低氧培養對小鼠胚胎成纖維細胞生長和線粒體分布及功能的影響

王 春，魏含清，裴軼勁

(廣東醫科大學基礎醫學院生理學教研室/干細胞與再生醫學研究所，廣東東莞 523808)

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·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.003

低氧培養對小鼠胚胎成纖維細胞生長和線粒體分布及功能的影響

王 春，魏含清，裴軼勁△

(廣東醫科大學基礎醫學院生理學教研室/干細胞與再生醫學研究所，廣東東莞 523808)

目的 研究低氧培養條件對小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的生長和線粒體分布及功能的影響。方法 將MEFs分為20%氧濃度的常氧培養組和5%氧濃度的低氧培養組連續培養，每24小時采用臺盼藍染色對MEFs活細胞計數；Mito-Tracker Green對細胞線粒體染色并在激光共聚焦顯微鏡下觀察；腺苷三磷酸(ATP)試劑盒檢測ATP合成。結果 對數生長期低氧培養組活細胞數高于常氧培養組，差異有統計學意義(P<0.05)；并且低氧培養組細胞內線粒體核周分布型比例高于常氧培養組，差異有統計學意義(P<0.05)；同時兩組細胞內ATP水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 低氧培養條件影響線粒體在MEFs細胞內的分布和能量的合成，對細胞生長的促進作用高于常氧培養。

低氧；小鼠胚胎成纖維細胞；線粒體分布；腺苷三磷酸

氧是細胞必要的生存條件，是細胞增殖、分化、凋亡等生理功能調節的重要的因素。大多數細胞體外培養是將細胞置于與空氣中氧濃度近似的常氧條件下進行[1]。體外細胞培養系統往往是模擬體內環境建立起來的，但大多數培養系統都采取與空氣中的氧濃度一致的培養條件。但在正常的生理狀況下體內細胞組織所處的微環境與體外環境是有區別的，因此逐漸有研究嘗試降低氧濃度對細胞進行培養并且已證明不同的氧濃度對細胞狀態的影響[2-7]。線粒體是存在于真核細胞中的細胞器，是維持生命活動的能力工廠，是除細胞核外唯一具有遺傳效應的細胞器，其主要功能是合成腺苷三磷酸(ATP)。目前已有研究表明線粒體的特征與卵母細胞的成熟[8-9]、干細胞的“干性”維持[10]及分化[11-12]有非常密切的聯系。線粒體形態、膜電位、能量代謝等參數在卵母細胞成熟前后，以及干細胞分化前后有非常明顯的變化[10，13]。

小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)應用廣泛，在胚胎干細胞和誘導性多能干細胞的培養中，經過絲裂霉素或γ射線處理終止生長后作為支撐干細胞生長的滋養層使用[14-16]。滋養層的質量好壞關乎著干細胞的生長，如何建立穩定高效的MEFs培養體系仍在不斷地嘗試中。MEFs的常規培養是在常氧條件下，對MEFs在低氧培養條件下的生長狀況及線粒體的研究較少。本實驗在低氧條件下培養MEFs，觀察其生長、線粒體分布及功能等指標的變化，有助于進一步闡明低氧條件下線粒體分布與能量代謝的關系，為優化培養條件提供相關證據，并為MEFs培養體系的優化及后續干細胞的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基、杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)、0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)均購于美國Gibco公司；ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit試劑盒購于美國Sigma公司；Mito-Tracker Green試劑盒購于中國碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 MEFs的分離培養與分組 取懷孕13.5～14.5 d昆明孕鼠，脫頸處死，在無菌條件下將鼠胚從孕鼠體內分離，去除頭、尾、四肢及內臟后剪碎并用胰蛋白酶消化收集細胞懸液，1 500 r/min離心5～10 min后去上清液，用含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，鋪入培養瓶中，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。每2～3天換液1次，細胞生長至對數生長期傳代，傳代比例為1∶3至1∶6。MEFs以相同的密度傳代接種至培養皿中，分為常氧培養組(37 ℃、5%CO2、20%O2)和低氧培養組(37 ℃、5%CO2、5%O2)，連續培養1個生長周期，每天相差顯微鏡下觀察。

