PTP1B和Sam68在結直腸癌中的表達及其意義

余紅璐,任亞君,熊枝繁

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化內科,武漢 430077;*通訊作者,E-mail:xiongzhifan@126.com)

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PTP1B和Sam68在結直腸癌中的表達及其意義

余紅璐,任亞君,熊枝繁*

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化內科,武漢 430077;*通訊作者,E-mail:xiongzhifan@126.com)

目的 觀察蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)及Sam68(Src-associated substrated during mitosis of 68KD)在結直腸癌的發生發展中的表達及其相關性,探究其與結直腸癌臨床病理特征的關系。 方法 采用免疫組織化學(SABC)法檢測53例結直癌組織及20例癌旁正常組織中PTP1B、Sam68的表達情況,并結合臨床病理學資料進行統計分析;采用Western blotting方法檢測12例結直腸癌組織及對應癌旁正常組織中的PTP1B及Sam68蛋白表達情況。 結果 免疫組化結果顯示PTP1B、Sam68在結直腸癌組織的陽性表達率明顯高于正常大腸組織,差異均有統計學意義(均P<0.001)。PTP1B、Sam68的表達均與分化程度、TNM分期及淋巴結轉移相關(P<0.05);相關性分析顯示,PTP1B與Sam68表達呈正相關(r=0.463,P<0.001)。Western blotting檢測結果顯示結直腸癌組織中PTP1B和Sam68的蛋白表達量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。 結論 PTP1B、Sam68可能與大腸癌的發生、浸潤及轉移有關,兩者共同促進大腸癌的發生、發展、侵襲及轉移。

結直腸癌; 蛋白酪氨酸磷酸酶1B; Sam68; 免疫組織化學; Western blotting

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的生命和健康。近年來隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變,結直腸癌的發病率在全球范圍內呈逐年增加的趨勢。PTPlB是一種典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,在糖代謝和脂代謝信號通路中起重要作用,被認為是抗2型糖尿病和肥胖的潛在靶點。糖尿病相關的研究顯示，PTP1B可通過胰島素信號通路中的絲氨酸/蘇氨酸激酶途徑抑制胰島素受體及其底物絲氨酸殘基的磷酸化從而導致胰島素受體下調引發糖尿病[1]。在脂代謝方面,PTP1B過表達可通過誘導VLDL過多生成而影響脂蛋白分泌,從而引起脂代謝紊亂而致糖尿病[2]。越來越多的研究表明PTPlB與腫瘤具有相關性[3]?，F有文獻[4]表明,其對腫瘤的作用具有雙向性,即可以促進腫瘤的發生和發展,也可以抑制腫瘤的發生和發展,這主要取決于其相應的作用底物及所處的細胞環境,PTPlB可作用于p-Catenin、 p130Cas、Jak2和Met等分子發揮抑癌基因作用,作用于Src、 p62dok、cortactindras、Crk Ⅱ等分子則發揮癌基因的作用。Chen等[5]已證實在結直腸癌中PTP1B主要發揮癌基因的作用。Sam68蛋白(Src-associated substrated during mitosis of 68KD)是RNA激活蛋白家族成員之一,研究表明Sam68蛋白能促進腫瘤細胞增殖[6]。Sam68可作為一種信號轉導和RNA激活蛋白參與細胞周期的調控,它通過影響細胞增殖和凋亡與細胞惡性轉化高度相關[7]。Liao等[8]已證實在結直腸癌中存在Sam68的過度表達,其過表達促進了結直腸癌的發生與發展。

目前,國內外關于PTP1B致癌機制的研究尚未明了,其與Sam68之間關系尚不清楚。我們應用免疫組化及Western blotting方法檢測PTP1B及Sam68在大腸癌組織中的表達，并分析兩者之間的相關性,探討其與大腸癌發生、發展及侵襲轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院、協和醫院2005-2014年病理科存檔石蠟包埋組織33例及2014-09～2015-05手術切除的大腸癌組織20例,同時取距離腫瘤>10 cm正常組織20例作為對照,新鮮組織標本取材后一份用4%多聚甲醛固定,一份立即置于-80 ℃冰箱中凍存。所有病例術前未行任何抗腫瘤治療,均無糖尿病、糖耐量異常病史,術后均經病理證實。大腸癌53例,男33例,女20例;年齡31-75歲,平均年齡54.0歲;其中結腸癌26例,直腸癌27例;高中分化癌36例,低分化癌17例;TNM分期中Ⅰ期+Ⅱ期35例,Ⅲ期+Ⅳ期18例;有淋巴結轉移的有18例,無淋巴結轉移的有35例。

