羅漢果內生菌及其周邊土壤中產α-淀粉酶菌株的篩選

趙豐麗， 吳 奔， 張昌志， 范彩琴， 宋云飛， 楊文國， 陳 靜

(1.廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2.珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004； 3.桂林萊茵生物科技股份有限公司， 廣西 桂林 541199)

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羅漢果內生菌及其周邊土壤中產α-淀粉酶菌株的篩選

趙豐麗1,2， 吳 奔1， 張昌志1， 范彩琴1， 宋云飛3， 楊文國3， 陳 靜1

(1.廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2.珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004； 3.桂林萊茵生物科技股份有限公司， 廣西 桂林 541199)

對羅漢果內生菌及其種植區土壤中的微生物進行分離，篩選淀粉酶產生菌，并研究其發酵條件，結果得到15株內生菌和8株微生物，從中篩選到2株產淀粉酶高的菌株2 -1(土壤)和R - 4(根部內生菌)。經初步鑒定，菌株2 -1為球菌，菌株R - 4為芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌。研究顯示，菌株2 -1產酶條件為1.0%氯化銨、0.5%酵母粉、1.0%可溶性淀粉、0.4%氯化鈉，發酵溫度為40 ℃，發酵3 d，其產酶量為127.65 U/mL；R - 4菌株產酶條件為0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉，發酵溫度為40 ℃，發酵3 d，其產酶量為197.21 U/mL。

羅漢果； 內生真菌； α -淀粉酶； 發酵條件

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為葫蘆科羅漢果屬的多年生藤本植物的果實，是我國特有植物[1]，生長于廣西、廣東、江西、湖南及貴州等地，廣西桂林市永?？h是羅漢果發源地和主產地。羅漢果果實富含多種人體必需氨基酸、微量元素及維生素等，此外，含有黃酮、多糖、甜甙和多酚等活性成分。羅漢果具有多種藥理作用，具有良好的保健價值[2]。羅漢果中含有比蔗糖甜300倍的強甜物質——羅漢果甜甙V。羅漢果甜甙V占總甜甙量的30%～40%[3]，是一種低熱量、不吸濕、不引發齲齒的純天然甜味劑。

甜甙Ⅴ隨羅漢果成熟度的增加而逐步增多，這是受體內諸多水解酶參與轉化形成的結果，是低糖苷與葡萄糖逐漸結合轉化而來的[4]。羅漢果甜甙含量的多少受其體內水解酶的影響較大，與葡萄糖有關聯。作為主要的水解酶之一的淀粉酶有可能參與了這一過程，而這些酶與微生物的關系如何，其研究有重要的意義。羅漢果中含有豐富的內生菌，它們是否參與了羅漢果甙類物質轉化等代謝過程，這些微生物和次級代謝產物的產生是否有關，十分值得研究。經查閱中外文獻，目前尚未見有從羅漢果中分離微生物、內生菌以及內生菌產淀粉酶等的研究報道。本研究以羅漢果根、莖、果實以及羅漢果種植地土壤為材料，采用微生物純種分離技術對其內生菌以及其他微生物進行分離，并以淀粉水解圈為指標，篩選羅漢果產淀粉酶的內生菌和其他微生物，對篩選到的菌株進行初步鑒定，研究其發酵條件，以期為羅漢果內生菌相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

羅漢果的根、莖、果實以及羅漢果根部土壤及其周邊土壤于2015年10月采集于廣西桂林市臨桂縣。

1.1.2 主要培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)：馬鈴薯200 g切塊，用水煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來水補足1 000 mL，pH值自然。

改良PDA培養基：在其中加入2%的可溶性淀粉，用于產淀粉酶菌株的篩選。

種子培養基[5]：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、pH值為7.4～7.6、自來水1 000 mL。

基礎發酵培養基[6]：可溶性淀粉20 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、K2HPO41 g、NaCl 1 g、pH值7.4、自來水1 000 mL。

以上培養基滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.1.3 儀器與設備

SY100型顯微鏡，Nikon公司；BXM- 30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養箱，武漢瑞華儀器設備有限責任公司；UV mini- 1240型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理

