Day 3非優質胚胎繼續培養囊胚的應用價值研究

柴三明，王志強，張 霖，楊 杰，王 稱,2，倪亞莉*

(1.甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省出生缺陷防控研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730050)

·論 著·

Day 3非優質胚胎繼續培養囊胚的應用價值研究

柴三明1，王志強1，張 霖1，楊 杰1，王 稱1,2，倪亞莉1*

(1.甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省出生缺陷防控研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730050)

目的通過分析第3天(day 3，D3)移植及冷凍后非優質胚胎繼續培養的囊胚形成情況及其影響因素，探討非優質胚胎繼續培養囊胚在輔助生殖技術中的應用價值。方法374例體外受精-胚胎移植新鮮周期資料，首先以是否有囊胚形成分為有囊胎形成組278例和無囊胎形成組96例，比較2組臨床及實驗室指標之間的差異；比較不同年齡組、常規受精(in vitro fertilization,IVF)和卵胞漿內單精子注射(intra cytoplasmic sperm injection,ICSI) 2種授精方式、不同人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)注射日雌二醇(estradiol，E2)水平、不同成熟卵子數等因素之間囊胚形成率及優質囊胚率的差異，分析影響D3非優質胚胎繼續培養囊胚的臨床及實驗室因素；比較不同D3胚胎質量來源所形成囊胚的解凍妊娠率。結果374例患者共進行D3非優質胚胎繼續培養1 938個，形成囊胚952個，囊胚形成率49.1%(952/1 938)，優質囊胚率30.4%(590/1 938)。按年齡分為2組，年齡<35歲組囊胚形成率50.7%(875/1 727)和優質囊胚率31.6%(546/1 727)均明顯高于年齡≥35歲組的36.5%(77/211)和20.8%(44/211)，差異有統計學意義(P<0.05)。采用IVF受精后對非優質胚胎繼續培養，其囊胚形成率51.2%(694/1 356)、優質囊胚率33.0%(447/1 356)均較采用ICSI授精后43.4%(136/316)和25.6%(81/316)高，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著HCG日E2水平的增加和成熟卵子數量的增多，囊胚形成率和優質囊胚率也隨之增加。將D3非優質胚胎繼續培養后所形成的優質囊胚經單囊胚冷凍后行解凍移植，其臨床妊娠率雖然明顯較同期D3為優質胚胎來源的囊胚解凍妊娠率低(42.5%vs57.5%)(P<0.05)，但仍然獲得了較好的臨床妊娠率。結論非優質胚胎囊胚培養可在一定程度提高患者的卵子利用率，節約治療成本，但根據患者年齡、受精方式、基礎內分泌水平、成熟卵子數等自身條件的不同，其非優質胚胎繼續培養的利用價值及應用效果也不盡相同。

生殖技術；囊胚；妊娠率

囊胚培養技術始于20世紀90年代，隨著輔助生殖技術的不斷發展，囊胚培養技術也隨之不斷改進與完善。由于囊胚培養相比卵裂期胚胎延長了體外培養時間，可在一定程度上對攜帶有遺傳缺陷以及低發育潛能的胚胎進行初步的篩選和淘汰，而能夠發育至囊胚的胚胎具有更高的發育潛能及臨床種植能力，可獲得更高的臨床妊娠率[1]。在體外受精治療不孕患者時，胚胎質量是影響臨床治療結局的極其重要的因素，早期胚胎質量的評估對其后續發育潛能具有十分重要的預測作用。目前國內大多數輔助生殖機構均采用早期胚胎的形態學評分評估胚胎質量并進行移植胚胎及冷凍胚胎的選擇，對形態學評分較低的移植和冷凍后的剩余胚胎則進行繼續培養，待發育至囊胚階段后根據囊胚的形態學評分選擇質量較好的囊胚進行選擇性移植或冷凍，但第3天(day 3，D3)剩余胚胎囊胚培養的囊胚形成率、優質囊胚率、其在輔助生殖治療中的應用價值及影響因素至今在生殖醫學領域尚不能達成共識。本研究分析甘肅省婦幼保健院生殖中心數據資料，探討D3非優質胚胎繼續培養囊胚在輔助生殖技術治療中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1—12月在甘肅省婦幼保健院接受輔助生殖治療并在新鮮周期進行非優質胚胎繼續培養的不孕患者374例，年齡20～40歲，平均(29.8±4.5)歲。不孕原因：輸卵管因素302例，不明原因不孕72例。分組方法：①以是否有囊胚形成分為有囊胚形成組278例和無囊胚形成組96例，比較2組臨床及實驗室相關指標之間的差異；②以不同年齡、授精方式、不同人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)日雌二醇(estradiol，E2)水平、不同成熟卵子數等因素進行分組，分析影響D3非優質胚胎囊胚培養的臨床及實驗室因素；③以不同D3胚胎質量進行分組，比較組間囊胚解凍移植妊娠率。

