組織芯片技術在乳腺癌HER2 FISH檢測中的可靠性分析

陳玉娟,張偉璇,朱桂璐,張 偉

(皖南醫學院弋磯山醫院病理科,蕪湖 241001;*通訊作者,E-mail:weisky1981@163.com)

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組織芯片技術在乳腺癌HER2 FISH檢測中的可靠性分析

陳玉娟,張偉璇,朱桂璐,張 偉*

(皖南醫學院弋磯山醫院病理科,蕪湖 241001;*通訊作者,E-mail:weisky1981@163.com)

目的 探討乳腺癌組織芯片HER2 FISH檢測結果的可靠性。 方法 收集192例乳腺癌病例,制成直徑0.9 mm的組織芯片,進行HER2 FISH檢測,對照常規石蠟切片的檢測結果,進行統計學分析。 結果 組織芯片中HER2 FISH的陽性率為25.0%(48/192),常規石蠟切片的陽性率為26.0%(50/192),配對χ2檢驗顯示兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)。有4例乳腺癌病例存在檢測結果的不一致,其中常規石蠟切片檢測為點狀擴增病例中有3例組織芯片檢測為陰性,常規石蠟切片檢測為無擴增病例中有1例組織芯片檢測為點狀擴增。 結論 組織芯片技術在乳腺癌HER2 FISH檢測中的可靠性強,但對于臨床中乳腺癌病例建議使用常規石蠟切片進行HER2 FISH檢測。

組織芯片; 乳腺癌; HER2; FISH

Analysis of the reliability of tissue microarrays in the research of HER2 FISH detection of breast cancer

CHEN Yujuan,ZHANG Weixuan,ZHU Guilu,ZHANG Wei*(DepartmentofPathology,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China;*Correspondingauthor,E-mail:weisky1981@163.com)Abstract：ObjectiveTo explore the reliability of tissue chip in the research of human breast cancer HER2 FISH detection.MethodsTissue microarray(TMA) with 0.9 mm in diameter tissue core was constructed from 192 cases of human breast cancer.HER2 was detected by FISH technique.At the same time the results of the tissue microarrays were compared with those of the routine paraffin section.ResultsThe positive rates in HER2 FISH detection of breast cancer were 25.0% and 26.0% by TMA and the routine paraffin section,respectively,and there was no statistical difference(P>0.05).But the results of 4 cases were different between the two methods.Three cases of dot expansion using the routine paraffin section were negative by TMA,and 1 case of dot expansion using TMA showed no expansion by the routine paraffin section.ConclusionTissue microarrays could be a reliable tool in the application of human breast cancer HER2 FISH detection,but it is better to use the routine paraffin section in the clinical.Key words: tissue microarrays; breast cancer; HER2; FISH

組織芯片(tissue chip,TC)即微縮組織切片,是將多量組織標本高密度排列成組織微陣列(tissue microarrays,TMA)的形式,具有體積小、信息量大的特點,一次實驗即可獲得大量結果。1998年Kononen等[1]首次在Nature雜志上報道了這一高通量生物芯片技術。與傳統方法相比較,組織芯片具有實驗條件一致性強、誤差性小和準確性高的優點。但組織芯片本身制作過程冗繁,缺乏標準化流程。乳腺癌HER2 FISH檢測已經成為一種常規病理工作,能否對多例乳腺癌標本利用組織芯片技術進行HER2 FISH檢測是一項具有實際臨床意義的工作。本研究參閱文獻資料,對組織芯片的制作流程進行優化,制備出高質量的乳腺癌組織芯片,再探討組織芯片技術在乳腺癌HER2 FISH檢測中的可靠性,以期為臨床病理工作提供幫助。

1 資料和方法

1.1 病例來源

調取皖南醫學院弋磯山醫院病理科2012-11～2016-11的所有行常規石蠟切片HER2 FISH檢測的乳腺癌病例,共214例,其中男性1例,女性213例,年齡25-75歲,平均49.9歲;其中包括HER2基因簇狀擴增38例,HER2基因點狀擴增17例,HER2基因無擴增159例。

1.2 組織芯片的制作

1.2.1 空白蠟塊制作 將徠卡石蠟(Leica Histowax)與62-67 ℃純蜂蠟(上海華申康復器材廠)混合(比例為2 ∶8),98 ℃溫箱內融化50 min,去除底部沉渣,用蠟塊制作模具制成34 mm×24 mm×10 mm大小空白蠟塊。

1.2.2 受體蠟塊制作 先用直尺和刀片在空白蠟塊上畫格,橫豎間距均為2 mm,距邊緣約3 mm,置65 ℃溫箱約5 min(使受體蠟塊受熱稍軟化),再應用組織微陣列制作儀(北京博醫康醫療儀器有限公司),在已畫好的方格內打孔,每個微孔的直徑為0.9 mm,深約3 mm,制作成6×8 陣列的受體蠟塊。

1.2.3 供體蠟塊的取樣及點樣 先用顯微鏡觀察常規石蠟HE切片并標記腫瘤組織,以切片的標記處作為供體蠟塊的取樣位點,再用組織芯片儀鉆取出該處腫瘤組織,按順序依次放入受體蠟塊的孔內。受體蠟塊左上角的第1個孔內放肝組織為坐標,同時在筆記本上繪制網格圖,記錄下每個網格內標本病理號。

