61.5%、56.9%、53.8%。在65例結腸癌組織中，p-STAT3表達與Snail、MMP2表達存在顯著相關性（表1），且p-STAT3、Snail、MMP2與TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移均存在顯著相關性，而與腫瘤的分化程度均無相關（表2）。

圖1 p-STAT3、Snail、MMP2在結腸癌組織中的陽性和陰性表達（IHC×200）Figure 1 Positive and negative expression ofp-STAT3,Snail,and MMP2 in colorectalcancer tissues(IHC×200)

表1 p-STAT3與Snai l、MMP2的相關性（n=65）Table 1 Correlation among p-STAT3 and SnailaswellasMMP2(n=65)

2.2 不同濃度的AG490對兩種結直腸癌細胞增殖的抑制作用

MTT實驗結果顯示，AG490對HCT116細胞、HT29細胞均具有抑制增殖的作用，且隨AG490的濃度增大和作用時間的延長，抑制作用增強。10μM AG490處理24、48 h對細胞生長的抑制作用與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。且48 h的作用時間更長，故選擇10μM的AG490作為后續實驗的最適濃度，48 h為最佳作用時間（圖2）。

2.3 AG490對HCT116、HT29細胞p-STAT3、STAT3、Snail、MMP-2蛋白表達的影響

AG490處理HCT116、HT29細胞后，與對照組相比p-STAT3、Snail及MMP-2蛋白表達量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），而與STAT3蛋白表達量的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖3）。

2.4 AG490對HCT116、HT29細胞遷移能力的影響

劃痕實驗可以用于評價AG490對HCT116細胞和HT29細胞遷移能力的影響。結果顯示，與對照組相比，HCT116-AG490實驗組遷移率明顯低于HCT116組，HT29-AG490實驗組遷移率明顯低于HT29組，實驗組遷移能力明顯減弱，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 AG490對結腸癌細胞形態的影響

與對照組相比，加入AG490的HCT116細胞和HT29細胞，細胞形態均發生了不同程度縮短、變粗（圖5）。

表2 p-STAT3、Snai l、MMP2與TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及分化程度的相關性（n=65）Table 2 Correlation ofp-STAT3,Snailand MMP2w ith TNM stage,lymph nodemetastasis,distantmetastasis,and differentiation(n=65)

圖2 各濃度AG490對結腸癌細胞的生長抑制作用Figure 2 Effectsofdifferent AG490 concentrationson colorectalcancer celllines

圖3 Western blot檢測AG490作用的結腸癌細胞p-STAT3，STAT3，Snail，MMP2的表達變化Figure 3 Changes in the protein expression ofp-STAT3,STAT3,Snail,and MMP2 in colorectalcancer cellsafter AG490 treatment

圖4 AG490抑制p-STAT3活化對結腸癌細胞遷移能力的影響Figure 4 Effects of AG490 treatment on the m igration capacity of colorectalcell lines

?圖5 HCT116、HCT116-AG490、HT29、HT29-AG490細胞形態學變化（鏡像×400）Figure 5 Significant changes in HCT116-control, HCT116-AG490,HT29-control,and HT29-AG490 cells (image×400)

3 討論

結直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國，其發病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第3位和第5位，并呈上升趨勢［7］，嚴重威脅人類生命健康。其高發病率和死亡率給社會帶來了巨大的經濟負擔。

JAK/STAT信號途徑廣泛參與人體生理和病理活動，是一條重要的細胞信號轉導通路。其在乳腺癌［8］、胃癌［9］、皮膚癌［10］等多種腫瘤中存在異?；罨癄顟B。有研究表明，STAT3組成型活化即p-STAT3的異?；罨c腫瘤的侵襲轉移密切相關［11］。并且JAK/ STAT信號通路的異?；罨軌蛘{節多種腫瘤的增殖、凋亡［12］和血管生成［13］及血管生成擬態形成［9］等多種生物學行為。有研究表明，在結腸癌中也存在著p-STAT3的異?；罨?，并且可能通過影響HIF-1α的轉錄來影響結腸癌的發生［14］。本研究的免疫組織化學實驗結果也同樣證明，p-STAT3在結腸癌中存在高表達的現象，且p-STAT3與轉錄因子Snail、金屬基質蛋白酶MMP2的表達存在顯著相關性（P＜0.05）。并且三者均和結腸癌的淋巴結轉移及遠外轉移相關，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