1.2 臨床促排卵方案 所有患者均采用我中心常規短效長方案促排卵，患者于前次月經黃體中期開始采用皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa,Ipsen)，達降調標準后給予重組卵泡刺激素(Gona-F,Serono)或國產卵泡刺激素(麗申寶，珠海麗珠藥業)150～300 U/d 直到扳機日。當出現至少3個直徑>18 mm的卵泡后于當晚21時肌內注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后取卵。

1.3 授精

1.3.1 常規受精(in vitro fertilization,IVF) 本中心常規受精主要采用短時受精方式，即在肌內注射HCG后(40±1) h加精，加精3～6 h后反復吹打拆除顆粒細胞，判斷卵母細胞成熟度并根據第二極體排出與否初步評估受精情況，對常規受精失敗的卵母細胞實施補救性卵胞漿內單精子注射(intra cytoplasmic sperm injection,ICSI)。授精后16～18 h觀察原核以確定是否受精并將受精卵移入卵裂期胚胎培養液(G-1TM，瑞典Vitrolife公司)繼續培養。

1.3.2 ICSI 取卵后將卵子置于受精液中進行預培養，ICSI操作前拆除大部分顆粒細胞，觀察卵母細胞成熟度并對所有成熟卵母細胞行ICSI操作[ICSI操作液(G-MOPSTM，瑞典Vitrolife公司)，精子制動液(7%PVP，美國SAGE公司)]。

1.4 胚胎、囊胚培養及評分 參照Peter卵裂期胚胎評分系統[2]評估胚胎質量，將第3天發育到7～10個卵裂球的Ⅰ、Ⅱ級胚胎定義為優質胚胎，其余低評分胚胎為非優質胚胎。選擇優質胚胎移植或冷凍保存，將剩余正常受精來源的非優質胚胎轉入囊胚培養液(G-2，瑞典Vitrolife公司) 繼續培養至第5天或第6天，參照Gardner囊胚評分標準[3]進行囊胚形態學評分。①首先根據囊胚腔的大小和是否孵化，分為6個時期：1期，早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期，囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期，完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據了胚胎的總體積；4期，擴張囊胚，囊臟腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5期，正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期，孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對內細胞團和滋養層細胞進行分級。②內細胞團：A級，細胞數目多，結合緊密；B級，細胞數目較少，結合較松散；C級，細胞數目極少。③滋養層細胞：A級，上皮細胞層由較多的細胞組成，結構致密；B級，上皮細胞層由不多的細胞組成，結構較松散；C級，上皮細胞層由稀疏的細胞組成。如某囊胚為4期囊胚，內細胞團評分為B，滋養層細胞評分為B，則該囊胚評分為4BB。將囊胚評分在4BB及以上者定義為優質囊胚。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 有囊胚形成組和無有囊胚形成組相關資料比較 按D3剩余胚胎繼續培養后是否有囊胚形成進行分成2組。2組不孕年限、基礎催乳素(basal prolactin, bPRL)、基礎睪酮(basal testosterone,bT)、HCG日黃體生成素(luteinzing hormone,LH)、HCG日孕酮(progesterone,P)差異均無統計學意義(P>0.05)；無囊胚形成組年齡、Gn時間、基礎卵泡刺激素(basal follicle-stimulating hormone,bFSH)的含量多于或大于有囊胚形成組，14 mm以上卵泡數、獲卵數、成熟卵子數、基礎黃體生成素(basal luteinzing hormone,bLH)、基礎雌二醇(basal estradiol,bE2)，HCG日E2低于有囊胚形成組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別例數年齡(歲)不孕年限(年)Gn時間(d)14mm以上卵泡數(個)獲卵數(個)成熟卵子數(個)bLH(mU/L)有囊胚形成組27829.33±4.273.85±2.7911.03±1.6421.48±7.9816.90±6.9915.27±6.156.27±5.24無囊胚形成組9630.99±5.314.27±3.2611.47±1.8914.05±7.4310.42±5.869.36±5.454.48±3.11t2.7911.1942.0528.0048.1588.3454.019P0.0060.2330.0420.0000.0000.0000.000組別例數bE2(nmol/L)HCG日E2(nmol/L)bFSH(mU/L)bPRL(mU/L)bT(nmol/L)HCG日LH(mU/L)HCG日P(nmol/L)有囊胚形成組2780.20±0.1619.96±10.326.26±1.86293.62±177.873.50±15.271.37±2.553.37±2.77無囊胚形成組960.16±0.0914.17±11.346.71±1.92283.02±148.824.19±14.801.28±1.702.99±1.72t3.0414.4191.9930.5200.2970.3501.279P0.0030.0000.0470.6030.7670.7260.202