1.2.4 融蠟 將制作好的受體蠟塊(組織面朝上)再次放進蠟塊制作模具中將其固定住,放入65 ℃溫箱30 min,受體蠟可逐漸溶解浸潤于組織芯周圍,將受體蠟塊取出室溫稍冷卻,將組織面朝下置于模具的鐵板上,用另一鐵板輕壓使組織面平整;再將其置于冰箱冷凍后取出切片,切片過程與常規石蠟組織切片基本相同。

1.3 HER2 FISH檢測方法

對制好的乳腺癌組織芯片受體蠟塊進行雙探針HER2熒光原位雜交染色,預雜交液代替雜交液為陰性對照。步驟如下:將組織芯片受體蠟塊切成3-4 μm厚白片,切好的白片放入60 ℃烤箱烘烤2 h,常規脫蠟;使用3%H2O2甲醇溶液室溫濕盒內孵育15 min,消除內源性過氧化物酶活性,阻斷背景中非特異性染色;再用蒸餾水(pH7.0)沖洗3次×3 min;滴加蛋白酶K室溫濕盒內孵育15 min(同時運用熒光顯微鏡觀察細胞消化程度),使蛋白成分消化而充分暴露細胞核及DNA片斷;使用原位雜交專用PBS(pH7.4)沖洗3次×5 min,蒸餾水沖洗2次×3 min;滴加預雜交液,將濕盒置入38 ℃水浴孵育3 h,阻斷背景非特異性染色;去除多余液體,滴加雜交液,原位雜交專用蓋玻片封蓋組織,將濕盒放入38 ℃水浴孵育過夜;揭去蓋玻片,37 ℃ 2×SSC緩沖液沖洗2次×5 min,37 ℃ 0.5×SSC緩沖液沖洗1次×15 min,最后用37 ℃ 0.2×SSC緩沖液沖洗2次×5 min;滴加封閉液,操作完成。乳腺癌HER2 FISH 檢測試劑盒購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司。

1.4 結果判定

熒光顯微鏡下觀察HER2基因拷貝數與17號染色體的比值,判定標準參照文獻[2]。HER2/CEP17≥2.0或HER2/CEP17<2.0但是HER2平均拷貝數>6判為陽性,HER2/CEP17<2.0判為陰性。

1.5 統計學分析

應用 SPSS 13.0 統計軟件包進行處理,采用配對χ2檢驗,P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片石蠟塊及切片染色

所制備的組織芯片石蠟塊共6個,均行HE切片染色及原位雜交檢測,觀察芯片的脫片率。脫片率為芯片脫落的點數與標本總點數的比值。HE染色切片脫片率為9.35%(20/214);FISH檢測脫片率為10.3%(22/214),FISH檢測時脫片的22例包括18例無擴增和4例擴增(3例簇狀擴增及1例點狀擴增)(見圖1)。從組織芯的脫片率來看,普通石蠟與純蜂蠟比例為2 ∶8優于比例8 ∶2。

A,B.普通石蠟與純蜂蠟比例為2 ∶8制成6×8 陣列的組織芯片蠟塊及HE切片;C,D.普通石蠟與純蜂蠟比例為8 ∶2制成6×9 陣列的組織芯片蠟塊及HE切片圖1 乳腺癌組織芯片及HE染色Figure 1 Microarrays of tissue chip and HE staining of breast cancer tissues

2.2 組織芯片與常規石蠟切片HER2 FISH檢測結果比較

常規石蠟切片FISH檢測為簇狀擴增的38例乳腺癌經組織芯片檢測后均為簇狀擴增；常規石蠟切片FISH檢測為無擴增的141例乳腺癌組織芯片檢測后140例為無擴增，其中1例兩者檢測結果不一致(見圖2)。192例乳腺癌組織芯片中HER2 FISH的陽性率為25.0%(48/192),常規石蠟切片的陽性率為26.0%(50/192),采用配對χ2檢驗P=0.625,依據α=0.05的水準,兩者之間差異無統計學意義(P>0.05),提示組織芯片與常規石蠟切片FISH檢測結果基本一致。

A.常規石蠟切片(HE染色,×200);B.組織芯片(HE染色,×400);C.組織芯片HER2基因簇狀擴增(FISH法);D.常規石蠟切片(HE染色,×200);E.組織芯片(HE染色,×400);F.組織芯片HER2基因無擴增(FISH法)圖2 乳腺癌常規石蠟切片和組織芯片HE染色及HER2 FISH檢測Figure 2 The routine paraffin section and tissue microarray for breast cancer by HE staining and HER2 FISH test