EMT是惡性腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的一種重要方式，是指上皮來源的腫瘤細胞上皮樣表型向間質樣細胞表型轉變，其重要一環是細胞外基質的降解，而MMP2是導致基質降解，腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的一項重要因素［15］。Snail是最早發現的EMT轉錄因子，它的異常高表達可以誘導EMT發生，促進腫瘤的遷移侵襲［1］。

AG490作為一種JAK激酶競爭性抑制劑，可以有效地抑制STAT3活化［16］。有研究表明，AG490能夠抑制肝癌細胞STAT3的活化和Snail的表達來抑制其侵襲轉移［17］。在胰腺癌中也有相似的發現，AG490可以抑制胰腺癌細胞的STAT3活化和VEGF表達來抑制其侵襲轉移［18］。本研究的Western blot檢測結果也有相似的發現，AG490作用于結腸癌細胞HCT116和HT29細胞系時，p-STAT3活化減少，Snail和MMP2的表達下降，通過劃痕實驗發現細胞的遷移能力下降。同時通過觀察細胞形態，AG490使細胞縮短、變粗，抑制了EMT。Western blot檢測、劃痕實驗及細胞形態學觀察結果說明AG490可以抑制p-STAT3活化，并通過降低Snail和MMP2的表達來抑制結腸癌的侵襲遷移。

本研究表明，p-STAT3與結腸癌的淋巴結轉移及遠處轉移密切相關。在結腸癌組織和離體細胞培養Western blot檢測均發現p-STAT3的活化與Snail和MMP2表達有關。P-STAT3的過度激活可能通過影響Snail和MMP2的表達，誘導EMT發生，進而促進腫瘤的轉移。抑制p-STAT3的過度激活可能為結腸癌的診斷和治療提供新的思路和啟示。

[1]Merikallio H,Turpeenniem i-Hujanen T,P??kk?P,et al.Snail promotes an invasive phenotype in lung carcinoma[J].Respir Res, 2012,13:104.

[2]Cao LY,Yang J,Fu XG,etal.The M icroRNAm iR-205 inhibitsepithelial-messenchymal transition in HK-2 cells by down-regulating ZEB1 and ZEB2 expressions[J].Nan Fang YiKe Da Xue Xue Bao,2016,36 (12):1700-1705.

[3]LiW,Wang Z,Zha L,et al.HMGA2 regulates epithelial-mesenchymal transition and the acquisition of tumor stem cell properties through TWIST1 in gastric cancer[J].Oncol Rep,2017,37(1):185-192.

[4]HajimoradiM,Mohammad HZ,Ebrahim iM,etal.STAT3 isoveractivated in gastric cancer stem-like cells[J].Cell J,2016,17(4):617-628.

[5]Mao W,Sun Y,Zhang H,et al.A combinedmodality of carboplatin and photodynam ic therapy suppresses epithelial-mesenchymal transition and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)/MMP-9 expression in HEp-2 human laryngeal cancer cells via ROS-mediated inhibition of MEK/ERK signalling pathway[J].Lasers Med Sci,2016, 31(8):1697-1705.

[6]BittnerM,Meltzer P,Chen Y,etal.Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling[J].Nature,2000,406(6795):536-540.

[7]Lv Q,Xing SY,Zhao ZH,etal.Research and prospectof colon cancer [J].Chin JLabor Diag,2009,(8):1134-1137.[呂強,邢沈陽,趙志輝,等.結腸癌的研究現狀及展望[J].中國實驗診斷學,2009,(8):1134-1137.]

[8]Aleskandarany MA,AgarwalD,Negm OH,et al.The prognostic significance of STAT3 in invasive breast cancer:analysisof protein and mRNA expressions in large cohorts[J].Breast Cancer Res Treat, 2016,156(1):9-20.

[9]Song YY,Sun LD,Liu ML,etal.STAT3,p-STAT3 and HIF-1αare associated w ith vasculogenic m im icry and impact on survival in gastric adenocarcinoma[J].Oncol Lett,2014,8(1):431-437.

[10]Suiqing C,Min Z,Lirong C.Overexpression of phosphorylated-STAT3 correlated w ith the invasion and metastasis of cutaneous squamouscellcarcinoma[J].JDermatol,2005,32(5):354-360.

[11]Cui Y,Li YY,Li J,et al.STAT3 regulates hypoxia-induced epithelial mesenchymal transition in oesophageal squamous cell cancer[J]. OncolRep,2016,36(1):108-116.

[12]LiX,Bhaduri-McIntosh S.A central role for STAT3 in gammaherpesvirus-Life cycle and-diseases[J].FrontM icrobiol,2016,7:1052.

