漢中仙毫茶多酚與維生素C抗氧化及抑菌活性的協同作用

唐煜括， 左聰聰， 李佳笑， 李 璐， 張華峰

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119)

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漢中仙毫茶多酚與維生素C抗氧化及抑菌活性的協同作用

唐煜括， 左聰聰， 李佳笑， 李 璐*， 張華峰*

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119)

采用DPPH·和ABTS+·方法研究了漢中仙毫茶多酚與維生素C(VC)體外抗氧化活性的協同作用，采用二倍稀釋法和牛津杯法研究了茶多酚與VC混合物對大腸桿菌的抑菌作用。茶多酚與VC的混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]具有較強的DPPH·清除能力，其EC50值低于茶多酚和VC；并且混合物中VC所占比例越高，EC50值就越低。m(茶多酚)與m(VC)的1∶1混合物對ABTS+·的EC50值略低于VC?；隗w外抗氧化活性與樣品濃度之間量效關系構建的數學模型具有較高的擬合度。m(茶多酚)與m(VC)的1∶1和2∶1混合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為38和46 mg·mL-1。m(茶多酚)與m(VC)的2∶1混合物的抑菌圈直徑較大，其抑菌活性略高于茶多酚。茶多酚與VC以特定比例混合后，自由基清除能力有所提高，并且抑菌活性有明顯的提升。

茶多酚； 自由基； 大腸桿菌； 維生素C； 協同作用

茶葉中含有豐富的營養素和活性成分，如氨基酸和茶多酚[1]。茶多酚具有抗氧化、抑菌等活性[2-3]。2011年，我國正式將茶多酚列為食品抗氧化劑[4]。同茶多酚一樣，維生素C(vitamin C，VC)也是國家標準收錄的食品抗氧化劑，在食品工業中具有廣泛用途[4-5]。王岳飛等[6]通過鐵離子還原法研究了茶多酚與VC的體外協同抗氧化能力。肖波等[7]研究表明茶多酚和VC具有協同抑制幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)的作用。邢淑婕等[8]發現茶多酚和VC可以協同抑制鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。漢中仙毫茶是陜西省的特色茶葉品種，被國家質量監督檢驗檢疫總局認定為國家地理標志產品。迄今未見關于漢中仙毫茶多酚與維生素C協同抗氧化作用及其對模式菌——大腸桿菌(Escherichiacoli)協同抑菌活性的報道。本研究擬通過DPPH(1,1 -二苯基 -2 -三硝基苯肼，1,1 -diphenyl -2 -picrylhydrazyl)法和ABTS(2,2 -聯氮 -二(3 -乙基 -苯并噻唑 - 6 -磺酸)二銨鹽，2,2 -azino -bis (3 -ethyl -benzothiazoline - 6 -sulfonic acid) diammonium salt)法分析漢中仙毫茶多酚與VC的協同抗氧化活性，并探究茶多酚與VC對大腸桿菌的聯合抑菌作用，為漢中仙毫茶的科學開發以及新型食品抗氧化劑、防腐劑的研制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

漢中仙毫茶購自陜西省西安市茶葉市場。沒食子酸(純度≥98%)、VC(純度≥99%)、ABTS、DPPH、考馬斯亮藍G- 250、Folin- Ciocalteu試劑，購自美國Sigma公司。大腸桿菌ATCC25922來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。無水乙醇(分析純)等購自天津市富宇精細化工有限公司。瓊脂粉、LB肉湯(培養基)等購自北京奧博星生物技術有限公司。

Multiskan Go型全波長酶標儀，美國Thermo Electron公司；GSP- 9080MBE型隔水式恒溫培養箱，上海博遠實業有限公司醫療設備廠；722型分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；LDZX- 30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；RE- 52型旋轉蒸發儀，上海安亭實驗儀器有限公司；LGJ- 18C型真空冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；JPCQ0328型全數字式超聲波清洗機，武漢嘉鵬電子有限公司；DL- 4C型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；FW400A型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；BS224S型電子天平，德國Sartorius公司。