2.2 不同年齡及受精方式囊胚形成情況比較 374例患者進行D3非優質胚胎培養1 938個，共形成囊胚952個，囊胚形成率49.1%(952/1 938)，優質囊胚590個，優質囊胚形成率30.4%(590/1 938)。按年齡分為2組，年齡<35歲組其囊胚形成率和優質囊胚率均明顯高于年齡≥35歲組，差異有統計學意義(P<0.05)。根據患者自身條件不同，采用了多種受精方式，其中以IVF(251例)和ICSI為主(74例)，采用IVF受精后其囊胚形成率及優質囊胚率均較ICSI高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同年齡及不同授精方式囊胚形成率比較Table 2 Comparison of blastocyst formation rates at different ages and different fertilization methods (個數,%)

2.3 不同E2水平和不同成熟卵數之間囊胚形成情況 根據HCG日E2水平分為≤12.81 nmol/L組、>12.81～18.30 nmol/L和>18.30 nmol/L組?！?2.81 nmol/L組囊胚形成率明顯低于>12.81～18.30 nmol/L組和>18.30 nmol/L組，差異有統計學意義(P<0.05)；> 12.81～18.30 nmol/L組與>18.30 nmol/L組之間囊胚形成率差異無統計學意義(P>0.05)；3組間優質囊胚率差異也無統計學意義(P>0.05)。按照成熟卵子數分為≤4個、>4～15個，>15個3組，成熟卵子數≤4個組的囊胚形成率和優質囊胚率均較成熟卵子數>4～15個組和>15個組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同E2水平及不同成熟卵數之間囊胚形成率比較Table 3 Comparison of blastocysts formation rates between different E2 levels and different mature eggs (個數，%)

*P<0.05與①比較(χ2檢驗)

2.4 不同來源囊胚解凍移植情況比較 將D3非優質胚胎繼續培養后所形成優質囊胚單囊胚冷凍后行解凍移植，囊胚解凍后成功復蘇88例作為D3非優質胚胎組；同期解凍移植來源于D3優質胚胎繼續培養所形成的囊胚240例作為D3優質胚胎組。觀察2組臨床結局。相比D3優質胚胎來源的囊胚，D3非優質胚胎所形成囊胚的解凍妊娠率明顯較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同D3胚胎質量來源的囊胚移植后臨床結局比較Table 4 Comparison of clinical outcome after blastocysts transplantation from different D3 embryo quality (例數，%)