1.2 主要試劑

鼠抗人多克隆PTP1B抗體及兔抗人單克隆Sam68抗體購自abcam公司,免疫組化用PTP1B抗體及Sam68抗體 均按1 ∶500稀釋,Western blotting所用PTP1B抗體及Sam68抗體 按1 ∶1 000稀釋。所有二抗購自美國Pierce公司,三抗購自Sigma公司。ECL發光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及DAB試劑盒均購自Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫組化(SABC)法檢測PTP1B及Sam68的表達 所有53例標本均由4%多聚甲醛固定,常規脫水,透明,石蠟包埋,4 μm連續石蠟切片,烤片,脫蠟,入水,破膜,抗原位于胞質則用pH6.0檸檬酸液中微波熱修復,抗原位于胞核則用pH9.0 EDTA液中微波修復;PBS清洗;加 3%H2O2于37 ℃溫箱中避光反應 30 min,PBS清洗;;加4%BSA于37 ℃溫箱反應30 min,甩液,加一抗,4 ℃孵育過夜后室溫復溫2 h,PBS清洗;加二抗,37 ℃溫箱孵育1 h,PBS清洗;加SABC液37 ℃孵育1 h,PBS清洗;DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。 以PBS代替一抗為陰性對照,以購買試劑時所附陽性圖片為陽性對照。

1.3.2 免疫組化結果判定 每例切片隨機抽取5個高倍鏡視野,腫瘤細胞陽性率分值為:<10%,0分;10%-25%,1分; 26%-50%,2分;51%-75%,3分;>75%,4 分;染色強度評分為:無色,0分;淡黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。 兩者得分相乘,≤2分為陰性;≥3分為陽性。

1.3.3 Western blotting法檢測PTP1B及Sam68的表達 將-80 ℃冰箱中凍存的組織標本取出稱重,每100 mg加入500 μl蛋白裂解液,置勻漿器中反復研磨,使組織充分勻漿化,冰上充分裂解30 min,12 000 r/min離心收集上清,用BCA法測上清蛋白濃度。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉膜1.5 h,5%脫脂牛奶封閉2 h后,分別加入PTP1B鼠抗人多克隆抗體(1 ∶1 000),Sam68兔抗人單克隆抗體(1 ∶1 000)及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST漂洗,分別加辣根酶標記山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000),37 ℃搖床孵育2 h,TBST漂洗,加入ECL發光試劑暗室曝光,所得條帶利用IPP軟件分析,共檢測分析12例。

1.4 統計學處理

采用SPSS20.0軟件進行統計分析,其中相關性分析采用Spearman等級相關分析,用百分率表示計數資料,運用χ2檢驗分析PTP1B及Sam68的表達與臨床病理參數的關系,PTP1B及Sam6蛋白在癌組織與正常組織中的相對表達量比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學法檢測PTP1B、Sam68蛋白在大腸癌和正常組織中的表達

PTP1B主要表達在細胞的胞質和/或胞核,為棕黃色顆粒(見圖1)。PTP1B在正常組織、大腸癌組織中表達的陽性率分別為10.0%(2/20)和69.8%(37/53),差異有統計學意義(P<0.001)。Sam68主要表達在細胞的胞核,為棕黃色顆粒(見圖2);Sam68在正常組織、大腸癌組織中表達的陽性率分別為15.0%(3/20)、69.8%(37/53),差異有統計學意義(P<0.001)。

A.正常大腸組織 B.大腸癌組織圖1 免疫組化檢測PTP1B在大腸癌組織及正常大腸組織中的表達 (×400)Figure 1 Expression of PTP1B in colorectal cancer tissues and normal colorectal tissues (×400)

A.正常大腸組織 B.大腸癌組織圖2 免疫組化檢測Sam68在大腸癌組織及正常大腸組織中的表達 (×400)Figure 2 Expression of Sam68 in colorectal cancer tissues and normal colorectal tissues (×400)

2.2 PTP1B、Sam68在大腸癌中的表達與大腸癌臨床病理特征的關系

PTP1B、Sam68的表達在不同性別、年齡、部位,差異無統計學意義(P>0.05);而在不同分化程度、TNM分期、是否有淋巴結轉移間差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

2.3 PTP1B、Sam68在大腸癌組織中表達的相關性

經Spearman等級相關性分析,兩者在大腸癌組織中的表達呈正相關(r=0.463,P<0.001,見表2)。

2.4 Western blotting法檢測結直腸癌組織中PTP1B、Sam68蛋白表達水平

結果顯示,PTP1B在大腸癌組織中的表達水平(0.503 3±0.182 3)明顯高于癌旁正常組織(0.221 4±0.067 3),兩組相比差異有統計學意義(t=4.362,P<0.05,見圖3);Sam68在大腸癌組織中的表達水平(0.387 9±0.190 8)也明顯高于對應的癌旁正常組織(0.161 8±0.089 9),兩組相比差異有統計學意義(t=4.191,P<0.05,見圖4)。