1.2 茶多酚制備與測定

1.2.1 茶多酚制備

將茶葉粉碎、過篩(80目)后在55 ℃烘干至恒重，冷卻至室溫，置陰涼干燥處密閉避光保存。參考鄭海燕[9]的方法提取茶多酚。準確稱取茶葉粉末，按照1∶30(g/mL)液料比(茶葉質量與乙醇體積的比例)加入體積分數φ(乙醇)=50%的乙醇水溶液，在超聲波功率480 W、頻率30 kHz、溫度45 ℃條件下超聲波輔助提取15 min。離心取上清液，用0.45 μm有機系濾膜過濾，經真空冷凍干燥后得到茶多酚固體粉末。

1.2.2 茶多酚定性與定量分析

[10]，采用三氯化鐵顏色反應鑒定茶多酚。采用國家標準方法[11]測定茶多酚含量。

1.3 體外抗氧化活性分析

采用本實驗室優化的DPPH·、ABTS+·清除實驗方法[12]考察茶多酚、VC及其混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]的體外抗氧化作用。每個實驗重復3次，取平均值。

1.4 抑菌活性分析

1.4.1 實驗菌株活化與菌懸液制備

將供試菌接種在新鮮斜面培養基(牛肉膏蛋白胨斜面培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL)上，在37 ℃培養箱中活化培養24 h。用接種環從斜面培養基上挑取菌種接種于10 mL液體培養基(牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL)中，在搖床中振蕩培養24 h(培養溫度37 ℃，振蕩速度110 r·min-1)，制得活化菌懸液，用滅菌生理鹽水稀釋至1×106～1×107CFU·mL-1(備用)。

1.4.2 最小抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法[13]測定茶多酚、VC及其混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。取6支滅菌試管并編號，在1號試管中加入1 mL液體培養基，再加入1 mL濃度為200 mg·mL-1的樣品溶液，混合均勻；從1號試管中吸取1 mL混合溶液加入2號試管，再加入等體積的液體培養基，混合均勻；以此類推，在3，4，5號試管中均加入1 mL的前一試管混合溶液和1 mL液體培養基。在6號試管中加入1 mL滅菌生理鹽水和等體積的液體培養基，作為對照。在1～6號試管中分別加入200 μL活化菌懸液，塞上棉塞，在37 ℃培養16～18 h，觀察試管中是否有菌落長出，從沒有明顯菌落生長的試管中吸取200 μL液體，涂布在平板培養基上培養24 h，觀察是否有菌落長出，確定樣品溶液MIC的范圍。在該范圍內再次設置樣品濃度梯度，同上操作進一步確定MIC。每組實驗設2個重復，取平均值。

1.4.3 抑菌圈直徑測定

分別配制最小抑菌濃度的茶多酚及其與VC混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，2∶1]的溶液，采用牛津杯法[14]測定其抑菌圈直徑。每組實驗設3次重復，取平均值。

1.5 數據分析

采用Excel軟件繪圖，運用SPSS 12.0軟件統計分析實驗數據。多重比較采用One -Way ANOVA分析和最小顯著差異(LSD)的t檢驗方法，p<0.05表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 茶多酚的鑒定與含量測定

漢中仙毫茶多酚提取物的三氯化鐵顏色反應呈陽性，說明其中含有多酚成分。測定發現，提取物中多酚含量為39.04%±5.75%。

2.2 抗氧化活性

研究茶多酚、VC及其混合物對DPPH·消除能力的影響，見圖1?？芍趯嶒灊舛确秶鷥?，茶多酚、VC及其混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]的DPPH·清除率隨著樣品濃度的升高而增加，說明茶多酚、VC及其混合物均具有一定的DPPH·清除能力。建立茶多酚、VC及其混合物的抗氧化活性及其量效關系的數學模型，見表1?？芍瓒喾优cVC混合物的EC50(半數有效濃度，50% effective concentration)值低于茶多酚、VC，混合物中VC所占比例越高，其EC50值也越低，提示

VC對茶多酚的DPPH·清除能力具有明顯的增效作用。DPPH·可以通過快速電子轉移(rapid electron transfer)和慢速氫原子轉移(slow hydrogen atom transfer)與抗氧化劑發生反應，酚類化合物的氫原子轉移反應通常較慢，VC的電子轉移反應較快[15]，兩者以適當比例混合時有助于促進其與DPPH·之間的氧化還原反應。

