聚色氨酸修飾玻碳電極測定動物性食品中己烯雌酚

馬心英,呂惠萍,王宜磊(.菏澤學院化學化工系,山東菏澤 27405; 2.菏澤學院生命科學系,山東菏澤 27405)

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聚色氨酸修飾玻碳電極測定動物性食品中己烯雌酚

馬心英1,呂惠萍1,王宜磊2,*
(1.菏澤學院化學化工系,山東菏澤 274015; 2.菏澤學院生命科學系,山東菏澤 274015)

用循環伏安法制備了聚色氨酸修飾玻碳電極。研究了己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的電化學行為，建立了一種直接測定動物性食品中己烯雌酚含量的新方法。實驗結果表明:在pH=5.0的磷酸鹽緩沖溶液體系中,己烯雌酚在聚色氨酸修飾玻碳電極上于-0.2～0.8 V范圍內出現一對可逆的氧化還原峰,與裸玻碳電極相比較,聚色氨酸修飾電極對己烯雌酚的電化學反應具有促進作用。己烯雌酚濃度在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L范圍內與其氧化峰電流成正比,檢出限為2.00×10-9mol/L,對己烯雌酚溶液平行測定6次的RSD為2.4%。該修飾電極具有良好的靈敏度、選擇性和穩定性,可用于牛肉、魚肉及奶粉中己烯雌酚含量的測定,回收率為96.0%～102.3%,結果滿意,方法具有實用價值。

聚色氨酸,修飾電極,循環伏安法,己烯雌酚

己烯雌酚(DES)是人工合成的非甾體雌激素物質,主要用于治療激素平衡失調引起的功能性出血、閉經雌激素缺乏癥等,由于其價格便宜,療效明顯,20世紀40至60年代在醫學臨床上廣泛應用。此外DES具有降低脂肪合成、加快蛋白質代謝合成和增加動物體重等作用,因此被作為促生長劑在畜牧養殖業廣泛應用[1-2]。但后來研究發現,由于DES的使用,可能導致其在生物體內殘留,影響細胞內鈣離子水平和生殖能力[3],并存在誘發癌癥危險,可導致白血病、子宮癌等疾病[4],增加女性乳腺癌、陰道腺癌發病率[5]。從20世紀70年代末,中國、美國、歐盟等國家,先后禁止DES在食品動物中使用。然而,由于能給食品動物養殖業帶來經濟利益,己烯雌酚的濫用現象仍然存在。因此,建立準確、靈敏、簡便的測定己烯雌酚的分析方法非常必要。國內報道用于檢測DES的方法主要有高效液相色譜法[6-8]、免疫檢測法[9-11]、氣相色譜-質譜聯用法[12-14],而電化學法報道較少[3,15]。

本實驗研究了聚色氨酸修飾電極的制備及己烯雌酚在修飾電極上的電化學行為,己烯雌酚分子中的酚羥基具有電化學活性,可在聚色氨酸電極上發生電化學氧化還原反應,而在同樣條件下,己烯雌酚在裸玻碳電極上的電化學活性卻低得多,因此建立了測定己烯雌酚的電化學新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色氨酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司,用二次蒸餾水配制成1.00×10-3mol/L溶液;己烯雌酚 標準品,成都艾科達化學試劑有限公司,用乙醇配制1.00×10-3mol/L標準溶液;磷酸氫二鈉 分析純,上海試劑二廠,用二次蒸餾水配制成0.20 mol/L溶液;檸檬酸 分析純,上海譜振生物科技有限公司,用二次蒸餾水配制成0.10 mol/L溶液;磷酸鹽緩沖溶液體系(PBS,pH為2.2～8.0) 由磷酸氫二鈉溶液和檸檬酸溶液按一定比例配制;鯽魚 購自某農貿市場;牛肉 購自某農貿市場;奶粉 購自某超市；其他試劑 分析純；實驗用水 二次石英重蒸水。