1)根、莖、果表面的消毒及預處理。實驗前，用自來水將羅漢果的根、莖、果沖洗干凈，放入超凈工作臺；先用75%的酒精浸泡3 min，用無菌水清洗一次；用3%(3%～5%)的NaClO浸泡10 min，再用無菌水清洗一次；最后用75%的酒精浸泡30 s，用無菌水清洗5次，每次5 min。將第5次清洗的水保留下來作為對照。對已消毒的羅漢果根、莖、果進行剪切，取大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織進行接種。

2)土壤樣品的預處理。分別取20 g羅漢果根部土壤和周邊土壤，加入100 mL無菌水，振蕩30 min，取上清液稀釋后備用。

1.2.2 對照實驗的設置

分別取0.5 mL根、莖、果的第5次清洗的水涂布于PDA培養基平板上，設置3個平行實驗，靜置5 min后，倒置于26 ℃培養箱中培養，24 h后觀察是否長菌，未長菌說明表面消毒徹底，有菌生長說明消毒不徹底，需對材料表面重新消毒。

1.2.3 菌株的分離

將待接種的根、莖、果、土壤稀釋液分別涂布于PDA培養基平板上，每種做3個平行，26 ℃恒溫倒置培養3～5 d，當樣品周圍菌落長到一定程度，進行菌種分離純化。

1.2.4 菌株的純化

羅漢果內生菌及土壤微生物菌落長出后，挑取形態不同菌落分別接種于PDA培養基平板上，做3個平行實驗，26 ℃恒溫倒置培養3～5 d，觀察菌落生長情況，分離純化1～3次，經鏡檢確定無雜菌，可確定為純培養菌，供篩選。

1.2.5 產淀粉酶菌株的篩選

1)初篩。將分離到的菌株進行稀釋，取0.2 mL涂布于改良后的PDA分離篩選平板上，28 ℃培養箱中培養1～3 d[7]。每天觀察菌落生長情況，在菌落周圍滴加稀碘液，如菌落周圍出現透明水解圈，表明菌株所產生的產物具有分解淀粉的能力。測定菌落及水解圈直徑，計算其比值，測量D/d(水解圈直徑/菌落直徑)值，挑選D/d較大的菌株進行復篩。

2)復篩。在裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中接入初篩菌株，32 ℃，120 r/min 搖瓶培養48 h[8]。取發酵液離心，收集上清液進行酶活測定。選取酶活高的菌株，備用。

1.2.6 菌株的初步鑒定

將產酶菌株接種在平板上，觀察菌落特征，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株形態[9]，對產酶菌株進行初步鑒定。

1.2.7 淀粉酶活力的測定

粗酶液的制備。取2 mL產酶菌株的種子液接種于50 mL發酵培養基中(250 mL三角瓶)，32 ℃、120 r/min 搖床培養72 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液[6]，參照參考文獻[10]、[11]進行酶活測定。

1.2.8 菌株產酶條件優化

1.2.8.1 產酶條件優化單因素實驗

由于培養基成分和培養條件可直接影響菌株的生長情況，從而影響酶產量。其中碳源、氮源、氯化鈉濃度、淀粉含量和溫度是影響菌株生長的重要因素[5,8,12]。對復篩得到的產酶菌株通過單因素實驗初步篩選菌株產酶的培養基和培養條件，為正交試驗的因素水平設計提供依據。按表1進行單因素實驗。

表1 單因素實驗因素水平

基本發酵條件：250 mL三角瓶中裝50 mL基礎發酵培養基，接入種子液2 mL，32 ℃，120 r/min 培養3 d，離心取上清液，按1.2.7方法測酶活。

1.2.8.2 菌株產酶條件的正交試驗

根據單因素實驗結果，選擇對實驗結果影響大的因素進行正交試驗，研究優化產酶條件。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化的結果

羅漢果根、莖、果實等樣品經過處理后接種于PDA培養基上，一周之內未發現雜菌污染，并且對照組培養基中沒有長出菌落，表明樣品材料表面消毒符合菌種分離要求。經分離培養，從羅漢果