3 討 論

在體外受精治療中，胚胎質量是影響周期治療結果的重要因素之一[4-5]。隨著體外受精-胚胎移植技術的不斷發展以及囊胚培養技術的不斷提高，近年來許多輔助生殖機構已開展囊胚培養技術，尤其非優質胚胎的囊胚培養已經成為各生殖中心對移植冷凍后非優質胚胎的主要處理對策。許多研究表明，將非優質胚胎進行體外繼續培養后，仍有一部分胚胎能發育為囊胚且在將這些囊胚進行移植后可使不孕患者成功妊娠，提高患者的胚胎利用率及累積妊娠率，降低患者的治療成本[6-9]。本研究結果顯示非優質胚胎體外繼續培養后其囊胚形成率為49.12%，優質囊胚形成率為30.44%。略高于Zhu等[10]報道的囊胚形成率(43.59%)和優質囊胚率(24.25%)，這可能與不同中心之間在臨床超促排卵方案、實驗室培養環境以及胚胎和囊胚評分系統的差異有關。非優質胚胎繼續培養仍然能夠獲得較為理想的囊胚形成率及優質囊胚率，將在一定程度上為不孕患者提供更多移植機會，提高不孕患者的卵子利用率。

年齡是目前已知的預示女性生育能力的重要因素之一，女性年齡與卵母細胞的質量密切相關[11-12]。女性卵巢儲備功能隨著年齡的不斷增長而逐漸降低，其自主排卵能力以及體外受精治療成功率也隨之下降。在IVF助孕周期中，隨著女性年齡的不斷增大，其周期獲卵數不斷減少，胚胎種植率也明顯降低，提示其卵巢儲備庫卵母細胞數目和質量貯備能力均在逐漸衰竭[13-14]。本研究結果顯示，年齡<35歲的患者，其非優質胚胎繼續培養后的囊胚形成率和優質囊胚率均明顯高于年齡≥35歲的患者。表明隨著年齡的不斷增加，其非優質胚胎的發育潛能也在不斷降低。

本研究通過比較不同授精方式之間囊胚形成情況，發現采用IVF授精后非優質胚胎的囊胚形成率和優質囊胚率明顯高于ICSI授精。這可能主要與2種不同授精方式的精卵結合機制有關，ICSI前卵母細胞脫顆粒、ICSI注射針對卵膜的穿刺、培養液隨著注射操作進入胞漿等都可能對胚胎的后續發育潛能產生影響。此外，ICSI授精時授精者僅可通過精子形態學特征評估并選擇精子進行注射，無法識別精子內部結構是否存在異常，而在進行IVF授精時卵周顆粒細胞可對精子進行進一步篩選，使得在IVF過程中最后發生精卵結合的精子其DNA完整性明顯優于不能結合的精子。相關研究表明，精子DNA碎片增多雖然并不影響卵母細胞授精，但可明顯降低其囊胚形成率，影響胚胎的后續發育潛能[15-17]。因此，相對于ICSI，常規IVF授精后的非優質胚胎具有更好的發育潛能，利用價值較高。

本研究通過比較有無囊胚形成2組間HCG日E2水平發現，有囊胚形成組HCG日E2水平明顯高于無囊胚形成組(P<0.05)。此外，本研究還分析了HCG日E2水平與非優質胚胎囊胚形成情況的關系，發現HCG日E2水平≤12.81 nmol/L時，其囊胚形成率明顯低于>12.81～18.30 nmol/L組及>18.30 nmol/L組；而>12.81～18.30 nmol/L組與>18.30 nmol/L組之間，囊胚形成率差異無統計學意義(P>0.05)；3組間優質囊胚率差異差異也無統計學意義(P>0.05)。提示當HCG日E2低于一定水平時，其可能通過影響胚胎的后續發育潛能而降低囊胚形成率。但本研究顯示不同HCG日E2水平時各組之間優質囊胚率差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與本研究樣本量較小以及不同中心胚胎評估系統的差異所致，仍需進一步擴大樣本加以探討。

本研究通過分析成熟卵子與非優質胚胎囊胚形成情況的關系發現，隨著不孕患者所獲得的成熟卵子數不斷增加，其非優質胚胎繼續培養后囊胚形成率明顯提高，但當所獲成熟卵子數≤4個時，其優質囊胚率將會明顯降低。提示對于周期所獲成熟卵子數≤4個的患者，非優質胚胎囊胚培養并非最佳的胚胎處理手段，可根據患者實際情況進一步選擇D3冷凍或繼續培養囊胚，以求獲得最佳的效果。

