利用12S rRNA基因標記鑒定魚翅真偽

黃婭琳

(南京森林警察學院, 江蘇 南京 210023; 國家林業局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)

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利用12S rRNA基因標記鑒定魚翅真偽

黃婭琳

(南京森林警察學院, 江蘇 南京 210023; 國家林業局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)

為檢測魚翅樣本真偽及鯊魚種屬，通過提取送檢魚翅、魚翅羹樣本DNA，擴增其線粒體DNA上的用于動物種屬鑒定的12S rRNA基因片段，并進行DNA測序和序列分析，測序結果在GenBank上進行BLAST搜索，與數據庫中相關物種序列進行同源性分析。結果表明，在送檢的23份樣本中，18份魚翅羹樣本、2份粉絲狀魚翅、1份翅狀魚翅中均未成功提取到DNA，未擴增出目的基因片段，而從2份魚翅樣本中成功地提取到了基因組總DNA，并成功擴增出了12S rRNA基因片段，這2份樣本的12S rRNA基因片段的堿基序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)的同源性達到99%。對鑒定出含有鯊魚成分的2份樣本進行高溫泡發處理，高溫泡發實驗表明，1份樣本(22號)有明膠析出。研究證實，12SrRNA基因序列測定技術能準確、快速鑒定待檢樣本中是否含有鯊魚成分，結合高溫泡發時是否有明膠析出可綜合判定魚翅真偽。

魚翅； 真偽； 12S rRNA； 基因標記； 種屬鑒定

魚翅是由某些種類的鯊魚或鰩魚的胸鰭、背鰭和尾鰭部分經過一系列加工而制成細絲狀軟骨的淡干品[1]。從鯊身體上割下的新鮮魚鰭經去砂、去骨、干燥成片狀后稱為明翅，明翅煮后將細絲狀軟骨(翅筋)抽出，干燥成形后稱為翅餅[2]。近年來，魚翅越來越多地走進了尋常百姓的餐桌，成為商業晚宴、大型聚會的必點菜肴。同時，在魚翅高昂價格的引誘下，各種造假和摻假魚翅應運而生，極大地擾亂了市場秩序，侵害了消費者的合法權益。目前我國對魚翅制品的鑒定還沒有國家標準和行業標準，關于魚翅的真假鑒別報道較少[3-5]，主要靠行業內專家和正規酒樓的廚師根據多年的經驗，通過眼看、手摸、口嘗的方法對魚翅的真假和優劣進行鑒別。利用DNA條形碼技術或基因分子標記技術檢測魚翅類食品中鯊魚成分國內外也僅有較少文獻報道[2,4-11]，目前還沒有利用12S rRNA基因標記鑒別魚翅真偽的報道，本研究通過提取疑似魚翅樣本DNA，擴增其線粒體DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)上的12S rRNA基因片段，并對其進行DNA序列分析，以確定魚翅樣本真偽及鯊魚種屬，從而破獲一起惡劣的食品造假案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器設備

本研究對浙江省消費者權益保護委員會送檢的18份疑似魚翅羹樣本和5份疑似魚翅樣本進行實驗。18份疑似魚翅羹樣本分別編號1～18號，5份魚翅樣本分別編號19～23號，如圖1。

NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測儀，美國Thermo公司；Veriti型PCR儀，美國ABI公司；3130xl型測序儀，美國ABI公司；Micro17R型臺式高速冷凍離心機，美國Thermo公司；GeneGenius型全自動凝膠成像系統，英國Syngene公司；電泳儀、電泳槽，美國Bio -Rad公司。DNA提取試劑盒，日本Takara公司；PCR 產物純化試劑盒，日本Takara公司；Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3.1型DNA測序試劑盒，美國ABI公司。

圖1 送檢的疑似魚翅羹及魚翅樣本Fig.1 Suspected shark fin samples

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本DNA的提取

從疑似魚翅羹中取粉絲狀樣本，用純凈水將其表面的油脂及佐料沖洗干凈，用干凈的吸水紙吸干表面水分后，剪取約30 mg置于1.5 mL EP管中；固狀疑似魚翅樣本剪取約20 mg 置于1.5 mL EP管中，將樣本剪碎。樣本基因組總DNA 均用DNA提取試劑盒(Takara公司)提取，提取方法參照試劑盒說明書。組織消化時間延長為10 h。將樣品總DNA置于-20 ℃保存，待后續實驗用。