圖1 茶多酚、VC及其混合物對DPPH·的清除能力Fig.1 DPPH· radical -scavenging ability of tea polyphenols, VC, and their mixture

表1 茶多酚、VC及其混合物的抗氧化活性和量效關系數學模型

x表示樣品濃度，μg·mL-1；y表示自由基清除率，%；R2表示相關系數；EC50表示半效劑量。

進行茶多酚、VC及其混合物對ABTS+·清除能力的研究，見圖2?？芍?0～50 μg·mL-1濃度范圍內，茶多酚、VC及其混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]對ABTS+·清除率隨著樣品濃度的升高而增加，呈現出劑量依賴性，說明茶多酚、VC及其混合物均具有一定的ABTS+·清除能力。由表1可知，茶多酚的EC50值低于VC，兩者以1∶1質量比例混合時EC50值也低于VC，但是兩者以1∶2，2∶1質量比例混合時EC50值高于VC，提示VC與茶多酚以不同比例混合后對ABTS+·清除能力有一定的影響，但影響并不明顯。ABTS+·既可以通過電子轉移被消除，也可以通過氫原子轉移被消除，此外，ABTS+·還可與某些羥基化的芳香族化合物發生反應(但與芳香族化合物的抗氧化能力無關)，這可能是造成VC與茶多酚以不同比例混合后對ABTS+·清除能力的影響不盡相同的原因[16]。由表1還可看出，樣品濃度與ABTS+·清除活性之間量效關系的相關系數較高(0.975 1～0.995 7)，說明數學模型的擬合度較高，樣品濃度與抗氧化活性之間存在較高的相關性。

圖2 茶多酚、VC及其混合物對ABTS+·的清除能力Fig.2 ABTS+· radical -scavenging ability of tea polyphenols, VC, and their mixture

綜上可知，茶多酚、VC均具有較強的自由基清除活性，兩者以特定比例混合后表現出一定的增效作用。Majchrzak等[17]研究發現，在紅茶提取物中添加VC后抗氧化活性會有所升高。謝華等[18]發現，給原發性高尿酸血癥伴脂代謝異常的男性患者同時補充茶多酚與VC，可以顯著降低血清丙二醛水平，改善機體的氧化應激狀態。這些研究提示VC對茶多酚的抗氧化活性可能具有增效作用。Dai等[19]認為，茶多酚中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(( -) -epigallocatechin -3 -gallate)可與活性氧分子發生氧化還原反應，產生苯氧基自由基，VC可以還原苯氧基自由基，促使表沒食子兒茶素沒食子酸酯再生。這可能是茶多酚與VC混合物抗氧化活性較強的原因。

2.3 抑菌作用

2.3.1 最小抑菌濃度

進行茶多酚、VC及其混合物對大腸桿菌抑菌效果的研究，見表2?？芍猇C在實驗濃度范圍內對大腸桿菌沒有明顯的抑制作用，m(茶多酚)與m(VC)的1∶2混合物對大腸桿菌的抑制作用較差，而m(茶多酚)及其與m(VC)的1∶1和2∶1混合物的抑菌活性較高，其MIC依次為56，38，46 mg·mL-1?？梢钥闯?，茶多酚與VC以特定比例(1∶1，2∶1)混合后抑菌能力明顯增強。

2.3.2 抑菌圈

進行茶多酚與VC混合物對大腸桿菌最小抑菌濃度實驗，見圖3。由圖3的MIC實驗可知，m(茶多酚)及其與m(VC)的1∶1，2∶1混合物的抑菌活性較高，為了進一步確認其抑菌能力，又采用牛津杯法測定了抑菌圈直徑?？梢钥闯?，當樣品量在100～250 μL時，隨著樣品量的增加，抑菌圈直徑也逐漸增大。相對而言，m(茶多酚)與m(VC)的2∶1混合物以及茶多酚的抑菌能力較強。由表2和圖3可知，m(茶多酚)與m(VC)的2∶1混合物的抑菌活性較高，明顯高于VC(p<0.05)，略高于茶多酚，說明將m(茶多酚)與m(VC)以一定比例(2∶1)混合能夠增強其對大腸桿菌的抑菌能力。田元春[5]研究證明大劑量VC在體外可以抑制幽門螺旋桿菌。肖波等[7]和邢淑婕等[8]研究發現，茶多酚與VC以一定比例混合可以提高其對幽門螺桿菌的抑制活性。這些發現與本研究結果基本一致。茶多酚抑菌作用的機理十分復雜[20]，VC可能是通過影響大腸桿菌體內氧化還原狀態的方式發揮其對茶多酚抑菌能力的增效作用。