本研究通過比較不同來源囊胚解凍后單囊胚移植的臨床妊娠率發現，D3非優質胚胎繼續培養后其優質囊胚的解凍移植仍然能夠獲得較好的臨床妊娠率，但相比D3優質胚胎來源的囊胚，其解凍移植后的臨床妊娠率明顯較低。表明D3非優質胚胎繼續培養后優質囊胚解凍移植的臨床妊娠率雖然低于D3優質胚胎來源的囊胚，但其仍然具有較高的利用價值，可作為D3移植后無更多可利用胚胎患者的胚胎處理方案，從而提高該部分患者的卵子利用率，降低患者的治療成本。

綜上所述，D3非優質胚胎繼續培養后仍然具有形成囊胚和優質囊胚的潛能，但其囊胚形成率及優質囊胚率與患者自身條件的優劣有關。有關臨床因素對D3非優質胚胎繼續培養影響的相關研究較少。本研究結果顯示，年齡、HCG日14 mm以上卵泡數、獲卵數、成熟卵子數、基礎LH、基礎E2以及HCG日E2水平均與非優質胚胎繼續培養后囊胚形成有關。因此，在實際臨床工作中，應該根據患者臨床及實驗室因素綜合考慮，評估非優質胚胎繼續培養在不孕不育患者中應用的合理性。

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(本文編輯：許卓文)

Study on application value of blastocysts derived from poor quality embryos on day 3

CHAI San-ming1, WANG Zhi-qiang1, ZHANG Lin1, YANG Jie1, WANG Cheng1,2, NI Ya-li1*

(1.ReproductiveMedicalCenterofGansuProvincialMaternityandChild-careHospital,Lanzhou730050,China; 2.CultivationBaseofKeyLaboratoryofGansuProvincialBirthDefectsPreventionandControl,Lanzhou730050,China)

Objective To explore the application value of blastocysts derived from poor quality embryos on day 3(D3) through its blastulation rate and high quality blastocyst formation rate. Methods Three hundred and seventy-four in vitro fertilization-embryo transplantation were divided into two groups with blastulation or not after further culture of poor quality embryos on D3. Women′s age, insemination methods, estradiol on the day of human chorionic gonadotropin injection and the number of mature oocytes were also analyzed. Results The blastulation rate of 1 938 D3 poor quality embryos from 374 patients was 49.1%(952/1 938) and the high quality blastocyst formation rate was 30.4%(590/1 938). The blastocyst formation rate of patients low than 35 years old was 50.7%(875/1 727) and the high quality blastocyst formation rate was 31.6%(546/1 727), which was statistically higher than the patients more than 35 years old 36.5%(77/211), 20.8%(44/211). In vitro fertilzation blastulation rate and high quality blastocyst formation rate was significantly higher than intra cytoplasmic sperm injection blastulation rate: 51.2%(694/1 356)vs43.0%(136/316), high quality blastocyst formation rate:33.0%(447/1 356)vs25.6%(81/316). Patients who have more mature oocytes and much higher estradiol on the day of human chorionic gonadotropin injection, they would have more blastocyst and high quality blastocyst. The clinical pregnancy rate after transplanted the blastocysts came from D3 poor quality embryos was 42.5%, which was significantly lower than the blastocysts from D3 high quality embryos(57.5%). Conclusion Further culture of D3 poor quality embryos can increase the utilization ratio of patients oocytes and decrease the costs of treatment. But according to the patient′s age, the mode of fertilization, the basal endocrine level, the number of mature eggs and other conditions, the utility value and application effect of non quality embryo continuous culture are not the same.

reproductive techniques; blastula; pregnancy rate

2017-03-21；

2017-05-05

甘肅省衛生行業科研計劃項目(GSWSKY-2015-19)；甘肅省國際科技合作專項(1504WKCA060)；甘肅省重點實驗室專項(1506RTSA158)

柴三明(1968-)，男，甘肅秦安人，甘肅省婦幼保健院副主任醫師，醫學學士，從事生殖醫學研究。

*通訊作者。E-mail：niyali@126.com

R339.2

A

1007-3205(2017)08-0901-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.008