1.2.2 DNA濃度檢測及電泳檢測

吸取2 μL所提取的DNA溶液加到NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測儀的偵測臺上，根據所測得的OD260值計算DNA的濃度。對鑒定出含DNA的樣本進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳凝膠濃度為1.2%。

1.2.3 PCR擴增

擴增線粒體DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物L1091和H1478[12]，擴增反應在Veriti PCR 儀上進行。12S rRNA基因片段采用以下反應體系：總反應體積為25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各2 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10～20 ng/μL模板1～2 μL，其他為滅菌蒸餾水。上述反應體系在94 ℃預變性3 min然后進入如下循環：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上一共38個循環，循環結束后72 ℃延伸7 min。擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(GENEGENUS)上檢測、成像。

1.2.4 PCR擴增片段測序

PCR產物用PCR 產物(小量)純化試劑盒純化。以純化產物為模板DNA，用ABI公司測序試劑盒進行測序PCR擴增(操作按試劑盒說明)，擴增產物經甲酰胺變性后，上ABI公司3130xl測序儀進行測序。

1.2.5 BLAST搜索及序列對比

將測序結果在GenBank中進行BLAST搜索，并進行同源性分析比對，以確定鯊魚種屬。

1.2.6 高溫泡發實驗

一屆屆的學生與自己所在學校的校園建筑朝夕相處，難免每個人都會在學校的某個角落里，有著特別的記憶。一間教室、一間宿舍里都有可能有著一段難忘的回憶，但是這些故事情感與共鳴感的傳播只局限在當事人的人際交往圈中，無法達到多個人際交往圈的重疊并產生更高程度上的情感共鳴。我們團隊所做的校園漫游社交APP正是為此而生。團隊旨在將這個APP建立成為一個情感寄托與聯系的平臺，為還在學校的以及已經畢業的莘莘學子，創造一個記錄服務校園生活，分享交流對學校的情感，穩固學生與學校的關系，建立牢固關系紐帶的一個記錄分享服務型平臺。

將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，觀察有無黏稠狀明膠溢出。

1.2.7 淀粉檢測實驗

將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，向浸泡液中滴入10%的碘溶液，觀察是否有藍色出現。

2 結果與分析

2.1 電泳檢測結果及分析

1～21號樣本通過超微量蛋白核酸檢測儀檢測，未檢測到DNA，表明其提取的基因組總DNA溶液中不含DNA或DNA含量低。22號、23號樣本的基因組總DNA的濃度分別為1 ng/μL和8 ng/μL。

由圖2可知，23號樣本DNA裂解液中檢測到基因組總DNA，22號樣本DNA裂解液通過瓊脂糖凝膠電泳未檢測到基因組總DNA，推測是由于22號樣本DNA含量過低的緣故，未達到瓊脂糖凝膠電泳的檢測極限的緣故。

以22號和23號樣本基因組總DNA為模板，擴增線粒體DNA上12S rRNA基因片段，結果如圖3。

M為DL2000 分子量標記; 1列為23號樣本總DNA；2列為22號樣本總DNA。圖2 樣本基因組總DNA瓊脂糖電泳Fig.2 Electropherogram of genome total DNA

由圖3可見，檢材通過PCR，得到了清晰的PCR

M列為DL2000分子量標記；1列為空白對照；2列為23號樣本PCR產物；3列為22號樣本PCR產物。圖3 12S rRNA基因片段PCR擴增產物電泳Fig.3 Electropherogram of PCR product of 12S rRNA gene

產物(箭頭所示)，空白對照無擴增產物。

將PCR產物純化后經3130xl測序儀進行測序，所得測序結果如圖4。

圖4 樣品的mtDNA 12S rRNA基因序列Fig.4 Sequence of mtDNA 12S rRNA

由圖4可知，22號和23號樣本DNA擴增產物分別為379 bp和400 bp的基因序列。擴增產物序列經BLAST搜索、同源性分析，發現22號和23號樣本DNA保守片段序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)線粒體DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高達99%，比對結果如圖5和圖6。

Sbjct為黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)12S rRNA基因部分序列；Query為22號樣本12S rRNA基因部分序列。圖5 黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)和22號樣本12S rRNA基因序列比對Fig.5 Comparison of sample 22 sequence with 12S rRNA gene sequence of Carcharhinus limbatus