1.2.2 MEFs生長曲線的繪制 采用臺盼藍染色法，按1.76×104/cm2的密度傳代接種至培養皿中，連續培養；每24小時取各組3個皿計數，實驗重復3次。0.05%胰蛋白酶消化細胞，制備成細胞懸液，臺盼藍染色后血球計數板計數。然后以時間為橫坐標，活細胞數為縱坐標繪制MEFs生長曲線。

1.2.3 MEFs線粒體分布類型鑒定 每隔24小時各組取3個皿用Mito-Tracker Green染色[10-11]。根據說明書按照1∶5 000的比例將1 mmol/L Mito-Tracker Green儲存液與MEFs完全培養基混合配制成Mito-Tracker Green染色工作液，37 ℃孵育45 min，去除Mito-Tracker Green染色工作液加入37 ℃預溫的新鮮MEFs完全培養基，在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下488 nm處觀察。在低倍視野中選取3個不同的視野，觀察視野中細胞內線粒體的分布類型并計算各類型的百分比。鑒定時，染色效果不佳、細胞部分結構不在視野內、細胞結構不完整，以及細胞重疊導致無法辨別線粒體分布類型的細胞不在鑒定的范圍之內。實驗重復3次。

1.2.4 細胞內ATP水平檢測 用ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit對細胞內ATP水平進行測定，根據試劑盒說明制作ATP標準曲線。每隔24小時收集各組細胞，用100 μL ATP Assary Buffer裂解1×106個細胞，去除蛋白后加入相應體積ATP反應液，混合均勻避光孵育30 min，多功能酶標儀檢測570 nm處吸光度(A)值，根據ATP標準曲線計算每1×106細胞中的ATP水平。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 常氧和低氧條件對MEFs生長的影響 MEFs在傳代后第2天開始進入對數生長期，活細胞量急劇增加；第5天活細胞數達到最高峰，之后細胞進入衰老期，MEFs活細胞數開始減少；第8天后，活細胞數趨于穩定。同時，在低氧環境下MEFs的活細胞量始終高于常氧培養的細胞，并在MEFs對數生長期細胞增殖速度相對常氧培養逐漸增大(圖1)。傳代后第1～3天及第6～7天低氧培養組的MEFs活細胞數與常氧培養組的MEFs活細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；傳代后第4～5天和第8～10天低氧培養組的MEFs活細胞數與常氧培養組的MEFs活細胞數比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 常氧、低氧培養生長周期中線粒體分布類型變化 在整個生長周期中，無論是常氧還是低氧培養，MEFs細胞內線粒體形態多為桿狀，線粒體分布類型多樣。根據線粒體在細胞內分布狀況將其主要分為：(1)線粒體核周分布型，該類型細胞中線粒體集中分布于細胞核周圍，越往細胞膜方向線粒體的熒光強度逐漸減弱甚至消失(圖2A、2D)；(2)線粒體均勻分布型，該類型細胞中線粒體均勻分布于細胞質中，細胞質中線粒體的熒光強度無明顯變化(圖2B、2E)；(3)線粒體聚集分布型，該類型細胞中線粒體聚集于細胞質某些部位，線粒體熒光強度比其他部位明顯增強，并且細胞內線粒體熒光強度變化無明顯規律(圖2C、2F)。

表1 MEFs在常氧和低氧培養下的細胞數比較

-：無數據

細胞傳代貼壁后，細胞內線粒體分布類型開始以核周分布為主，隨著細胞培養時間延長，線粒體均勻分布類型所占比例逐漸上升；線粒體聚集分布類型在細胞內的比例一直相對較小，但也隨細胞培養時間延長而增加。貼壁第1天常氧培養組細胞線粒體核周分布型占74.4%，在低氧培養組細胞中占72.5%；第4天開始常氧培養組細胞線粒體核周分布型所占比例低于50.0%，第5天開始低氧培養組細胞線粒體核周分布型所占比例低于50.0%，相反線粒體均勻分布型比例超過50.0%(表2)。經統計學分析，常氧和低氧培養組MEFs在第4～5天線粒體核周分布型、均勻分布型比例比較，差異有統計學意義(P<0.05)；同一天低氧培養組細胞線粒體核周分布型所占比例高于常氧培養組細胞，低氧培養組細胞線粒體均勻分布型所占比例則要低于常氧培養條件(圖3)。