CHI660E型電化學分析系統 上海辰華公司;KQ-100型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;ESJ180-4電子分析天平 成都市宜邦科析儀器有限公司;Sirion 200電子掃描顯微鏡 美國FEI公司;KH-100DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器 江蘇金壇有限公司;電化學實驗用三電極系統 上海仙仁有限公司;玻碳電極 上海辰華公司;Ag/AgCl電極 上海辰華公司;鉑絲電極 上海辰華公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 修飾電極最佳聚合條件優化方法 將玻碳電極(Φ=3.8 mm)用二次蒸餾水沖洗后在金相砂紙上打磨,接著用三氧化二鋁粉在麂皮上拋光成鏡面,再次用二次水沖洗;然后分別在硝酸∶蒸餾水(1∶1)、無水乙醇、二次蒸餾水中各超聲1 min。以預處理好的玻碳電極為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑電極為對電極,在3.00×10-4mol/L色氨酸溶液中,對制備修飾電極的聚合底液pH、聚合電位、掃描速度、聚合周數進行優化。

聚合底液pH的選擇:固定電位范圍為-1.6～2.2 V,掃描速度為80 mV/s,聚合周數為6,改變聚合底液pH分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進行電化學聚合,利用所制備的修飾電極測定1.00×10-6mol/L己烯雌酚溶液,當所測得的氧化峰電流最大時,所對應的聚合底液的pH7.0即為最佳聚合pH。

聚合電位:固定聚合底液pH為7.0,掃描速度為80 mV/s,聚合周數為6周,低電位為-1.4 V,分別改變高電位為1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 V進行實驗,利用所制備的修飾電極測定己烯雌酚溶液,當所測得的氧化峰電流最大時,所對應的電位即為最佳高電位;按同樣的方法固定聚合高電位為2.4 V,改變低電位分別為-1.2、-1.4、-1.6、-1.8、-2.0 V進行實驗,當所測得的氧化峰電流最大時,測得聚合低電位為最佳。

聚合掃描速度:固定聚合底液pH為7.0,聚合周數為6周,電位范圍為-1.6～2.4 V,分別改變掃描速度為20、40、60、80、100、120、140 mV/s進行實驗,當所測得的氧化峰電流最大時,測得聚合掃描速度為最佳。

聚合周數:固定聚合底液pH為7.0,電位范圍為-1.6～2.4 V,掃描速度為100 mV/s,分別改變掃描周數為2、4、6、8、10、12進行實驗,當所測得的氧化峰電流最大時,測得聚合周數為最佳。

1.2.2 修飾電極的制備 將預處理好的玻碳電極浸入色氨酸的PBS(pH=7.0)中,采用三電極體系,在-1.6～2.4 V電位范圍內以100 mV/s的掃速循環掃描,循環8周后取出,用二次水淋洗,即制得聚色氨酸修飾電極,在室溫下保存。

1.2.3 己烯雌酚最佳測定條件優化方法 用修飾電極為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑電極為對電極,對己烯雌酚測定的pH、高低電位、掃描速度和攪拌富集時間進行優化,當所測得己烯雌酚氧化峰電流最大時所對應的條件,即為最佳條件。

測定底液pH實驗條件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚溶液中,固定電位范圍為-0.2～0.8 V,掃描速度為100 mV/s,攪拌富集時間60 s,改變溶液的pH分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進行實驗。

測定高低電位范圍條件:在pH5.0 PBS中,己烯雌酚濃度為1.00×10-6mol/L,掃描速度為100 mV/s,攪拌富集時間40 s,固定低電位為-0.1 V,改變高電位分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 V進行實驗,當所測己烯雌酚氧化峰電流最大時,所對應的電位即為高電位;固定高電位為0.8 V,改變低電位分別為-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0.0、0.1、0.2 V進行實驗,當己烯雌酚氧化峰電流最大時,對應電位即為最佳低電位。

測定掃描速度條件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚pH5.0 PBS中,固定電位范圍為-0.2～0.8 V,攪拌富集時間40 s,改變掃描速度從20 mV/s開始,每隔20 mV/s進行實驗,直至400 mV/s,選擇峰形較好、檢測靈敏度較高的掃描速度。

攪拌富集時間條件:在1.00×10-6mol/L己烯雌酚pH5.0 PBS中,固定電位范圍為-0.2～0.8 V,掃描速度為100 mV/s,改變攪拌富集時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 s進行實驗。

根據掃描速度實驗結果及描述準可逆薄層電化學的Laviron理論[16]，計算電子轉移數nα及電子傳遞系數α。

Epa=a+(2.303RT/(1-α)nαF)lgv

式(1)

