基于蛋白質交聯的氧化酶特性與應用

程 珊， 王穩航，*， 路福平

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院， 天津 300457； 2.天津科技大學 生物工程學院， 天津 300457)

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基于蛋白質交聯的氧化酶特性與應用

程 珊1， 王穩航1，*， 路福平2，*

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院， 天津 300457； 2.天津科技大學 生物工程學院， 天津 300457)

蛋白質交聯屬于蛋白質改性修飾的一部分，是重組食品與新型食品制造的重要內容。與化學交聯、物理交聯相比，酶法交聯因其反應條件溫和、不產生副產物、交聯效果好等特點，成為最為容易接受的一種蛋白質交聯方式。除谷氨酰胺轉胺酶外，一些氧化酶也被證明能夠在蛋白質分子間形成共價鍵而形成交聯。介紹了目前應用較多的酚氧化酶(酪氨酸酶、漆酶)、過氧化物酶以及賴氨酰氧化酶的酶學性質、交聯機制等，并對其在食品蛋白質交聯中研究現狀以及潛在應用進行總結與展望。

氧化酶； 蛋白質修飾； 氧化； 共價交聯

隨著食品材料科學研究的快速發展，對蛋白質交聯研究逐漸增多[1-2]。蛋白質交聯是指通過一定的化學試劑或催化劑，在蛋白質內部多肽鏈之間(分子內交聯)或蛋白質之間(分子間交聯)形成共價鍵。在蛋白質形成共價鍵的過程中，根據反應方式可以分為化學交聯、物理交聯和酶法交聯。與化學交聯、物理交聯相比，酶法交聯因其反應條件溫和、不產生副產物、交聯效果好等特點，成為最為容易接受的一種蛋白質交聯方式。目前，已證明蛋白質中有幾個酶交聯的重要活性基團如谷氨酰胺、賴氨酸、酪氨酸和半胱氨酸殘基等。蛋白質的酶法共價交聯主要為轉?；宦?也就是谷氨酰胺轉氨酶交聯)和氧化交聯。目前，利用谷氨酰胺轉氨酶進行蛋白質交聯的研究已比較深入[3-5]，利用氧化酶進行蛋白質氧化交聯也開始引起人們廣泛關注[6-9]。為此，本文對近年來國內外食品蛋白質的酶法氧化修飾研究及在蛋白質交聯中的應用進行綜述，以期為食品蛋白質酶法交聯的進一步研究提供參考。

1 蛋白質的酶法氧化交聯

1.1 蛋白質交聯機制

蛋白質交聯的主要機制包括(如圖1[10])：1)蛋白質羰基與賴氨酸殘基反應，形成希夫堿交聯衍生物；2)組氨酸、賴氨酸或半胱氨酸殘基與4 -羥基壬烯醛(HNE)等α,β -不飽和醛發生邁克爾加成反應(Michael addition)形成醛加合物，再進一步與其他賴氨酸反應生成希夫堿- 蛋白質交聯衍生物[11]；3)多不飽和脂肪酸氧化形成丙二醛等二醛分子與兩分子不同的蛋白質的賴氨酸殘基反應，形成蛋白質- 蛋白質交聯衍生物[10]。

圖1 基于羰- 氨反應的蛋白質交聯Fig.1 Protein cross -linking based on carbonyl -amino reaction

1.2 蛋白質的酶法氧化交聯特性

蛋白質的酶法交聯也稱酶法聚合改性，是指通過酶試劑在蛋白質內部多肽鏈之間(分子內交聯)或蛋白質之間(分子間交聯) 形成共價鍵，改變蛋白質的結構，從而達到改善蛋白質功能特性的目的。酶法交聯是蛋白質改性的重要組成部分，隨著食品重組技術與產品的不斷推廣，其角色日益舉足輕重。目前能催化蛋白質發生交聯作用的酶主要有谷氨酰胺轉氨酶(TG)和一些氧化酶，如多酚氧化酶和過氧化物酶，后者涉及蛋白質氧化反應。蛋白質氧化是指在自由基及其相關氧化物的作用下，某些特定的氨基酸殘基發生反應，使蛋白質功能與結構發生變化，如：對氧化物的親和力增強，易于水解、聚合和交聯。氧化酶可通過直接作用蛋白質的基團如巰基使其氧化為二硫鍵而形成共價交聯，也可以先氧化蛋白質或其他前體分子生成醌類、自由基、過氧化氫等活性交聯劑，再與蛋白質中特定的化學基團產生非酶反應而產生一系列的交聯反應。應該說，目前除去TG酶介導的蛋白質交聯外，其他酶法改性而形成的共價交聯均屬于氧化交聯。