[13]Haura EB,Turkson J,Jove R.Mechanisms of disease:Insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcription in cancer[J].NatClin PractOncol,2005,2(6):315-324.

[14]Zhang XQ,ShiYL,Jia XY,etal.Expression and clinicalsignificance of p-STAT3 and hypoxia inducible factor in colon cancer[J].Chin J Geront,2014,(15):4121-4123.[張曉芹,史迎莉,賈小云,等.p-STAT3與缺氧誘導因子在結腸癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國老年學雜志,2014,(15):4121-4123.]

[15]Liu J,Ben QW,Yao WY,et al.BMP2 induces PANC-1 cell invasion by MMP-2 overexpression through ROSand ERK[J].Front Biosci(Landmark Ed),2012,17:2541-2549.

[16]LiCH,Zhao JX,Sun L,et al.AG490 inhibits NFATc1 expression and STAT3 activation during RANKL induced osteoclastogenesis[J].Biochem BiophysResCommun,2013,435(4):533-539.

[17]Zhou JJ,Meng Z,He XY,et al.Hepatitis Cvirus core protein increases Snailexpression and induces epithelial-mesenchymal transition through the signaltransducerand activatorof transcription 3 pathway in hepatoma cells[J].HepatolRes,2017,47(6):574-583.

[18]Yang G,Qiu ZJ,Zhang F,et al.Effect sofactivation and inhibition of Stat3 signaling pathway on invasion of human pancreatic cancer cell[J].Tumor,2009,(7):645-649.[楊光,裘正軍,張放,等.激活和抑制Stat3信號途徑對胰腺癌細胞侵襲能力的影響[J].腫瘤,2009, (7):645-649.]

（2017-01-23收稿）

（2017-05-10修回）

（編輯：武斌校對：孫喜佳）

p-STAT3 promotes colorectal cancer metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition

Cong HAN1,Baocun SUN1,2,3,Xiulan ZHAO1,3,YanhuiZHANG2,Qiang GU1,3,Fang LIU1,Nan ZHAO1,Lili WU3
1Departmentof Pathology,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300070,China;2Departmentof Pathology,NationalClinicalResearch Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's ClinicalResearch Center for Cancer;Tianjin 300060, China;3Departmentof Pathology,Tianjin Medical University GeneralHospital,Tianjin 300052,China

Baocun Sun;E-mail:sunbaocun@aliyun.com

Objective:To determ ine p-STAT3 expression in 65 casesof colorectalcancerand its correlationw ith Snailand MMP2 and to explore themechanism ofp-STAT3 activation in colorectalcancer cellsby inhibiting itsactivation in vitro.Methods:Immunohistochemical techniquewasadopted to exam ine the expression levelsof p-STAT3,Snail,and MMP2.MTTassaywasused to explore the effects of diluting AG490,which doesnotaffect cellproliferation.Western blotwasused to exam ine the expression levelsof p-STAT3,STAT3, Snail,and MMP2.Wound healing assaywasemployed to evaluate them igration of colorectalcancer cells.Results:p-STAT3 expression was significantly correlated w ith Snail and MMP2 expression.Moreover,p-STAT3 expression was significantly correlated w ith TNM stage,lymph nodemetastasis,and distantmetastasis in colorectal cancer tissues(P＜0.05)but not w ith tumor differentiation.Treatmentw ith 10μM AG490 for 48 h did not significantly affect cellproliferation in the controland experimentalgroups(P＞0.05).STAT3 expression wasnot significantly changed when p-STAT3 expression was inhibited by AG490.Meanwhile,the expression levelsof Snail and MMP2 were down-regulated,and them igration ability of colorectal cancer cellswas significantly reduced.Conclusion:p-STAT3 promotescolorectalcancermetastasisby regulating the processofepithelial-mesenchymaltransition.

colorectalcancer,epithelial-mesenchymaltransition,p-STAT3,Snail,MMP2,AG490

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.10.079

①天津醫科大學病理學教研室（天津市300070）；②天津醫科大學腫瘤醫院病理科；③天津醫科大學總醫院病理科

*本文課題受國家自然科學基金面上項目（編號：81572872）和國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）資助

孫保存sunbaocun@aliyun.com

This work was supported by the NationalNaturalScience Foundation ofChina(No.81572872)and the Key Projectof the NationalNaturalScience Foundation ofChina(No.81230050)

韓聰專業方向為腫瘤病理學。

E-mail：13516296540@163.com