Epc=b-(2.303RT/αnαF)lgv

式(2)

式中,a、b為常數。

1.2.4 己烯雌酚測定方法 在電解池中加入一定量己烯雌酚、pH5.0 PBS,以修飾電極為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑電極為對電極,攪拌60 s,在-0.2～0.8 V電位范圍內,以100 mV·s-1掃描速度進行循環掃描,記錄峰電位和峰電流。每次掃描結束后,將電極置于空白底液中循環掃描至峰消失,用二次蒸餾水沖洗,濾紙吸干后,即可進行下一次測定。實驗所得循環伏安曲線研究己烯雌酚在修飾電極上的電化學行為。

1.2.5 樣品處理方法 牛肉樣品前處理:取一定量新鮮牛肉用絞肉機攪碎,然后稱取4份牛肉各5.000 g分別于4支樣品管中,分別標號1、2、3、4,然后分別向1樣品管中加入3 mL乙腈-丙酮(4∶1)混合溶液,2、3、4樣品管中分別加入7.5、12.5、15 μL己烯雌酚標準溶液和3 mL乙腈-丙酮混合溶液(4∶1),將各樣品管置于超聲清洗器超聲分散30 min，再用離心機于2000 r/min下離心10 min,取上清液移至A、B、C、D四個小燒杯中;再分別向4支樣品管中加入3 mL乙腈-丙酮(4∶1)混合溶液,按照同樣的方法處理,分別合并上清液。將燒杯內所合并的上清液吹干后,分別加入4 mL pH=5.0的磷酸鹽緩沖溶液和1 mL乙醇,溶解濃縮物后用于實驗測定。

魚肉樣品前處理:取5條新鮮鯽魚,去鱗后用絞肉機攪碎,稱取4份魚肉各5.000 g于1、2、3、4樣品管中,與牛肉處理方法相同。

奶粉樣品前處理:稱取4份奶粉各0.3000 g于1、2、3、4樣品管中,其他步驟與牛肉處理方法相同。

2 結果與討論

2.1 最佳聚合條件

通過實驗優化了制備聚色氨酸修飾電極的最佳聚合條件。實驗結果表明,聚合底液的pH、聚合電位、掃描速度、聚合圈數會對修飾電極的性能有一定的影響,當聚合底液pH7.0、色氨酸濃度為3.00×10-4mol/L、聚合的電位范圍為-1.6～2.4 V,掃描速度為160 mV·s-1,聚合圈數為8周時,所制備的修飾電極對己烯雌酚的電催化效果最好,己烯雌酚在修飾電極上的響應電流最大。

隨著實踐進程的推進，大學生自行尋找解決問題的途徑和方法就變得異常重要。作為導師，要根據自己的實踐經歷和人生經驗，特別是通過自己的學習和積累，及時、準確、高效地引導低年級學生及時提升實踐項目所需的實戰型技能，強化自學能力，以便不斷解決實踐過程中存在的問題。

2.2 色氨酸修飾電極的聚合循環伏安曲線

在最佳聚合條件下得到的色氨酸在玻碳電極上聚合循環伏安曲線(圖1),在掃描的第一周,在-0.50 V和1.75 V處分別出現一還原峰和氧化峰,隨著掃描周數的增加,氧化還原峰電位均發生負移,峰電流逐漸增大,但增加的幅度逐漸減小,表明色氨酸在電極表面發生了聚合反應。聚合結束后可觀察到玻碳電極表面有一層深藍色膜存在。圖2(B)為聚色氨酸修飾電極掃描電鏡圖,與裸電極(圖2A)相比,可觀察到電極表面形成了具有立體空間結構層狀修飾物。

圖1 色氨酸在玻碳電極上聚合循環伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammograms for electropolymerization of tryptophana

圖2 玻碳電極(A)與聚色氨酸修飾電極掃描電鏡圖(B)Fig.2 SEM image of the GCE(A) and the poly tryptophan film on the GCE(B)注:放大倍數為100000倍。

