香菇調味料酶解工藝研究

沈文鳳， 王月明， 徐志祥， 崔文甲， 弓志青，石賢權， 王文亮,*

(1.山東農業大學 食品科學與工程學院， 山東 泰安 271018；2.山東省農業科學院 農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室， 山東 濟南 250100)

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香菇調味料酶解工藝研究

沈文鳳1,2， 王月明2， 徐志祥1， 崔文甲2， 弓志青2，石賢權2， 王文亮1,2,*

(1.山東農業大學 食品科學與工程學院， 山東 泰安 271018；2.山東省農業科學院 農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室， 山東 濟南 250100)

為提高香菇酶解液的酶解效率和感官品質，研究了3種酶復合酶解香菇的較佳工藝。首先通過正交試驗優化了纖維素酶的酶解條件，纖維素酶的較佳酶解條件為溫度40 ℃、時間1 h、加酶的質量分數0.5%。然后以感官評分和α -氨基態氮含量為指標篩選出菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶2種蛋白酶，最后通過響應面試驗優化了復合酶的較佳酶解條件。結果表明，3種酶同時酶解香菇液為較佳酶解方式，復合酶的較佳酶解條件為溫度58.6 ℃、時間2.02 h、質量濃度15.24 mL/g(即超純水體積與香菇粉質量的比例)。在此條件下得到的α -氨基態氮的密度為0.090 1 g/100 mL，感官評分為7.4，屬于喜歡范疇。

香菇； 蛋白酶； 水解； α -氨基態氮

香菇又名花菇、香蕈等[1]是一種常見的大型真菌，藥食同源，具有很高的保健和藥用價值[2-4]，不僅含有豐富的蛋白質、多糖，還含有較多的雙鏈核糖核酸、香菇嘌呤[5]、麥角甾醇、維生素、鈣、鐵、磷等多種功能性成分[6]，具有降血脂、抗腫瘤等功效[7-8]，被贊譽為“菇中皇后”[9]。香菇中含有豐富的呈味物質，但存在多數小分子呈味物質提取不完全，營養成分損失嚴重、主要非揮發性呈味物質呈味效果差、綜合利用率低，產品質量不高等問題。酶解工藝是解決這一問題的關鍵[10]，高珊[11]研究了有效破壁對酶解的作用。王麗君[12]研究了微波等輔助作用對酶解的影響。程玉[13]利用響應面得出了酶解的最佳工藝條件。另外，其他團隊也對酶解工藝進行了研究[14-16]。本文利用多種酶復合酶解香菇，從而提高其酶解液的風味物質含量，為香菇的精深加工提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇，購于濟南大潤發超市；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司；菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

ZN- 20L型小型粉碎機，北京興時利和科技發展有限公司；GZX- 9240MBE型電熱鼓風干燥機，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；UV- 6100型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；CR22DⅢ型高速冷凍離心機，日立有限公司；SG2型便攜式pH計，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；pk- 8D型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；AR423CN型天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解操作

取已制備好的香菇粉2.0 g(以干質量計)，按較佳酶活力加入相應的酶，按適當質量濃度加入超純水，自然pH值，在適當的溫度下酶解適當的時間，后于100 ℃水中滅酶10 min，7 000 r/min、4 ℃條件下冷凍離心15 min，取上清液測α -氨基態氮的密度含量。做3組平行實驗。

1.3.2 蛋白質測定

使用考馬斯亮藍法[17]。

1.3.3 α -氨基態氮含量的測定

使用甲醛電位滴定法[18]。

1.3.4 感官評定

選實驗室經過訓練的11人(5男6女)進行實驗。評定員對不同風味的樣品的總體接受程度按照9點快感類別量表測定方法評分。評分標準：1，極不喜歡；2，非常不喜歡；3，不喜歡；4，較不喜歡；5，一般不喜歡；6，較喜歡；7，喜歡；8，非常喜歡；9，極喜歡。

1.3.5 纖維素酶的優化

1.3.5.1 纖維素酶的單因素設計

溫度的單因素實驗。酶活力按200 U/g，質量濃度按10 mL/g加入超純水，控制溫度分別在35，40，45，50，55 ℃條件下酶解1 h。

時間的單因素實驗。酶活力按200 U/g，質量濃度按10 mL/g加入超純水，控制溫度在45 ℃條件下分別酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。