表1 PTP1B及Sam68在大腸癌中的表達及與大腸癌臨床病理特征之間的相關性 例(%)

Table 1 Expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer patients with different clinicopathological features cases(%)

臨床病理特征 nPTP1BSam68陽性χ2P陽性χ2P性別1467022614670226 男3325(758)25(758) 女2012(600)12(600)年齡1187017200070993 ≤60歲3623(639)25(694) ≥60歲1714(824)12(706)部位2908008802580611 結腸2621(808)19(731) 直腸2716(593)18(667)分化程度4031004540310045 高中分化3622(611)22(611) 低分化1715(882)15(882)TNM分期3970004661020014 Ⅰ期+Ⅱ期3522(629)22(629) Ⅲ期+Ⅳ期1816(889)17(944)淋巴結轉移3970004661020014 有1816(889)17(944) 無3522(629)22(629)

表2 PTP1B、Sam68在大腸癌組織中表達的相關性

Table 2 Correlation between the expression of PTP1B and Sam68 in colorectal tissues

PTP1BSam68+-rP+3160463P<0001-610

圖3 Western blotting檢測PTP1B蛋白在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達Figure 3 Expression of PTP1B protein in colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumor tissues by Western blotting

圖4 Western blotting法檢測Sam68蛋白在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達Figure 4 Expresion of Sam68 protein in colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumor tissues by Western blotting

3 討論

在中國結直腸癌是十大惡性腫瘤之一,隨著我國現代化程度和生活水平的提高,人們的飲食結構及生活方式發生了較大變化,致使結直腸癌的發病率逐年增加,發病率居第3位,死亡率居第5位。研究[9]表明,如果結直腸癌能在早期被發現,約90%的病人可以通過外科手術治愈,但由于絕大多數患者發病早期無明顯癥狀,經常是在進展期才被診斷,所以嚴重影響了結直腸癌的治療和預后,因此,加強尋找與結直腸癌的發生、發展及預后相關的分子標志物對其診斷、臨床分期、個體化治療方案制定及預后評估具有重要臨床意義。

酪氨酸磷酸化是信號傳導級聯反應中的重要調節步驟,參與調控細胞的增殖、生存、分化、遷移和凋亡等過程[10]。酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)協同調控,當PTP表達或活性調控失常時,可導致信號通路紊亂,從而促進多種疾病的發生,包括腫瘤、糖尿病和炎癥等。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是PTPs超家族成員之一,最初是作為一個分子量為37 kDa的催化結構域從人胎盤組織中所提取,PTP1B基因定位于人20號染色體q13,在許多癌癥中發現該區域存在癌基因和基因增殖。PTP1B是一種典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,在代謝信號通路中起重要作用,被認為是抗 2型糖尿病和肥胖的潛在靶點。越來越多的研究[3]表明PTP1B與腫瘤具有相關性,其在腫瘤的發生中具有促進作用。例如,PTP1B在胃癌細胞中過表達,抑制PTP1B的表達在體內外可明顯抑制胃癌細胞的生長,PTP1B在胃癌組織中的過表達與腫瘤轉移和TNM分期密切相關[3]。此外,PTP1B還在多種腫瘤中存在過表達,如上皮來源的腫瘤、乳腺癌[11]和前列腺癌[12]。然而也有研究表明PTPlB是個腫瘤抑制因子,與癌旁正常黏膜相比,PTP1B mRNA在食管癌中的表達明顯下降[4]。因此PTP1B在腫瘤的發生中的作用仍存爭議,需要進一步探討。近來,ZhuS等[13]的研究證實在結腸癌細胞中,PTP1B的過度表達與c-Src中529位點殘基的磷酸化抑制能力降低有關,導致了軟瓊脂中菌落的快速形成以及免疫缺陷小鼠中腫瘤生長的加速,從而加速結腸癌細胞的生長。本研究發現,結直腸癌組織中PTP1B的蛋白表達水平及陽性率均高于癌旁正常組織,差異有統計學意義(P<0.05),在蛋白水平證明了PTP1B是影響腫瘤發生的重要因素,此結果與國內外報道一致,可以說明PTP1B確實是惡性侵襲性腫瘤的一個敏感性指標;同時發現PTP1B在大腸癌組織中的表達與性別、年齡、部位無關,而與分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移有關,說明PTP1B與結直腸癌患者癌癥進展密切相關,隨腫瘤進展程度越高,其陽性表達率越高,這與Chen等[5]的研究一致。提示PTP1B高表達可能是結直腸癌發生發展過程中的一個普遍性事件,高表達的PTP1B可能成為結直腸癌侵襲程度的一個判斷指標,其可能機制是PTP1B的過度表達激活了Akt、Erk1/2、FAK和Src從而促進了腫瘤的發生、發展[3]。