1.3 氧化酶種類與催化原理

圖2 酪氨酸酶催化反應機制Fig.2 Reaction mechanism of tyrosinase

氧化酶是一類催化從一個分子(氧化劑、氫供體或電子供體)到另一個分子(還原劑、氫受體或電子受體)電子轉移的酶。兩個蛋白質分子之間共價鍵的形成是由氧化還原酶類發起的，涉及至少兩個連續的化學步驟。在這些反應中，只有初始氧化反應與初始底物是由酶直接催化的，由此產生的活性產物例如醌類、自由基類或者醛類可能會在隨后經歷非酶催化轉化反應而形成各種類型的共價鍵。

在食品加工中有潛在應用價值的氧化酶是酚氧化酶、過氧化物酶、葡萄糖和己糖氧化酶、巰基氧化酶[12]。目前，具有蛋白質明顯交聯效果并進行了較為深入研究的僅限于前兩類。最近在生物材料領域開始發展的胺氧化酶尤其是賴氨酰氧化酶由于其獨特的蛋白交聯特性也逐漸受到關注。這里主要介紹多酚氧化酶、過氧化物酶、賴氨酰氧化酶類。

2 多酚氧化酶特性與應用

多酚氧化酶是在氧分子存在下把酚類氧化成鄰苯醌或對苯醌的酶。廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚氧化酶(如酪氨酸酶)、雙酚氧化酶(如兒茶酚氧化酶)和漆酶。目前對多酚氧化酶的研究中以酪氨酸酶的研究最為廣泛，雙酚氧化酶的研究相對較少，因此主要對酪氨酸酶和漆酶進行簡單介紹。

2.1 酪氨酸酶特性與應用

2.1.1 酪氨酸酶的性質與催化交聯機制

酪氨酸酶(tyrosinase, E.C.1.14.18.1)是一類廣泛分布于細菌、真菌、植物、昆蟲和高等動物中的含銅蛋白質。酪氨酸催化位點有兩個銅原子，每一個銅原子由3個高度保守的組氨酸調節[13]。酪氨酸酶是一個有兩種不同生物學功能的酶，它催化一元酚的正交羥基化和隨后的二元酚氧化成醌。蛋白質中有弱的三維結構和展開的蛋白質結構更容易成為酪氨酸交聯的目標，然而那些球狀蛋白質則不會[14]。

圖2[15]為酪氨酸酶催化反應機制。酪氨酸酶催化兩種獨特的氧化反應，分別為單酚酶催化的羥基化反應和兒茶酚酶催化的氧化反應，氧氣是這兩個反應共同的底物[16]。對于羥基化反應，氧氣分子的一個原子嵌入到一元酚底物的芳香環中，另一個原子進入水中。第一步的氧化反應中鄰苯二酚(DOPA)在單酚中形成，在第二步反應中DOPA進一步氧化形成相應的鄰醌[17]。醌類是有活性的復合物,可以自發反應形成高分子量的復合物或者黑色素。

2.1.2 酪氨酸酶的功能與應用

酪氨酸酶是生物體內黑色素合成的限速酶，是篩選色素沉積抑制劑的靶標之一[18]。同時，對比酪氨酸酶和轉谷酰胺酶交聯促進明膠和殼聚糖凝膠的形成，發現酪氨酸酶能夠使凝膠的速度更快。然而由酪氨酸酶催化的水凝膠只有在殼聚糖存在的條件下形成，并且機械性能比較弱且不穩定[19]；另外，研究證明，酪氨酸交聯在蛋白質中的形成可以通過添加小分子的酚類化合物來形成，這些分子可能作為交聯介質起作用進而克服靶蛋白表面暴露的酪氨酸殘基的缺失問題[20]。與轉谷酰胺酶相比，酪氨酸不需要對牛奶預熱便可允許酶法交聯，這可能對特定的牛奶制品質量產生影響[21]。