加酶量的單因素實驗?？刂萍用傅馁|量分數分別為底料的0.3%，0.5%，1.0%，質量濃度按10 mL/g加入超純水，在45 ℃條件下酶解1 h。

1.3.5.2 纖維素酶的正交設計

實驗以香菇水解后的蛋白含量為考察指標，采用正交試驗的方法優化纖維素酶，通過單因素實驗確定纖維素酶的溫度、時間、加酶量3個因素，根據酶的性質，每個因素設定3個水平。

1.3.6 確定較優蛋白酶組合的實驗

取制備好的香菇粉4組，每份各2.0 g，選擇菠蘿蛋白酶分別與復合蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶復合，調節質量濃度為20 mL/g，各加酶量為2 000 U/g，自然pH值，各自最適溫度下酶解3 h后，測α -氨基態氮的密度含量，同時根據感官評分選出較優蛋白酶組合。每組做3次平行實驗。

1.3.7 纖維素酶添加方式的確定

實驗分4組進行，第1組不加纖維素酶直接加風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶，40 ℃條件下酶解3 h；第2組同時加入纖維素酶、風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h；第3組先加入纖維素酶45 ℃條件下酶解1 h后，加風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h；第4組先加風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h后，再加纖維素酶45 ℃條件下酶解1 h，4組實驗的質量濃度都按20 mL/g的比例添加超純水40 mL，測定α -氨基態氮的密度含量，同時根據感官評分選出較優蛋白酶組合。每組做3次平行實驗。

1.3.8 復合酶條件的優化

1.3.8.1 復合酶的單因素設計

取已制備好的香菇粉2.0 g，按纖維素酶的200 U/g酶活添加纖維素酶，按風味蛋白酶的2 000 U/g酶活添加風味蛋白酶，按復合蛋白酶的2 000 U/g酶活添加復合蛋白酶，按10，15，20，25 mL/g的質量濃度加入超純水，分別在35，40，45，50，55，60，65 ℃條件下酶解0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，后測定α -氨基態氮的密度含量，同時根據感官評分選出較佳復合酶解條件。每組做3次平行實驗。

1.3.8.2 復合酶的響應面設計

通過單因素實驗確定復合酶的溫度、時間、液料比3個因素，根據每個因素設計3個水平，以α -氨基態氮的密度為指標，利用響應面進行優化實驗，根據感官評分選出復合酶的較佳酶解條件。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶條件的優化

在單因素實驗基礎上確定了纖維素酶的適合酶解條件是在溫度45 ℃的條件下酶解1 h，加酶的質量分數為0.5%，為進一步確定纖維素酶的較佳酶解條件運用L9(33)正交試驗表進行進一步優化，結果見表1。

由表1極差分析可以看出，RC>RA>RB各因素影響的主次依次為：加酶量、溫度、時間。根據各因素的k1、k2、k3選擇各因素的較優組合：溫度40 ℃、時間1 h、加酶的質量分數0.5%。

2.2 較優蛋白酶組合的確定

選擇菠蘿蛋白酶分別與復合蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復合，以α -氨基態氮的密度為指標測定酶解液，結果見圖1。

表1 纖維素酶的正交試驗因素水平表

圖1 4組蛋白酶對香菇酶解液α -氨基態氮含量和感官評分的影響Fig.1 Effect of proteases on α -amino nitrogen content and sensory evaluation of mushroom hydrolysis

由圖1可知，4組蛋白酶對于香菇α -氨基態氮的密度含量和感官評分均有顯著的影響。顯然，菠蘿蛋白酶與復合蛋白酶和中性蛋白酶復合的酶解液中α -氨基態氮的密度含量高，表明蛋白酶酶解出了較多的呈味物質，但同時也酶解出了較多的苦味物質，這嚴重影響了酶解液的整體感官評分。菠蘿蛋白酶與木瓜蛋白酶水解出的呈味物質少導致感官評分低，綜上所述，選菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶組合對香菇進行下一步的酶解實驗。

2.3 纖維素酶添加方式的確定

將纖維素酶以不同方式添加到香菇粉中進行酶解，得到如下4組實驗，結果見圖2。

圖2 纖維素酶添加方式對α -氨基態氮含量的影響Fig.2 Effects of cellulase adding ways on α -amino nitrogen content

由圖2可以看出不加纖維素酶與加纖維素酶有明顯的不同。先加纖維素酶的酶解液中雖然α -氨基態氮密度高，但水解出的苦味呈味物質影響了感官評分，所以選同時加入3種酶的方式，該酶解方式不僅α -氨基態氮密度含量與感官評分高，同時能縮短酶解時間，提高酶解效率，降低生產成本。