2.3 常氧、低氧培養對MEFs生長周期中ATP水平的改變 常氧和低氧培養組MEFs中ATP水平貼壁第1天開始往下降，至第5天降為最低，然后急劇上升，至第7天達到最高，第8天再下降；MEFs傳代貼壁生長第1天，常氧培養組細胞ATP水平高于低氧培養組，自第2天起，低氧培養組細胞ATP水平高于常氧培養組(圖4A、B)；常氧和低氧培養組MEFs細胞內ATP水平在傳代后第1～3天和第9天比較，差異無統計學意義(P>0.05)；MEFs在第4～8天對數生長期和第10天衰老期，常氧和低氧培養組細胞內ATP水平比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表3。

A：線粒體核周分布型；B：線粒體均勻分布型；C：線粒體聚集分布型；D：核周分布型線粒體熒光強度；E：均勻分布型線粒體熒光強度；F：聚集分布型線粒體熒光強度；標尺為20 μm，紅色線條為熒光強度檢測位置

圖2 MEFs細胞線粒體分布類型

*：P<0.05，與同一天低氧培養組比較

A：常氧培養組細胞線粒體分布類型變化；B：低氧培養組細胞線粒體分布類型變化；C：線粒體核周分布類型變化；D：線粒體均勻分布類型變化；E：線粒體聚集分布類型變化

圖3 隨培養時間延長在常氧和低氧培養下的MEFs線粒體分布類型變化

A：常氧和低氧培養的MEFs在不同時間ATP水平柱狀圖；B：常氧和低氧培養的MEFs在不同時間ATP水平折線圖；#：P<0.05，差異有統計學意義；##：P<0.01，差異有統計學意義

圖4 常氧和低氧培養隨時間MEFs細胞內ATP水平變化

3 討 論

氧氣在細胞生命活動中是必不可少的因素，目前細胞體外培養體系大部分提供的氧氣濃度與空氣中的氧濃度一致，但在正常的生理狀況下體內細胞組織所處的微環境與體外環境是有區別的，例如：動脈血中氧濃度為12%，成年人組織中平均氧濃度為3%～5%[17-18]。因此關于不同氧濃度對細胞影響的研究也取得了一定的成果，這包括干細胞[2-3]、成體細胞[4]等。在對成體干細胞體外培養時發現，包括神經干細胞、間充質干細胞、造血干細胞等，在低氧環境中細胞增殖、存活率、集落生成、分化能力有明顯的提升[5-7]。

線粒體是細胞質中廣泛分布的細胞器。有研究指出，在卵母細胞成熟過程中線粒體的功能成熟是細胞質成熟的一個重要指標，其分布和代謝活性是細胞質成熟的重要標志，并且在成熟的細胞質中具有線粒體重分布的能力[8]；并指出影響線粒體分布很重要的一個因素就是卵母細胞的成熟和胚胎的發育[19]，線粒體在未成熟的細胞中以周邊分布為主，而成熟的細胞則以均勻分布為主。也有研究者提出，線粒體的特征可作為干細胞性能維持的“干性”指標，在干細胞增殖分化的過程中，線粒體有著較明顯的變化，線粒體形態、定位等特性是評定多能性干細胞是否具備多能性的標志[10]。有研究顯示，在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化的研究過程中發現，分化后細胞的線粒體膜電位、活性氧(ROS)水平及線粒體鈣含量等參數要低于分化前的細胞，證實了小鼠胚胎干細胞分化后線粒體功能下降[13]。同時還有研究表明，線粒體動力學和分布的正常運行對細胞生存是至關重要的，尤其是神經細胞[20]。