值得注意的是，在酪氨酸酶作用下，由酪氨酸與自由氨基酸產生醌類的反應可能會影響食品產品的顏色和香味，這些可能會限制酪氨酸在食品工業中的應用[22]。

2.2 漆酶特性與應用

2.2.1 漆酶的性質與催化機制

漆酶(laccase, E.C.1.10.3.1)屬于多銅氧化酶類。漆酶在自然界很常見，并且廣泛分布在真菌中，在高等植物中則較為少見[23]。漆酶中除了高度保守的催化中心，在蛋白質結構、分子大小、最適pH值和底物專一性方面有很大不同。漆酶的底物范圍非常廣泛，能夠氧化多種酚化合物、二元胺類、芳香氨基酸[24]。漆酶溫度穩定性的變化很大，這主要取決于酶的來源。

由漆酶催化的氧化反應是在由4個銅原子組成的酶催化中心的協助下完成。催化循環的結果是一分子氧氣減少進入到兩個水分子中去，同時底物氧化反應產生4個氧自由基中心。自由基形成和醌類能夠導致底物分子發生聚合作用，不穩定的自由基能夠進一步將非酶轉化為半醌形式。在蛋白質中，暴露的酪胺酰側鏈可為漆酶氧化提供底物，由此產生的苯氧基可以自發地啟動后續的蛋白質交聯反應。

2.2.2 漆酶的功能與應用

漆酶穩定性好，作用底物廣泛，在氧氣分子的參與下可直接氧化底物。目前，除了將漆酶應用于去除果汁中的多酚物質以降低其苦澀感外[25]，更多的研究開始集中在漆酶對蛋白質的氧化修飾方面。例如，漆酶能夠與α-乳白蛋白相互作用，顯著提高膠凝強度和氧化性[26]；同時，也有研究表明，漆酶能夠交聯花生蛋白并改變其免疫調節活性[27]。漆酶在食品領域的應用越來越廣泛。

3 過氧化物酶特性與應用

過氧化物酶(peroxidase，POD，E.C.1.11.1.7)是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，是一種血紅素蛋白，包含三價鐵的原卟啉Ⅸ。過氧化物酶可以在過氧化物如過氧化氫存在條件下催化許多反應。過氧化物酶包括專一性的酶，例如NADH過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和碘化過氧化物酶，還包括非專一性的酶，就是被人們所熟知的過氧化物酶[28]。

雖然過氧化物酶已經被廣泛研究，但是據報道[29]，只有植物過氧化物酶能夠進行酶反應形成蛋白質聯，這主要包括辣根過氧化物酶和大豆過氧化物酶。其中，以辣根過氧化物酶研究最為廣泛，并且由于大豆過氧化物酶具有和辣根過氧化物酶相似的穩定性和催化機制，因此這里僅以辣根過氧化物酶為例進行簡單介紹。

3.1 辣根過氧化物酶的性質與催化機制

辣根過氧化物酶(horesradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7)是一類以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白質。HRP中的酶分子含有三價鐵血紅素，兩個Ca2+和一條多肽鏈。HRP催化過氧化氫和還原底物之間的氧化還原反應。典型的底物包括芳香酚類、酚酸、吲哚、胺類和磺酸鹽[30]。研究表明，HRP能夠被位點專一性的含有酪氨酸標簽(如GGGGY 或 GGYYY) 的重組體蛋白交聯[31]。

過氧化物酶用過氧化氫作為電子接受體來氧化大量的有機和無機底物，氧化的結果是自由基的形成，并且可以與其他底物發生進一步反應。大多數的氧化酶催化的反應可以由方程式表達：

H2O2+2AH2→2H2O+2AH·

其中AH2代表底物，AH·是自由基產物，同時過氧化氫轉變成水。

辣根過氧化物酶催化反應機制如圖3[32]。圖3中，在HRP催化的反應中，過氧化氫首先取代了與過氧化物酶分子中血紅素相結合的水形成酶- 底物絡合物(Ei)；Ei和外源氫供體底物作用生成化合物Eii，并形成自由基(RO·)；化合物Eii和第二個氫供體底物分子作用后，過氧化物酶E分子再生，同時生成第二個自由基(RO·)，這些自由基可以進一步聚合生成新的化合物[33]。