Sbjct為斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)12S rRNA基因部分序列；Query為23號樣本12S rRNA基因部分序列。圖6 斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)和23號樣本12S rRNA基因序列比對(截自NCBI/blast)Fig.6 Comparison of sample 23 sequence with 12S rRNA gene sequence of Rhizoprionodon terraenovae

由圖5和圖6可知，第22、23號送檢樣本的種屬來源分別被鑒定為黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)。高溫泡發實驗結果表明22號樣本經70 ℃清水浸泡30分鐘后，有大量黏稠透明狀明膠溢出，表明該樣本含有明膠成分，推測22號樣本是用鯊魚肉打成粉和明膠混合后仿制而成的仿翅針。23號樣本無明膠析出，表明不含明膠成分，向其熱水浸泡液中滴入10%的碘溶液后溶液未變成藍色，表明其中不含淀粉成分，因此23號樣本被鑒定為真魚翅。

3 討 論

仿制魚翅通常是以明膠、化學添加劑(淀粉配以一些色素)等作為主要原料制成，不含有鯊魚成分，其在口感和外觀等方面與天然的魚翅很相似。此外，也有將鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成仿翅針，與真翅針形狀極為相似，價格卻比真翅針便宜很多[3]?，F在市場上許多地方出售的假魚翅產品制作工藝已經相當成熟，制作出的假魚翅已經與真魚翅在外觀上很相近，無法從外形上辨別真偽，故本研究利用DNA檢驗技術，針對mtDNA上12S rRNA基因片段，利用通用引物進行PCR擴增，獲得了高純度的目的基因片段。并利用GenBank上豐富的序列資源，通過BLAST搜索、同源性比對，確定本案送檢的22號、23號樣品中分別含有黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分。

本研究在基因位點的選擇上，選用了線粒體DNA上的12S rRNA基因位點，由于疑似魚翅檢材常經過人工干燥或高溫烹飪，通過細胞核DNA是無法提取到符合鑒定需求長度的DNA片段，通常高于200 bp以上的片段就無法擴增出來，而線粒體DNA具有環狀雙鏈的穩定結構、在細胞中拷貝數多等優點，非常適合降解、陳舊檢材的鑒定。此外，線粒體12S rRNA基因的進化速率較快，不同物種間序列差異大，有利于設計針對目標物種的高特異性引物，且擴增該基因的穩定性和可重復性好。12S rRNA基因是在種內個體間的序列差異很小，而種間的序列差異卻較大的DNA 片段，正是物種鑒別的理想標記。美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank中有大量的12S rRNA基因片段比對序列資源，為未知物種的鑒定提供了極大的方便[13-14]。

本實驗所檢的從各大餐館、酒樓購買的魚翅羹樣本(1～18號)、粉絲狀魚翅樣本(19～21號)均不含鯊魚成分，為假魚翅樣本；22號為用鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成的仿翅針，23號樣本不含明膠和淀粉成分，含有斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分，為真魚翅。本研究表明利用12S rRNA基因標記技術結合高溫泡發實驗能準確鑒定魚翅真偽，為打擊不法商販和保證食品安全提供幫助。

[1] 楊維湘,林長治,趙丕揚.海味干貨大全[M].上海:世界圖書出版公司,2005:152-153.

[2] 黃文勝,韓建勛,董潔,等.FINS方法鑒定魚翅和鯊魚軟骨的鯊魚種類[J].食品科技,2011,36(11):265-271. HUANG W S,HAN J X,DONG J,et al.Species identification of shark fins and cartilages with FINS method[J].Food Science and Technology,2011,36(11):265-271.

[3] 郭云霞,冒海琳,張舒亞, 等.魚翅的分類及鑒別方法[J].食品工業,2011(6): 96-99. GUO Y X, MAO H L, ZHANG S Y, et al. Classification and identification of shark fin[J]. Food Industry, 2011(6): 96-99.

[4] 郭云霞,張舒亞,諶鴻超,等.SYBR Green實時熒光PCR檢測食品中鯊魚源性成分真實性方法的建立[J].食品與生物技術學報,2012,31(12):1300-1306. GUO Y X,ZHANG S Y,SHEN H C,et al.Authentication of shark derived material in food using SYBR green fluorescence real -time PCR[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2012,31(12):1300-1306.