2.3 己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的電化學行為

圖3分別是最佳實驗條件下己烯雌酚在裸電極、聚色氨酸修飾電極上以及聚色氨酸修飾電極在pH=5.0 PBS中的循環伏安曲線,由圖3可見己烯雌酚在裸電極上電流響應微弱,而在聚色氨酸修飾電極上的氧化還原峰電流值分別為ipa=15.44 μA,ipc=7.63 μA,與裸電極相比,己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上氧化峰電流顯著增高,明顯提高了測定的靈敏度。說明聚色氨酸修飾膜對己烯雌酚電化學氧化具有很好的催化作用。己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的氧化還原峰電位分別為Epa=0.38 V,Epc=0.13 V,ipa/ipc>1,ΔE=0.25 V,故此反應為半可逆反應。圖3表明聚色氨酸修飾電極在pH=5.0 PBS中沒有測到氧化還原峰電流,說明測定底液對實驗無干擾。

圖3 1.0×10-6 mol/L己烯雌酚循環伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of 1.0×10-6 mol/L diethylstilbestrol注:1為玻碳電極,2為聚色氨酸修飾電極, 3為聚色氨酸修飾電極在磷酸鹽緩沖溶液 (pH=5.0)中,掃描速度:100 mV/s。

2.4 最佳測定條件

圖4 1.0×10-6 mol/L 己烯雌酚在不同pH磷酸鹽緩沖溶液中在聚色氨酸修飾電極上的循環伏安曲線Fig.4 Cyclic voltammograms of 1.0×10-6 mol/L diethylstilbestrol at different pH values on the PTRY/GCE注:a～g分別對應pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0,掃描速度:100 mV/s。

2.4.2 測定高低電位的影響 己烯雌酚在修飾電極上氧化峰電流的大小與實驗所確定的最高和最低電位有一定的關系,固定低電位為-0.4 V,改變高電位進行實驗。結果表明,當高電位為0.8 V時,己烯雌酚在修飾電極上的響應電流最大,因此本實驗的測定最佳高電位為0.8 V。

保持其它條件一致,同樣固定高電位0.8 V,改變低電位進行實驗。結果表明,當低電位為-0.2 V時,己烯雌酚在修飾電極上的響應電流最大,因此本實驗的測定最佳低電位為-0.2 V。

綜上所述,本實驗測定的最佳電位范圍為-0.2～0.8 V。

2.4.3 測定掃描速度的影響 改變掃描速度進行實驗,結果表明:己烯雌酚在修飾電極上氧化還原峰電流與掃描速度呈良好的線性關系(圖5內插圖),其線性回歸方程分別為:ipa=-3.59×10-6-2.31×10-7v(mV/s),r=-0.9997;ipc=1.79×10-5+1.61×10-7v(mV/s),r=0.9953。說明己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的電極過程為吸附控制過程。隨著掃描速度的增加,峰電流也跟著增大(圖5)。掃速過低,氧化峰不明顯,掃速過高,會降低檢測的靈敏度,因此本實驗選用的測定最佳掃描速度為100 mV/s。

圖5 1.00×10-6 mol/L己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上隨掃描速度變化的循環伏安曲線Fig.5 Cyclic voltammograms of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol at PTRY/GCE with the change of scanning speed注:pH=5.0,a～j對應的掃描速度(mV/s):40,80,120,160,200,240,280,320,360,400;內插圖為己烯雌酚氧化還原峰電流與掃描速度關系曲線,1為還原峰,2為氧化峰。

圖6為己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的氧化還原峰電位隨lgv變化的關系曲線。根據描述準可逆薄層電化學的Laviron理論,掃描速度在160～400 mV/s的區間內時,Epa=-0.14+0.19lg v,r=0.9938,Epc=0.48-0.18lg v,r=-0.9942。根據式(1)、式(2)得出電子轉移數nα=0.64,電子傳遞系數α=0.51,接近于理論值0.5,符合準可逆過程特征。

圖6 己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的氧化還原峰電位隨lgv變化的關系曲線Fig.6 Plot of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol peak potentials versus the logarithms of the scan rates

2.4.4 最佳攪拌時間的選擇 測定峰電流的大小與實驗過程中攪拌時間也有一定的關系。結果表明,當待測液的攪拌時間為60 s時峰電流達到最大(圖7)。因此,本實驗進行過程中,待測液的最佳攪拌時間為60 s。

圖7 己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的氧化峰電流隨攪拌時間變化的關系曲線Fig.7 Plot of 1.00×10-6 mol/L diethylstilbestrol oxidation peak currents versus the stiring time