圖3 辣根過氧化物酶催化反應機制Fig.3 Reaction mechanism of horseradish peroxidase

3.2 辣根過氧化物酶的功能與應用

HRP在食品工業中具有重要的應用價值。溫研等[33]利用HRP處理牛乳得到固定型酸奶，結果顯示，酸奶硬度及黏度均有所提高，能明顯改善固定性酸奶的品質；馬超越等[34]將固定的HRP用于啤酒中H2O2的測定，結果發現有很好的回收率，且啤酒的穩定性更好；展海軍等[35]將固定的HRP應用到火腿腸的NaNO2測定，實驗表明有良好的回收性，火腿腸的品質得到提升。不過，過氧化物酶的穩定性是一個比較難以解決的問題，因此，從不同的植物源中獲得有更高穩定性和活性的過氧化物酶對實際生產將會產生更大幫助。

4 胺氧化酶特性與應用

胺氧化酶(amine oxidase)是在生物體內廣泛存在的一類酶，參與生物胺的代謝，使胺氧化裂解成醛和氨。反應方程式為：

RCH2NH2+O2+H2O→RCHO+NH3+H2O

胺氧化酶可分為兩類：一類為以醌為輔因子的含銅胺氧化酶(copper -containing amine oxidases，CAO)(E.C.1.4.3.6)，另一類為含黃素的胺氧化酶[36]。其中CAO是一類包含銅離子和酪氨酸衍生醌輔因子的酶(E.C.1.4.3.4)，可以分為兩類不同源的家族：2，4，5 -三羥苯基丙氨酸醌依賴的CAOs和賴氨酸酪氨酰醌依賴的賴氨酰氧化酶家族(lysyl oxidase，LOXs)[37]。

胺氧化酶普遍存在微生物中，因此具有胺氧化酶活性的菌株被廣泛應用到食品中。乳酸菌屬的香腸乳桿菌可以用來降解紅酒中的組胺、酪胺和腐胺[38]，木糖葡萄糖球菌被發現可以抑制鳳尾魚腌制和發酵過程中生物胺的形成并且效果顯著[39]。一系列的相關文獻已對CAOs和LDX(E.C.1.4.3.13)進行了報道[40-42]。這里簡單介紹對蛋白質交聯貢獻最大的賴氨酰氧化酶。

LOX是由細胞分泌的、作用于細胞外基質膠原和彈性蛋白賴氨酸殘基而產生分子交聯的一種含有銅結合部位的胺氧化酶，能將伯胺氧化成醛。這類廣泛存在的酶氧化賴氨酸的初級伯胺形成乙醛，活性乙醛進一步反應交聯細胞外基質。LOX 基因家族共有5個成員，每個成員都含有兩個高度保守的區域，分別為N末端，含有4個組氨酸的銅結合部位的信號肽區域；C末端，含有酪氨酸殘基的催化區域，含有高度保守的銅離子結合位點、賴氨酸酪氨酰醌殘基和細胞因子受體區域[43]。

4.1 LOX催化交聯機制

圖4為賴氨酰氧化酶的催化機制[36]。如圖4所示， LOX氧化膠原中的肽基脯氨酰賴氨酸、羥酰賴氨酸殘基和彈性蛋白中的賴氨酸殘基產生肽基α -氨基乙二酸 -δ -半醛。這些醛修飾能夠自發地與鄰近的肽醛或者肽基脯氨酰賴氨酸的ε -氨基結合形成共價交聯來穩定膠原和彈性蛋白纖維的穩定性，使其不溶于細胞外基質[37]。醛的產生替代了正常的賴氨酸殘基不活躍的亞甲基，形成了潛在的親電子的羰基。產生的肽基醛就可以與相鄰的未修飾的賴氨酸的NH2形成脫氫賴氨酸正亮氨，從而形成交聯反應。