[5] 覃芳芳,王德蓮,冼燕萍,等.魚翅類食品中鯊魚成分 PCR 鑒定方法研究[J].現代食品科技,2014,30(4):274-278. QIN F F,WANG D L,XIAN Y P,et al.Identification of shark fins in food with PCR method[J].Modern Food Science and Technology,2014,30(4):274-278.

[6] ARMANI A,TINACCI L,XIONG X,et al. Fish species identification in canned pet food by BLAST and forensically informative nucleotide sequencing (FINS) analysis of short fragments of the mitochondrial 16s ribosomal RNA gene (16S rRNA)[J]. Food Control, 2015, 50: 821-830.

[7] BLANCO M, PéREZ -MARTN R,SOTELO C. Identification of shark species in seafood products by forensically informative nucleotide sequencing (FINS)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(21): 9868-9874.

[8] ABERCROMBIE D L,CLARKE S C,SHIVJI M S. Global -scale genetic identification of hammerhead sharks: appli -cation to assessment of the international fin trade and law enforcement[J]. Conservation Genetics, 2005, 6(5): 775-788.

[9] CHAPMAN D D,ABERCROMBIE D L,DOUADY C J, et al. A streamlined, bi -organelle, multiplex PCR approach to species identification: application to global conservation and trade monitoring of the great white shark,Carcharodoncarcharias[J]. Conservation Genetics, 2003, 4: 415-425.

[10] WONG H K,SHIVJIM S,HANNERR H. Identifying sharks with DNA barcodes:assessing the utility of a nucleotide diagnostic approach[J]. Molecular Ecology Resources, 2009, 9(1): 243-256.

[11] PINHAL D,GADIG O B,WASKO A P,et al. Discrimination of shark species by simple PCR of 5S rDNA repeats[J]. Genetics and Molecular Biology, 2008, 31(1): 361-365.

[12] KOCHER T,THOMAS W,MEYER A,et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86(16): 6196-6200.

[13] 黃璐琦,唐仕歡,李軍德,等.動物藥材分子鑒定研究策略[J].中國中藥雜志,2011,36(3):234-236. HUANG L Q,TANG S H,LI J D,et al.Research strategy on molecular identification of animal medical material[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2011,36(3):234-236.

[14] 黃婭琳.mtDNA 12S rRNA基因序列測定在腐爛動物肌肉樣本鑒定中的應用[J].刑事技術,2005(4):10-11. HUANG Y L.Identification of animal putrid intramuscular swatch by sequencing of patial 12S rRNA gene[J].Forensic Science and Technology,2005(4):10-11.

(責任編輯：李 寧)

Identification of Shark Fin Using 12S rRNA Gene Marker

HUANG Yalin

(NanjingForestPoliceCollege,Nanjing210023,China;WildlifeMaterialEvidenceAppraisalCenteroftheStateForestryAdministration,Nanjing210023,China)

To detect authenticity and species of 23 suspected shark fin samples. DNAs from either shark fin or shark fin derived soup were extracted, and then 12S rRNA gene of mitochondrial DNA that was special for animal species identification was amplified. PCR product was sequenced and homology comparison was deployed by BLAST search in GenBank database with related species sequences. The results showed that, among a total of 23 suspected shark fin samples, 18 soup -sourced, two vermicelli -like, and a fin -like one were failed to extract DNA or amplify target fragments, while the remaining two samples were successful to extract genome DNA and amplify the corresponding 12S rRNA gene fragments. Sequence analysis indicated nucleotide sequences of the 12S rRNA gene fragment from the two samples matched 99% identity toCarcharhinuslimbatusandRhizoprionodonterraenovae, respectively. For those samples containing shark components, high temperature soaking treatment was carried out. High temperature soaking treatment showed gelatin was precipitated in a sample (22#).These results indicated 12S rRNA gene sequence determination could accurately and quickly identify whether the samples contained shark ingredients. If combined with the high temperature soaking treatment to observe whether there was a gelatin precipitation, we can comprehensively judge the authenticity of shark’s fin.

shark fin; authenticity; 12S rRNA; gene marker; species identification

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.010

2095 -6002(2017)03 -0066 -05

黃婭琳. 利用12S rRNA基因標記鑒定魚翅真偽[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):66-70.

HUANG Yalin. Identification of shark fin using 12S rRNA gene marker[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):66-70.

2016 -11 -17

中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助項目(LGYB201518)。

黃婭琳，女，副教授，博士，主要從事野生動物DNA鑒定及相關遺傳學方面的研究。

TS254.7

A