線粒體是細胞進行生命活動的主要能量來源，細胞通過線粒體的氧化磷酸化生成ATP供能，在低氧環境中線粒體氧化磷酸化過程受到抑制影響ATP的生成。但是有研究證明，在緩慢持續的低氧環境中線粒體的功能會得到恢復。本研究結果顯示，MEFs在轉入低氧環境中后，ATP水平出現了下降的現象，隨時間的增加，ATP水平逐漸上升。這也說明線粒體功能在低氧初期受到了一定的影響，后期功能恢復正常。

MEFs傳代貼壁，處于分裂增殖旺盛期時，細胞核相對細胞質活躍，線粒體需要圍繞細胞核為細胞的分裂增殖提供大量的能量，線粒體主要分布在細胞核周圍；絕大多數細胞呈現出典型的線粒體核周分布類型。MEFs經過對數生長期的生長與增殖，細胞數量增多，細胞密度增大，在一定程度上抑制了細胞的分裂，在此期間，細胞產生的能量更多的是為了維持細胞的形態和各項功能的正常，所以細胞質相對細胞核較為活躍，大多數線粒體表現為均勻分布型，為維持細胞的正常生理功能提供能量。相對常氧培養環境，低氧環境對細胞分裂增殖的促進作用更為明顯，線粒體核周分布狀態持續時間更長，在細胞分裂增殖期間，線粒體生成的ATP水平更高，這有利于細胞的分裂、增殖。本研究結果中，低氧培養條件下MEFs在經過細胞的分裂增殖后活細胞數量多于常氧培養也證實了這一說法。

綜上所述，低氧培養條件對MEFs生長和線粒體分布及功能具有較大的影響。但對于低氧培養條件影響MEFs線粒體功能的相關機制還需要更進一步的研究。

[1]Weidmann C，Pomerleau J，Trudel-Vandal L，et al．Differential responses of choroidal melanocytes and uveal melanoma cells to low oxygen conditions[J]．Mol Vis，2017，12(23)：103-115．

[2]Zhao T，Zhang CP，Liu ZH，et al．Hypoxia-driven proliferation of embryonic neural stem/progenitor cells - role of hypoxia-inducible transcription factor-1 alpha[J]．FEBS J，2008，275(8)：1824-1834．

[3]Estrada JC，Albo C，Benguria A，et al．Culture of human mesenchymal stem cells at low oxygen tension improves growth and genetic stability by activating glycolysis[J]．Cell Death Differ，2012，19(5)：743-755．

[4]Dai T，Zheng H，Fu GS．Hypoxia confers protection against apoptosis via the PI3K/Akt pathway in endothelial progenitor cells[J]．Acta Pharmacol Sin，2008，29(12)：1425-1431.

[5]Morrison SJ，Csete M，Groves AK，et al．Culture in reduced levels of Oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells[J].J Neurosci，2000，20(19)：7370-7376.

[6]Deschepper M，Oudina K，David B，et al．Survival and function of mesenchymal stem cells (MSCs) depend on glucose to overcome exposure to long-term,severe and continuous hypoxia[J]．J Cell Mol Med，2011，15(7)：1505-1514.

[7]Roy S，Tripathy M，Mathur N，et al．Hypoxia improves expansion potential of human cord blood-derived hematopoietic stem cells and marrow repopulation efficiency[J]．Eur J Haematol，2012，88(5)：396-405．

[8]劉姍，李媛，高選，等．人卵母細胞體外成熟前后線粒體分布的變化[J]．解剖學報，2007，38(5)：593-596．

[9]Takahashi Y，Hashimoto S，Yamochi T，et al．Dynamic changes in mitochondrial distribution in human oocytes during meiotic maturation[J]．J Assist Reprod Genet，2016，33(7)：929-938．

[10]Lonergan T，Brenner C，Bavister B．Differentiation-related changes in mitochondrial properties as indicators of stem cell competence[J]．J Cell Physiol，2006，208(1)：149-153．