圖4 賴氨酰氧化酶的催化機制Fig.4 Catalytic mechanism of lysyl oxidase

4.2 LOX的功能與應用

LOX能使細胞外基質膠原纖維和彈性蛋白分子共價交聯反應產生肽基α -氨基己二酸 -δ -半醛。這種醛修飾可以穩定膠原和彈性纖維的結構，使其在細胞外基質不可溶[37]。近年來，賴氨酰氧化酶的多種生物學功能被發現，LOX對肺泡形成、末梢和近端氣道的形成有重要作用[37]；LOX對心血管、呼吸系統、骨骼和其他器官相關組織的形態學形成和修復有重要作用[44]。在生物材料中，LOX催化形成的水凝膠由于賴氨酰氧酶連續的催化作用使結構更穩定，這一特征導致水凝膠機械性能的穩定性不斷提高，并不像其他的凝膠系統會隨著時間的推移而發生降解[37]。食品蛋白質種類繁多，理化性質各異，利用LOX進行氧化交聯，將呈現不同的交聯機制與交聯效果，對其在這一領域的研究與開發具有重要的科學意義與應用價值。

5 結束語

酶促進氨基酸殘基之間的共價交聯為蛋白質修飾提供更多的可能性，從而為食品重組與新型食品制造提供科學基礎與技術支持。目前，僅有非常少的幾種酶能被用作蛋白質交聯，涉及氧化交聯的更少。氧化酶的蛋白質交聯作用機制與TG酶完全不同，并且這些氧化酶之間在理化特性、反應機理和作用底物等方面也存在很大差異性。對這些氧化酶酶學性質與氧化交聯效果進行深入分析，將有利于蛋白質交聯的差異化，并以此達到食品產品質構的調節與控制。

酶催化的蛋白質氧化交聯已經引起了研究者的廣泛關注，逐漸成為新的蛋白質修飾的研究熱點。然而，交聯蛋白質也可能會影響消費者食用最終產品的生理特性，如消化性和變應原性。應該說，蛋白質的酶法交聯對蛋白質的生物容性、食用安全性等方面將產生一定的積極的或者消極的影響，但是這些并沒有被研究透徹，需要更多的關注。尤其是氧化酶，其在反應過程中產生的自由基團以及其他副產物，在反應體系的消減與殘留，以及對人體健康的有無可能危害性，也是值得深入研究的課題。

目前除了已經建立在谷氨酰胺轉氨酶基礎上的酶交聯方法比較成熟外，酶法氧化交聯技術在蛋白質交聯領域還尚未成熟。因此，有必要開發與成熟氧化酶氧化相關的交聯方法、檢測手段等系列集成化技術體系，以豐富與拓展氧化酶類在蛋白質交聯與重組食品中的應用。

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(責任編輯：葉紅波)

Enzymatic Properties of Oxidases and Their Application in Covalent Cross -Linking of Proteins

CHENG Shan1, WANG Wenhang1,*, LU Fuping2,*

(1.CollegeofFoodEngineeringandBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457，China； 2.CollegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China)

Protein cross -linking, belonging to protein modification, plays an important role in food restructure and new food preparation.Compared with chemical and physical cross -linking methods, enzymatic cross -linking has become the most acceptable cross -linking method of protein due to its mild reaction conditions, no by -products and good cross -linking characteristics. Apart from glutaminase, some oxidases have also been shown to form covalent bond between protein molecules and promote formation of covalent cross -linking. This paper summarizes the enzymatic properties, cross -linking mechanism of phenol oxidase (e.g., tyrosinase, laccase), peroxidase and lysyl oxidase. Lastly, the research status and application potential of these enzymes in food proteins are summarized.

oxidase; protein modification; oxidation; covalent cross -linking

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.005

2095 -6002(2017)03 -0036 -07

程珊， 王穩航， 路福平. 基于蛋白質交聯的氧化酶特性與應用[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):36-42.

CHENG Shan, WANG Wenhang, LU Fuping. Enzymatic properties of oxidases and their application in covalent cross -linking of proteins[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):36-42.

2017 -04 -12

國家自然科學基金面上項目(31671806)。

程 珊，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術；

TS202.3； Q814.4； Q816

A

*王穩航，男，教授，博士，主要從事食品酶及其應用方面的研究，通信作者；

*路福平，男，教授，博士，主要從事生物催化工程方面的研究，通信作者。