圖8 不同濃度的己烯雌酚在聚色氨酸修飾電極上的循環伏安曲線Fig.8 Cyclic voltammograms of diethylstilbestrol at PTRY/GCE at different concentrations注:曲線a～f分別對應于濃度5.00×10-8、1.00×10-7、2.50×10-7、5.00×10-7、7.50×10-7和1.00×10-6 mol/L。內插圖為己烯雌酚氧化峰電流與其濃度關系曲線。

2.5 工作曲線與重現性

在最佳實驗條件下,用循環伏安法對己烯雌酚溶液進行測定。己烯雌酚在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L濃度范圍內與其氧化峰電流呈良好的線性關系(圖8),線性方程為ipa=6.78×10-7+4.96c (mol/L),相關系數r為0.9987。逐漸降低己烯雌酚濃度,當濃度在小于2.00×10-9mol/L時氧化峰消失,由此得出檢出限為2.00×10-9mol/L。

在最佳聚合條件下,對濃度為1.00×10-6mol/L的己烯雌酚進行平行測定,重復6次,得到的相對標準偏差為2.4%。

2.6 干擾實驗

2.7 回收率的測定

在最佳實驗條件下,對牛肉、魚肉和奶粉樣品進行回收率測定。測定結果見表1，回收率在96.0%～102.3%之間,并且用高效液相色譜法進行了方法對比,色譜條件見文獻[7]。與色譜法測定結果接近一致,說明實驗方法的可靠性與準確性,結果滿意。

表1 食品樣品中己烯雌酚回收率測定結果(n=6)Table 1 Recovery measurements of the DES in food samples(n=6)

注:a本方法測定結果;b高效液相色譜法測定結果。

3 結論

通過優化實驗條件,制備了聚色氨酸修飾電極,實驗結果表明,修飾電極對己烯雌酚具有較好的電催化作用,可用于動物性食品中己烯雌酚的電化學測定。在5.00×10-8～1.00×10-6mol/L范圍內,己烯雌酚氧化峰電流與其濃度呈線性關系,檢出限為2.00×10-9mol/L,相關系數r=0.9987,RSD=2.4%。聚色氨酸修飾電極可以實現對牛肉、魚肉、奶粉樣品中的己烯雌酚檢測,回收率為96.0%～102.3%,克服了多巴胺、抗壞血酸、尿酸、維生素E、雌二醇、雌三醇、雌酮、葉酸等的干擾,因此方法靈敏、準確、簡單、快速,且選擇性較高,具有實用價值。

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Determination of diethylstilbestrol in animal food by a poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode

MA Xin-ying1,LV Hui-ping1,WANG Yi-lei2,*

(1.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Heze University,Heze 274015,China; 2.Department of Life Science,Heze University,Heze 274015,China)

A poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode(PTRY/GCE)was prepared by cyclic voltammetry. The electrochemical behavior of diethylstilbestrol(DES)at the fabricated electrode was studied. A new method for the determination of DES in animal food was established. The experimental results showed that in pH5.0 phosphate buffer solution(PBS)system,DES appeared a pair of quasi redox peaks in the potential range of-0.2 to 0.8 V on the PTRY/GCE. The modified electrode showed a catalytic effect to the electrochemical reaction of DES. The oxidation peak current was proportional the concentratio of DES with a linear range of 5.00×10-8to 1.00×10-6mol/L and a limit of detection was 2.00×10-9mol/L. The RSD for 6 paralled determinations was 2.4%. The poly(tryptophan)modified glassy carbon electrode had good sensitivity,selectivity,and stability. The method could be applied to the determination of DES in beef,fish and milk powder with recoveries of 96.0%～102.3%. The results were satisfactory,and the method had practical value.

poly tryptophan;modified electrode;cyclic voltammetry;diethylstilbestrol

2016-11-23

馬心英(1971-),女,碩士,副教授,研究方向:電分析化學,E-mail:dhx3699@163.com。

*通訊作者:王宜磊(1964-),男,本科,教授,研究方向:微生物代謝與發酵,E-mail:wangyilei001@163.com。

山東省自然科學基金(ZR2014BL020);山東省高?？萍加媱濏椖?J14LC55);菏澤學院海外智力為國服務行動計劃。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0011-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.003