表2 大腸桿菌最小抑菌濃度實驗結果

+表示有菌生長，-表示無菌生長。

圖3 大腸桿菌抑菌圈實驗結果Fig.3 Diameter of inhibition zone against Escherichia coli

3 結 語

漢中仙毫茶多酚與VC的混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]具有顯著的DPPH·清除活性和一定的ABTS+·清除活性。茶多酚與VC混合物[m(茶多酚)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1]的DPPH·清除率高于茶多酚、VC。m(茶多酚)與m(VC)的1∶1混合物的ABTS+·清除活性高于VC?；谧杂苫宄钚耘c樣品濃度之間量效關系構建的數學模型具有較高的擬合度。m(茶多酚)與m(VC)的2∶1混合物對大腸桿菌的抑菌活性較高，略高于茶多酚。茶多酚與VC以特定比例混合后，自由基清除能力與抑菌活性均有較明顯的增加。本研究為漢中仙毫茶的深度開發以及新型食品添加劑的研制提供了參考依據。

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(責任編輯：李 寧)

Synergism of Antioxidant and Antibacterial Activities Between Hanzhongxianhao Tea Polyphenols and Vitamin C

TANG Yukuo, ZUO Congcong, LI Jiaxiao, LI Lu*, ZHANG Huafeng*

(CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China)

Synergistic effect of vitamin C (VC) and Hanzhongxianhao tea polyphenols oninvitroantioxidant capacity of was investigated by DPPH· and ABTS+· assays. Antibacterial activity of the mixtures of tea polyphenols and VC againstEscherichiacoliwas analyzed by broth dilution method and Oxford cup method. The mixtures of tea polyphenols and VC [m(tea polyphenols)∶m(VC)=1∶1，1∶2，2∶1] exhibited strong ability to scavenge DPPH·, and their EC50values were lower than those of tea polyphenols and VC. Moreover, the more VC the mixture contained, the lower EC50value was. EC50value of the mixture of tea polyphenols and VC [m(tea polyphenols)∶m(VC)=1∶1] for ABTS+· was slightly lower than that of VC. Mathematical model based on dose -effect relationship between antioxidant capacity and sample concentration possessed high goodness of fit. Minimum inhibitory concentrations againstEscherichiacoliof the mixtures of tea polyphenols and VC [m(tea polyphenols)∶m(VC)=1∶1，2∶1] were 38 and 46 mg·mL-1. Antibacterial activity of the mixture of tea polyphenols and VC [m(tea polyphenols)∶m(VC)=2∶1] was higher than those of VC and tea polyphenols due to its relatively large diameter of inhibition zone. After tea polyphenols were mixed with special quantity of VC, their free radical -scavenging abilities were slightly improved and antibacterial activities were notably increased.

tea polyphenols; free radical;Escherichiacoli; vitamin C; synergistic effect

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.008

2095 -6002(2017)03 -0055 -06

唐煜括，左聰聰，李佳笑，等. 漢中仙毫茶多酚與維生素C抗氧化及抑菌活性的協同作用[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):55-60.

TANG Yukuo, ZUO Congcong, LI Jiaxiao, et al. Synergism of antioxidant and antibacterial activities between hanzhong -xianhao tea polyphenols and vitamin C[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):55-60.

2016 -08 -28

陜西師范大學勤助科研創新基金項目(KY2015YB40)；陜西師范大學大學生創新創業訓練計劃項目(cx16124)；中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助項目(2016CSZ008)。

唐煜括，男，碩士研究生，研究方向為食品營養學；

TS272.2

A

*李 璐，女，研究助理，主要從事食品營養學方面的研究，通信作者；

*張華峰，男，副教授，博士，主要從事食品營養與安全方面的研究，通信作者。