Sam68是sTAR蛋白家族的代表成員之一,也稱為RNA結合蛋白,分子量約為68 kDa,在有絲分裂過程中是酪氨酸蛋白激酶Src的底物。Sam68能與多種信號傳導蛋白結合,包括Grb2、Nck、rasGAP、蛋白酪氨酸激酶Src和ItK。Paronetto等[14]報道,在人的前列腺癌組織中Sam68被磷酸化,而癌旁組織和良性增生組織都無Sam68的磷酸化。Sam68被Src激酶磷酸化后與RNA的結合力降低,可引起調控細胞周期的基因在轉錄后表達異常,導致腫瘤的發生。近年來,多項研究發現Sam68在人類惡性腫瘤中表達上調,主要包括了宮頸癌[15]、非小細胞肺癌[16]、結腸癌[8],并發現sam68與腫瘤細胞增殖及進展密切相關。本研究發現,結直腸癌組織中Sam68的蛋白表達水平及陽性率均高于癌旁正常組織,差異有統計學意義(P<0.05),說明Sam68的高表達促進了腫瘤的發生,且結合臨床病理資料分析發現其在大腸癌組織中的高表達與性別、年齡、部位無關,而與分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移有關,說明Sam68與結直腸癌患者癌癥進展密切相關,隨腫瘤進展程度越高,其陽性表達率越高,這與Liao等[8]的研究結果一致。以上結論表明,Sam68很可能具有癌基因的特性,在大腸癌的發生中起重要作用,但其具體機制尚不明確,有待進一步探究。

相關性分析發現,PTP1B與Sam68蛋白在大腸癌組織中表達呈正相關,且隨著TNM分期、淋巴結轉移的增加,兩者的表達均升高,提示兩者共同促進大腸癌的發生、發展、侵襲及轉移。之前有研究[4]表明PTP1B作用于Scr發揮癌基因的作用,而在有絲分裂中Sam68是Scr的作用底物,Sam68被Src激酶磷酸化后與RNA的結合力降低,可引起調控細胞周期的基因在轉錄后表達異常,導致腫瘤的發生。因此通過實驗結果,我們可推測出通過Scr為橋梁也許PTP1B與Sam68之間可能具有協同作用。兩者聯合檢測對大腸癌的診斷有一定意義,同時我們推測聯合應用兩者的抑制劑可能為大腸癌的治療提供又一新的方向。但兩者在腫瘤發生進展中相互作用的具體機制目前尚不完全明了,下一步需進一步增加樣本量進行研究探討。

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Expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer and its significance

YU Honglu,REN Yajun,XIONG Zhifan*

(DepartmentofDigestion,LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China;*Correspondingauthor,E-mail:xiongzhifan@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of PTP1B and Sam68 in human colorectal cancer tissues,and its relationships with clinicopathological parameters.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of PTP1B and Sam68 in 53 cases of colorectal cancer tissues and 20 cases of normal tissues.The expression of PTP1B and Sam68 was compared between patients with different clinicopathological features of colorectal cancer.The expression of PTP1B and Sam68 in 12 cases of colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumorous tissues was detected by Western blotting.ResultsThe results of immunohistochemistry demonstrated that the positive expression rates of PTP1B and Sam68 protein in 53 cases of colorectal cancer were significantly higher than those of normol tissues(P<0.001).The expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer was significantly different in patients with different differentiation,TNM stage and lymph node matastasis(P<0.05).The expression of PTP1B and Sam68 was positively correlated(r=0.463,P<0.001).Western blotting results showed that the expression of PTP1B and Sam68 protein in colorectal cancer was significantly higher than that of matched adjacent non-tumor tissues.ConclusionThe expression of PTP1B and Sam68 protein may be related to the development,metastasis and invasion of human colorectal cancer,and they may synergistically promote the development of colorectal carcinoma.

colorectal cancer; PTP1B; Sam68; immunohistochemistry; Western blotting

余紅璐,女,1990-05生,在讀碩士,E-mail:yuhonglu664@163.com

2017-02-17

R735.3

A

1007-6611(2017)06-0596-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.019