3 討論

1986年Battifora等[3]制造出組織芯片的前身,即多組織塊和多組織片,是將100多個各類小組織包埋在同一個蠟塊里,然后切片,再將切片裱于普通玻片而制成。1998年Kononen等[1]首次采用組織芯片機,通過鉆洞取樣的方法,將645個乳腺癌蠟塊制成了組織芯片用于免疫組織化學檢測。此后,組織芯片已在多種腫瘤中得到應用[4-7]?？梢愿鶕煌男枰瞥烧＝M織芯片和腫瘤組織芯片等不同類型的芯片,還可以對其進行HE染色、組織化學染色、免疫組織化學檢測及熒光原位雜交檢測等不同的檢查,在教學、科研及室內質控等方面的體現出重要價值。

組織芯片的制作方法靈活多樣,本研究對組織芯片的制作過程進行了適當優化后提高了組織芯片的完成質量。在制作受體蠟塊時,比較了普通石蠟與純蜂蠟不同比例(比例為8 ∶2及2 ∶8)及不同組織密度(6×9 陣列及6×8 陣列)制成的組織芯片蠟塊及HE切片的效果,最終認為使用普通石蠟與純蜂蠟比例為2 ∶8制成6×8 陣列的組織芯片蠟塊及HE切片效果較好。若普通石蠟含量高,受體蠟塊在組織芯片制作過程中易裂開;若使用純蜂蠟,制作組織芯片時受體蠟塊極易變形扭曲。在室溫較低的季節(冬春季節)在受體蠟快打孔前,可將其放于溫箱稍加溫后再進行制作,可有效防止受體蠟塊的開裂現象,并且在打孔過程中可反復使用該方法,注意加溫的時間不宜過長,否則受體蠟塊會融化變形。本實驗中HE切片及FISH檢測中均有不同程度的組織位點脫片的現象,經過仔細觀察發現,多數是由于組織芯位點低于受體蠟塊表面,導致切片時無法將其切到;少數是由于供體組織本身固定不佳等原因導致撈片時組織卷曲或掉片。

隨著乳腺癌赫賽汀靶向治療的應用,越來越多的乳腺癌患者需要進行HER2 FISH檢測,目前臨床中主要是對常規石蠟切片進行FISH檢測,但往往組織塊大,消耗試劑多,同時暗室閱片花費的人力也大大增加。是否可以使用組織芯片技術對需要行HER2 FISH檢測的一組乳腺癌同時進行檢測?本實驗對192例的乳腺癌組織芯片進行HER2 FISH檢測,與常規石蠟切片的HER2 FISH檢測結果進行比較,經χ2檢驗發現兩種方法的檢測結果差異無統計學意義,表明組織芯片與常規石蠟切片檢測結果基本一致。常規石蠟切片的陽性率26.0%(50/192)略高于組織芯片25.0%(48/192),對于常規石蠟切片檢測為簇狀擴增病例,組織芯片的檢出結果與其完全一致;對于常規石蠟切片檢測為點狀擴增病例中有3例組織芯片檢測為陰性,回顧原常規石蠟切片的診斷報告,此3例常規石蠟切片HER2/CEP17的比值分別為2.02,2.14及2.23;對于常規石蠟切片檢測為無擴增病例中有1例組織芯片檢測為點狀擴增,回顧常規石蠟切片HER2/CEP17的比值為1.88;綜合分析,兩者檢測結果不一致的4個病例的HER2/CEP17的比值均是位于2.0附近,導致結果不一致的重要的原因可能是腫瘤組織的異質性。Moch等[8]曾對組織異質性的影響進行了組織芯片與常規石蠟切片對比性研究,其研究結果確實顯示出一定的差異,他強調組織芯片是用于檢查腫瘤群體,而不是個體。

組織芯片技術雖然具有常規石蠟切片無法比擬的優點,如體積小、數量多、檢測結果的可靠性強,信息量大,效率高,消耗試劑少等,在科研方面顯示出無比的優越性;但是組織芯片也具有一定的局限性,它無法回避腫瘤組織的異質性問題,對于臨床個體的腫瘤患者目前還不推薦使用組織芯片技術進行乳腺癌HER2 FISH檢測,以免給患者的治療造成嚴重的后果。

[1] Kononen J,Bubendorf L,Kallioniemi A,etal.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens[J].Nat Med,1998,4(7):844-847.

[2] 乳腺癌HER2檢測指南(2014版)編寫組.乳腺癌HER2檢測指南(2014版)[J].中華病理學雜志,2014,43(4):262-267.

[3] Battifora H.The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing[J].Lab Invest,1986,55(2):244-248.

[4] 秦廣琪,魏巧,顧燕子,等.一種簡便易行的組織芯片制作技術[J].中國癌癥雜志,2015,25(9):683-686.

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[6] 李銳,葉勝兵,時姍姍.熒光原位雜交技術在組織芯片中的應用[J].中華病理學雜志,2016,45(1):51-52.

[7] 劉銀華,張修穩,盧林明,等.改良組織芯片技術在胃癌研究中的應用及體會[J].皖南醫學院學報,2012,31(2):112-115.

[8] Moch H,Kononen J,Kallioniemi OP,etal.Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology?[J].Adv Anat Pathol,2001,8(1):14-20.

陳玉娟,女,1982-04生,本科,技師,E-mail:326432487@qq.com

2017-02-24

R737.9

A

1007-6611(2017)06-0632-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.027