2.4 復合酶酶解條件的優化

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素實驗基礎上確定了復合酶的適合酶解條件是在溫度55 ℃的條件下酶解2 h，質量濃度為15 mL/g，為進一步確定復合酶的較佳酶解條件運用響應面試驗進行進一步優化，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.4.2 方差分析與顯著性分析

在單因素實驗的基礎上，采用Design -Expert 8.0.6.0軟件，以α -氨基態氮的密度為響應值，對數據進行分析得到回歸方程為：

y=-0.733 36+0.025 492x1+0.096 415x2+

4.068 20×10-3x3+1.470 80×10-4x1x2+

8.460 52×10-5x1x3-2.364 00×

表3 方差分析結果

2.4.3 響應面結果驗證實驗

利用Design -Expert 8.0.6.0軟件得到復合酶的較佳酶解條件為溫度58.64 ℃，時間2.02 h，質量濃度15.24 mL/g，得到的α -氨基態氮密度含量最高為0.094 97 g/100 mL。根據實際情況，較佳酶解條件為溫度58.6 ℃，時間2.02 h，質量濃度為15.24 mL/g，在此條件下進行驗證實驗，重復3次，得到的α -氨基態氮的密度為0.090 1 g/100 mL，酶解液具有較強的香菇特征風味和較強的鮮味，幾乎無苦味，感官評分為7.4，屬于喜歡范疇，與預測值有較好擬合性，說明響應面優化試驗得到的復合酶酶解條件具有實際參考價值。

3 結 論

纖維素酶水解的較佳條件為溫度40 ℃、時間1 h、加酶的質量分數0.5%。綜合考慮α -氨基態氮的密度和感官評分結果，選擇菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶組合對香菇進酶解?？紤]α -氨基態氮的密度和感官評分，再加上生產流程和生產成本綜合考慮，選擇3種酶同時加入的酶解方式。優化的較佳酶解條件為溫度58.6 ℃，時間2.02 h，質量濃度為15.24 mL/g，在此條件下得到的α -氨基態氮的密度含量為0.090 1 g/100 mL，酶解液具有較強的香菇特征風味和較強的鮮味，幾乎無苦味，感官評分為7.4，屬于喜歡范疇。

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(責任編輯：李 寧)

Study on Enzymolysis Technology of Shiitake Mushroom Seasoning

SHEN Wenfeng1,2, WANG Yueming2, XU Zhixiang1, CUI Wenjia2, GONG Zhiqing2, SHI Xianquan2, WANG Wenliang1,2,*

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an271018,China; 2.InstituteofAgro-ProductsProcessingScienceandTechnology/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAgro-ProductsProcessingTechnology,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)

In this study, the optimal processing of enzymatic hydrolysis of shiitake mushrooms has been studied using three enzymes, in order to improve the enzymatic efficiency and sensory evaluation. First, the hydrolysis conditions of cellulase were optimized by orthogonal experiments. The results showed that the optimum hydrolysis conditions were temperature 40 ℃, hydrolysis time 1 h, and enzyme dosage 0.5%. Second, bromelain and flavourzyme were screened out using α - amino nitrogen content and sensory evaluation as indicators. Third, the enzyme hydrolysis conditions were optimized by the response surface test. The results showed that the optimum conditions were hydrolysis temperature 58.6 ℃, hydrolysis time 2.02 h, and concentration 15.24 mL/g (water volume: shiitake mushroom powder quantity). Under the optimum conditions, the α -amino nitrogen content was 0.090 1 g/100 mL and the sensory score was 7.4, belonging to the category of favorite.

shiitake mushroom; protease; hydrolysis;α-amino nitrogen

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.012

2095 -6002(2017)03 -0078 -05

沈文鳳， 王月明， 徐志祥, 等. 香菇調味料酶解工藝研究[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):78-82.

SHEN Wenfeng, WANG Yueming, XU Zhixiang, et al. Study on enzymolysis technology of shiitake mushroom seasoning[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):78-82.

2016 -09 -08

山東省現代農業產業技術體系食用菌產后加工崗位專家項目(SDAIT -07 -08)；山東省農業重大應用技術創新課題(魯財農指[2014]38)。

沈文鳳，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全；

TS202.3

A

*王文亮，男，副研究員，主要從事食用菌精深加工等方面的研究，通信作者。