高靈敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法的構建

宋秀春，湯迎春，楊 夏

(1.內蒙古呼倫貝爾市人民醫院，內蒙古 海拉爾 021008；2.內蒙古包鋼醫院，內蒙古 包頭 014010)

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高靈敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法的構建

宋秀春1,2，湯迎春1，楊 夏2

(1.內蒙古呼倫貝爾市人民醫院，內蒙古 海拉爾 021008；2.內蒙古包鋼醫院，內蒙古 包頭 014010)

目的 為從天然化合物中高效篩選具有體液免疫抑制活性的先導化合物，本研究將構建高靈敏且價格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法。方法 利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體、生物素標記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素構建小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法；通過對包被抗體濃度、檢測抗體濃度和鏈霉親和素濃度的優化，使檢測方法靈敏度達到最高；再利用該檢測方法檢測體外培養小鼠B細胞上清中IgG濃度驗證方法的有效性。結果 在山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體濃度達到5 μg·mL-1，生物素標記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體濃度達到0.25 μg·mL-1，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素濃度達到0.5 μg·mL-1，小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法靈敏度達到最高(0.05 ng·mL-1)，線性范圍在0.1～10 ng·mL-1；該檢測方法可以高靈敏檢測體外培養LPS刺激小鼠B細胞分泌的IgG抗體。結論 本研究成功構建高靈敏且價格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測方法。

小鼠免疫球蛋白；IgG；ELISA；靈敏度

自身免疫性疾病、過敏性疾病和器官移植排斥是嚴重危害人類健康的免疫失調性疾病，目前臨床主要應用糖皮質激素、環孢素、他克莫司等免疫抑制劑對其進行治療。由于這些常用免疫抑制劑缺乏特異性，可導致代謝紊亂、血液毒性和肝腎毒性等不良反應，嚴重影響了上述疾病的治療[1-3]。傳統醫學中已發現很多中藥或方劑具有祛風除濕、清熱燥濕、溫經散寒、通絡止痛之功效，對自身免疫性疾病和過敏性疾病具有治療作用?，F代醫學表明這種作用可能來自中藥的免疫抑制活性[4-7]。因此，從中藥中發現具有全新作用機制的高效低毒免疫抑制劑先導化合物具有重要研究意義。

根據傳統醫學中中藥及其方劑的藥效導向，利用現代分離和結構鑒定方法，可獲得大量全新結構的具有潛在生物活性的化合物。利用傳統的動物模型對種類繁多的微量化合物進行活性篩選已難以滿足實際需要。近年來，體外細胞藥效篩選已逐漸成為天然化合物活性篩選的主要模式[8-11]。免疫抑制劑體外篩選需要測定多種指標，其中B細胞分泌的IgG是篩選該類抑制劑的核心指標。然而，由于已有的小鼠IgG的ELISA測定試劑盒靈敏度低且價格昂貴，極大地限制了免疫抑制劑的篩選。為充分發掘中藥資源，高效篩選免疫抑制劑先導化合物，本研究將構建靈敏度高且價格低廉的小鼠IgG的ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

8周齡雄性Balb/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.1.2 試劑

RPMI1640培養基(貨號：10-010-CVR)、胎牛血清(貨號：35-076-CV)、0.25%胰酶(貨號：25-253-CI)、氨芐青霉素和鏈霉素(貨號：30-002-CI)，購自美國Corning公司；紅細胞裂解液(貨號：CC051)，購自北京邁晨科技有限公司；脂多糖(貨號：L2880)、牛血清白蛋白(貨號：V900933)、吐溫20(貨號：P1379)購自Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(貨號：SA0102)、生物素標記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體(貨號：SA0103B)和辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素(貨號：BR0001)，購自北京佰瑞達生物科技有限公司；單組份TMB顯色液(貨號：PR1200)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測范圍的初步評估

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(10 μg·mL-1)加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；利用清洗液(含0.1%吐溫20的PBS)清洗酶標板3次后，將封閉液(含1%BSA的PBS)加入酶標板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液(含0.1%吐溫20和1%BSA的PBS)稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-SA，2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；利用清洗液清洗酶標板5次后，加入TMB底物進行顯色；加入終止液(含10%濃鹽酸的蒸餾水)后，450 nm測定吸光度。

1.2.2 包被抗體濃度優化

將0.1～100 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；利用清洗液清洗酶標板3次后，將封閉液加入酶標板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入利用封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；利用清洗液清洗酶標板5次后，加入TMB底物進行顯色；加入終止液后，450 nm測定吸光度。1.2.3 檢測抗體濃度優化

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；利用清洗液清洗酶標板3次后，將封閉液加入酶標板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；利用清洗液清洗酶標板5次后，加入TMB底物進行顯色；加入終止液后，450 nm測定吸光度。1.2.4 HRP-SA濃度的優化