根部樣品中分離到6株菌株，編號為R1、R2、R3、R4、R5、R6；從莖部樣品中得到5株菌株，編號為D1、D2、D3、D4、D5；從果實樣品中得到4株菌株，編號為F1、F2、F3、F4；從羅漢果根部土壤中得到5株菌株，編號為1 -1、1 -2、1 -3、1 - 4、1 -5；從羅漢果周邊土壤中得到3株菌株，編號為2 -1、2 -2、2 -3。

2.2 產淀粉酶菌株篩選結果

將分離純化所得菌株的培養液經梯度稀釋后涂布在初篩平板培養基上進行培養，共獲得4株淀粉水解圈相對值較大的菌株(如圖1)，編號分別為：1 -5、2 -1、F -1、R - 4。將4株菌進一步劃線分離后，接到斜面培養基上，低溫保存。將初篩得到的4株菌按1.2.5中2)方法進行復篩，結果見表2。

圖1 菌株平板培養基篩選結果Fig.1 Screening results of plate culture medium

編號透明圈直徑D/mm菌落直徑d/mmD/d酶活/(U·mL-1)1?52?1F?1R?41412121174752030172286311233872467835

從表2可以看出，在分離于土壤的2株菌株中，菌株2 -1酶活最高，分離于羅漢果的內生菌中活性最高的為R - 4菌株，最終選定2 -1和R - 4兩株菌株進行發酵條件優化。

2.3 菌株鑒定結果分析

對篩選出的產酶較高的2 -1菌株和R - 4菌株采用1.2.6方法進行初步鑒定，其結果見表3和圖2。

2.4 菌株產酶條件分析

為獲得菌株產酶的條件，對篩選出的2株產酶菌株按表1進行單因素實驗，菌株2 -1的產酶條件單因素實驗結果如圖3，菌株R - 4的結果如圖4。

表3 菌株初步鑒定結果

圖2 菌株個體形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strains

圖3 菌株2 -1產酶條件分析Fig.3 Single factor experiment results for strain 2 -1

菌株2 -1發酵培養基的碳源為0.5%酵母粉、氮源為1.0%氯化銨、0.4%氯化鈉、1.0%可溶性淀粉，當發酵溫度為40 ℃時酶活性最大，被確定為菌株2 -1的較佳培養條件。其最大酶活為127.65 U/mL。

圖4 菌株R - 4產酶條件分析Fig.4 Single factor experiment results for strain R - 4

菌株R - 4發酵培養基的碳源為0.5%酵母粉、氮源為1.0%氯化銨、0.1%氯化鈉以及1.5%可溶性淀粉，當發酵溫度為40 ℃時酶活性最大，被確定為菌株R - 4的較佳培養條件。其最大酶活為183.19 U/mL。

由圖3、圖4可以看出，培養基和環境條件對來自于土壤的菌株2 -1和來自于羅漢果的內生菌R - 4的產淀粉酶的活性有較大影響。在單因素實驗條件下，羅漢果的內生菌R - 4產酶活性最大為183.19U/mL，來自于土壤的菌株2 -1的產酶活性最大為127.65 U/mL。因此，選擇內生菌R - 4進行產酶優化條件選擇的正交試驗。

2.5 R - 4菌株產酶條件正交試驗結果分析

為了獲得內生菌R - 4產酶更好的條件，根據圖4單因素實驗結果，固定碳源和氮源，選擇對產酶影響大的因素氯化鈉、可溶性淀粉和發酵溫度進行正交試驗。結果見表4。

表4 正交試驗結果與分析

表4結果顯示，各因素影響的順序為：ACB，即培養基中氯化鈉的含量對菌株產酶的影響最大，其次為可溶性淀粉的含量，最后是發酵溫度。極差分析優化條件為A1B3C3，與表4中實驗號為3的條件一致。即優化培養條件為氯化鈉0.05%、可溶性淀粉2.0%、發酵溫度40 ℃。