[11]Xu XL，Duan SL，Yi F，et al．Mitochondrial regulation in pluripotent stem cells[J]．Cell Metab，2013，18(3)：325-332．

[12]Prowse AB，Chong F，Elliott DA，et al．Analysis of mitochondrial function and localisation during human embryonic stem cell differentiation in vitro[J]．PLoS One，2012，7(12)：e52214．

[13]Heo HJ，Kim HK，Youm JB，et al．Mitochondrial pyruvate dehydrogenase phosphatase 1 regulates the early differentiation of cardiomyocytes from mouse embryonic stem cells[J]．Exp Mol Med，2016，48(8)：e254．

[14]Jasmin，Peters VM，Spray DC，et al．Effect of mesenchymal stem cells and mouse embryonic fibroblasts on the development of preimplantation mouse embryos[J]．In Vitro Cell Dev Biol Anim，2016，52(4)：497-506．

[15]Yang H，Qiu Y，Zeng X，et al．Effect of a feeder layer composed of mouse embryonic and human foreskin fibroblasts on the proliferation of human embryonic stem cells[J]．Exp Ther Med，2016，11(6)：2321-2328．

[16]Takahashi Y，Hashimoto S，Yamochi T，et al．Dynamic changes in mitochondrial distribution in human oocytes during meiotic maturation[J]．J Assist Reprod Genet，2016，33(7)：929-938．

[17]Hardman JG，AL-Otaibi HM．Prediction of arterial Oxygen tension:validation of a novel formula[J]．AM J Respir Crit Care Med，2010，182(3)：435-436．

[18]Silver I，Erecińska M．Oxygen and ion concentrations in normoxic and hypoxic brain cells[J]．Adv Exp Med Biol，1998，454：7-16．

[19]Dos Santos F，Andrade PZ，Boura JS，et al．Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells:a more effective cell proliferation kinetics and metabolism under hypoxia[J]．J Cell Physiol，2010，223(1)：27-35．

[20]Walczak J，Szczepanowska J．Dysfunction of mitochondrial dynamic and distribution in Amyotrophic Lateral Sclerosis[J]．Postepy Biochem，2015，61(2)：183-190．

Effects of hypoxia on the growth,mitochondria distribution and function of mouse embryonic fibroblast*

WangChun，WeiHanqing，PeiYijin△

(PhysiologyTeachingandResearchSection,InstituteofStemCellandRegenerativeMedicine/DepartmentofBasicMedicalSciences,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China)

Objective To explore the effects of hypoxia on the growth,mitochondria distribution and function of mouse embryonic fibroblasts(MEFs).Methods MEFs were sub-cultured in the hypoxia group containing 5% oxygen and normal oxygen group containing 20% oxygen,every 24 hours,living MEFs were counted by using trypan blue staining.Mito-Tracker Green was used to stain mitochondria,then cells were observed by using laser confocal microscope.The ATP kit was used to detect ATP synthesis.Results During the logarithmic phase,the numbers of living cells in the hypoxia group were higher than those in the normal oxygen group,the differences were statistically significant (P<0.05).The percentages of perinuclear mitochondrial in the hypoxia group were higher than those in the normal oxygen group,the differences were statistically significant (P<0.05).Meanwhile,the significant difference was found in the ATP level between the two groups (P<0.05).Conclusion The distribution of mitochondria in MEFs and energy synthesis are influenced by the hypoxic culture condition,which could be better for promoting cell growth compared with normal oxygen culture condition.

hypoxia；mouse embryonic fibroblasts；mitochondrial distribution；adenosine triphosphate

國家自然科學基金項目(81173136)；廣東省科技計劃項目(2013B022000003)；廣東省基礎與應用基礎研究專項(廣東省自然科學基金)(2015A030313524)；廣東省東莞市國際科技合作(含港澳臺)項目(2015508102004)。 作者簡介：王春(1990-)，在讀碩士，主要從事干細胞與發育毒性方面的研究?！?/p>

，E-mail：pyj@gdmu.edu.cn。

R394.1；R329.2+5

A

1671-8348(2017)19-2599-05

2017-02-03

2017-04-08)