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；利用清洗液清洗酶標板3次后，將封閉液加入酶標板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；利用清洗液清洗酶標板5次后，加入TMB底物進行顯色；加入終止液后，450 nm測定吸光度。1.2.5 標準曲線測定

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；利用清洗液清洗酶標板3次后，將封閉液加入酶標板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.01～10 ng)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；利用清洗液清洗酶標板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(0.5 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；利用清洗液清洗酶標板5次后，加入TMB底物進行顯色；加入終止液后，450 nm測定吸光度。

1.2.6 B細胞分泌抗體的濃度測定

頸椎脫臼處死Balb/c小鼠，利用75%乙醇浸泡5 min，無菌超凈臺內取小鼠脾臟；將小鼠脾臟放入70 μM無菌濾網中，5 mL注射器內芯研磨，并用20 mL PBS沖洗，獲得小鼠脾臟細胞懸液；300 g離心5 min，棄上清，加入10 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞，再加入20 mL RPMI1640培養基終止裂解，300 g離心5 min，棄上清；再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞，300 g離心5 min，棄上清；最后利用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞(含氨芐青霉素和鏈霉素)，并進行計數。將細胞接種到96孔培養板中(2×105個/孔)，加入LPS(10 μg·mL-1)，0～72 h內多個時間點收集細胞上清，利用上述ELISA方法測定細胞培養上清中的小鼠IgG。1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 小鼠IgG的檢測范圍

為確定適合的小鼠IgG濃度用于后續測定條件優化，首先需要在常規檢測條件下確定小鼠IgG的檢測范圍。經初步研究，確定小鼠IgG的檢測范圍為0.1～100 ng·mL-1(圖1)。

圖1 小鼠IgG的定量范圍

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(10 μg·mL-1)包被96孔酶標板；經清洗和封閉后，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反應1 h；經清洗酶標板后，加入生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；清洗酶標板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；再經清洗酶標板后，加入TMB底物進行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測定吸光度。

2.2 包被抗體濃度對測定的影響

初步評估小鼠IgG檢測范圍后，選擇5 ng·mL-1的小鼠IgG進行后續檢測條件優化。通過對不同濃度包被抗體的研究，發現包被抗體濃度≥5 μg·mL-1時，檢測靈敏度達到最大(圖2)。

圖2 包被抗體濃度對測定的影響

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(0.1～100 μg·mL-1)包被96孔酶標板中；經清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應1 h；經清洗酶標板后，加入生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；清洗酶標板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；再經清洗酶標板后，加入TMB底物進行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測定吸光度。*P<0.05與包被抗體濃度為100 μg·mL-1的A450比較。

2.3 檢測抗體濃度對測定的影響

經過初步的小鼠IgG檢測范圍的評估和包被抗體濃度的優化，選取5 ng·mL-1的小鼠IgG、5 μg·mL-1的包被抗體濃度進行后續測定。通過對不同濃度檢測抗體的研究，發現檢測抗體濃度≥0.25 μg·mL-1時，可使檢測靈敏度達到最大(與最高檢測抗體濃度相比)(圖3)。

圖3 檢測抗體濃度對測定的影響

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標板中；經清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應1 h；經清洗酶標板后，加入系列濃度生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應1 h；清洗酶標板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；再經清洗酶標板后，加入TMB底物進行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測定吸光度。*P<0.05與檢測抗體濃度為10 μg·mL-1的A450比較。

2.4 HRP-SA濃度對測定的影響

在確定了合適的包被抗體和檢測抗體濃度后，本研究進一步對HRP-SP濃度進行優化，發現HRP-SP濃度≥0.5μg·mL-1時，能使檢測靈敏度達到最大值(圖4)。

圖4 HRP-SA濃度對測定的影響

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標板中；經清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應1 h；經清洗酶標板后，加入0.25 μg·mL-1生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體，37 ℃反應1 h；清洗酶標板后，加入系列濃度HRP-SA(0.01～10μg·mL-1)，37 ℃反應0.5 h；再經清洗酶標板后，加入TMB底物進行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測定吸光度。*P<0.05與HRP-SA濃度為10 μg·mL-1時的A450比較。

2.5 標準曲線的測定

利用優化的測定條件對小鼠IgG進行標準曲線測定，以確定測定靈敏度和線性范圍。結果顯示該檢測方法靈敏度可達0.05 ng·mL-1，線性范圍為0.1～10 ng·mL-1(圖5)。

圖5 標準曲線測定

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標板；經清洗和封閉后，加入0.01～100 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應1 h；經清洗酶標板后，加入0.25 μg·mL-1生物素標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體，37 ℃反應1 h；清洗酶標板后，加入0.5 μg·mL-1的HRP-SA，37 ℃反應0.5 h；再經清洗酶標板后，加入TMB底物進行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測定吸光度。