2.6 優化培養條件驗證實驗結果

將內生菌R - 4的菌懸液2 mL接種于裝液量為50 mL的最適發酵培養基中，即0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉， 40 ℃，120 r/min搖床發酵3 d，進行3次重復試驗，測定上清液中酶活為197.21 U/mL，顯示正交試驗結果的穩定性良好。

3 結 論

本研究采用微生物純種分離技術，從羅漢果的根、莖、果實以及植株附近的土壤中分別分離到6株、5株、4株、8株微生物菌株。采用淀粉酶篩選培養基，從中分離篩選出產酶活性較高的兩株菌株，一株為來自于羅漢果根部的內生菌R - 4；一株為來自于土壤的菌株2 -1。經初步鑒定，菌株2 -1為球菌，菌株R - 4為芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌。經單因素實驗和正交試驗，獲得羅漢果的內生菌R - 4產酶發酵的優化培養基條件為0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉，在發酵溫度為40 ℃條件下、120 r/min搖床發酵3d，發酵液中α -淀粉酶的酶活為197.21 U/mL。來自于土壤的菌株2 -1優化的產酶培養基條件為：1.0%氯化銨、0.5%酵母粉、1.0%可溶性淀粉、0.4%氯化鈉，在40 ℃條件下，120 r/min搖床發酵3d，其發酵液中α -淀粉酶的酶活為127.65 U/mL。研究結果初步表明，羅漢果內生菌中含有產淀粉酶的菌株，且產酶能力強于來自周圍土壤中的產酶菌株，但該菌株是否有其他作用，是否參與了羅漢果甜甙的代謝等尚需進一步的研究，R - 4內生菌也需采用分子生物學手段進一步深入研究，鑒定其為何種細菌。

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(責任編輯：葉紅波)

Screening ofα-Amylase Producing Strains from Endophytic Bacteria inSiraitiagrosvenoriiand Its Surrounding Soil

ZHAO Fengli1,2, WU Ben1, ZHANG Changzhi1, FAN Caiqin1, SONG Yunfei3, YANG Wenguo3, CHEN Jing1

(1.CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China; 2.KeyLaboratoryofEcologyofRareandEndangeredSpeciesandEnvironmentalProtection,MinistryofEducation,Guilin541004,China; 3.GuilinLaynNaturalIngredientsCorp.,Guilin541199,China)

In this study, the screening of α -amylase producing strains from endophytic bacteria inSiraitiagrosvenoriiand surrounding soil were preformed, and the optimum fermentation conditions for α -amylase producing strains were performed. Our results showed that 15 strains were isolated from theSiraitiagrosvenoriand 8 strains from surrounding soil. High amylase producing strains 2 -1 (surrounding soil) and R - 4 (root endophytic bacteria) were isolated. The identification results showed that 2 -1 strain was staphylococcus and R - 4 strain was bacillus, which were gram positive bacteria. The appropriate condition of enzyme production for strains 2 -1 and R - 4 were determined. For strain 2 -1, the appropriate conditions were 1.0% ammonium chloride, 0.5% yeast powder, 1.0% soluble starch, 0.4% sodium chloride, fermentation temperature 40 ℃, and fermentation time 3 days and the enzyme production was 127.65 U/mL under these conditions. For strain R - 4, the appropriate conditions were 0.5% yeast powder, 1.0% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 2.0% soluble starch, fermentation temperature 40 ℃, and fermentation time 3 days, and the enzyme production was 197.21 U/mL under these conditions.

Siraitiagrosvenorii; endophytic bacteria; α -amylase; fermentation condition

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.009

2095 -6002(2017)03 -0061 -05

趙豐麗，吳奔，張昌志，等. 羅漢果內生菌及其周邊土壤中產α -淀粉酶菌株的篩選[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):61-65.

ZHAO Fengli, WU Ben, ZHANG Changzhi, et al. Screening of α -amylase producing strains from endophytic bacteria inSiraitiagrosvenoriiand its surrounding soil[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):61-65.

2016 -06 -29

桂林萊茵生物科技股份有限公司與廣西師范大學合作項目；廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科重14121001 - 4 -3)。

趙豐麗，女，教授，主要從事功能性食品、發酵食品及生物活性成分等研究與開發工作。

TS201.3

A