2.6 B細胞分泌IgG的測定

在經過測定條件優化和標準曲線測定后，本研究對體外培養小鼠B細胞分泌的IgG進行測定，以驗證測定方法的有效性。結果顯示該檢測方法可以準確檢測出B細胞在不同刺激時間后分泌的IgG(圖6)。

3 討 論

傳統的小鼠IgG檢測主要采用免疫沉淀法和免疫比濁法。這2類方法雖然比較廉價，但其靈敏度、定量能力較差，測定通量過低。近年來，通過

圖6 B細胞分泌IgG的測定

注：體外培養小鼠脾臟B細胞；利用10 μg·mL-1濃度的LPS刺激B細胞分泌抗體；在0～72 h的多個時間點收集細胞培養上清，利用上述優化后的檢測條件測定IgG濃度。

ELISA方法檢測小鼠IgG已經成為廣泛應用的定量方法，其定量準確和高通量特性非常適合藥物先導化合物的篩選。但由于抗抗體與IgG的同源性，它們的結合能力具有效價低的天然特性。因此，目前市售的檢測小鼠IgG的ELISA試劑盒普遍靈敏度偏低(例如ebioscience公司檢測小鼠IgG的ELISA試劑盒靈敏度為1.56 ng，武漢華美生物工程有限公司檢測小鼠IgG的ELISA試劑盒靈敏度為29 ng)，僅能用于體內IgG檢測和含高濃度IgG的體外細胞上清檢測。在藥物先導化合物的篩選和機制研究中，經常要對少量B細胞在不同刺激劑和刺激時間下分泌的微量IgG進行檢測，而已有的試劑盒靈敏度難以滿足實驗需要。

本研究主要利用雙抗夾心法檢測小鼠IgG，相對競爭法能夠顯著提高靈敏度，改善定量準確性。通過分別針對小鼠IgG的Fc段和F(ab’)2段二抗的雙抗夾心法可以避免包被抗體和檢測抗體的交叉反應，降低生物素標記的檢測抗體濃度，從而降低檢測背景，提高檢測靈敏度。另外生物素和親和素結合反應可以進一步提高檢測靈敏度。

在改進檢測方法設計后，本研究通過進一步優化包被抗體濃度、檢測抗體濃度、HRP-SA濃度，將檢測方法的靈敏度提高到0.05 ng·mL-1，線性范圍達到0.1～10 ng。相對于國內外市售試劑盒，本檢測方法顯著提高了小鼠IgG的檢測靈敏度和定量特性，并且檢測方法成本僅相當于市售試劑盒的1/10～1/50。

本研究成功構建了高靈敏且價格低廉的小鼠IgG的ELISA檢測方法，非常適用于免疫抑制劑先導化合物的篩選及其作用機制研究。

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[責任編輯：李薊龍 英文編輯：劉彥哲]

Construction of High Sensitivity Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Mouse IgG

SONG Xiu-chun1,2，TANG Ying-chun1，YANG Xia2

(1.Hulunbeier People’s Hospital,Hailaer,Inner Mongolia 021008,China; 2.Baogang Hospital,Baotou,Inner Mongolia 100050,China)

Objective To efficiently and reliably screen natural compounds for lead compounds with immunosuppressive activity,high sensitivity and low-cost enzyme-linked immunosorbent assay for mouse IgG was constructed.Methods Goat antibody specific to Fc fragment of mouse IgG,goat antibody specific to F(ab’)2 fragment of mouse IgG,and horseradish peroxidase-labeled streptavidin(HRP-SA)were used to construct ELISA for mouse IgG.The concentration of capture antibody,detection antibody and HRP-SA were optimized to improve the sensitivity of this assay.Then to validate this method,the assay was used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells culturedinvitro.Results While the concentration of capture antibody reached 5 μg/ml,the concentration of detection antibody reached 0.25 μg/ml,and HRP-SA reached 0.5 μg/ml,the highest sensitivity was achieved(0.05 ng/ml)and the linear range was from 0.1 to 10 ng/ml.This assay could be used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells cultured in vitro with high sensitivity.Conclusion This study successfully constructed high sensitivity and low-cost ELISA for mouse IgG.

mouse immunoglobulin;IgG;ELISA;sensitivity

內蒙古醫科大學第三臨床醫學院醫學研究基金項目(NO.2014-24)

宋秀春(1980-)，女，護士長，主管護師。

楊夏(1984-)，女，碩士，主管藥師，研究方向：藥品質量控制方法學。

R 730.45

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.08.003

來稿日期：2016-12-19