術前氫質子磁共振波譜主要代謝物水平與術中膠質母細胞瘤熒光強度的比較

田海龍，祖玉良，王超超，林 濤，郭振濤，姜 彬，殷 鑫，郭文強，王志剛

山東大學 齊魯醫院神經外科，山東青島 266000

術前氫質子磁共振波譜主要代謝物水平與術中膠質母細胞瘤熒光強度的比較

田海龍，祖玉良，王超超，林 濤，郭振濤，姜 彬，殷 鑫，郭文強，王志剛

山東大學 齊魯醫院神經外科，山東青島 266000

目的 對比分析術前氫質子磁共振波譜成像(1H-MRS)主要代謝物水平和術中熒光素鈉(FLs)標記膠質母細胞瘤(GBM)的熒光強度，探討不同熒光強度GBM組織代謝水平的變化，為GBM熒光手術治療提供客觀依據。方法 對2014年4月1日至2015年12月31日磁共振掃描成像平掃+增強序列新診斷的GBM，完成1H-MRS檢查和FLs標記下手術治療，術后病理確診為GBM的病例行腫瘤邊界Ki67免疫組織化學檢測。對1H-MRS主要代謝物水平與腫瘤熒光強度進行對比分析。結果 33例納入研究，術前1H-MRS診斷結果：25例提示為高級別膠質瘤，N-乙酰門冬氨酸(NAA)峰明顯降低，膽堿(Cho)峰明顯增高；Cho/NAA、NAA/肌酸(Cr)和Cho/Cr在不同腫瘤區域差異有統計學意義(P=0.02，P=0.01，P=0.00)。FLs標記手術結果：術中清晰看見組織熒光；29例全切、4例次全切；術后無急性腦膨出，癲癇發生2例。術后常規病理結果：28例確診為GBM(22例與1H-MRS診斷一致)。GBM腫瘤熒光顯影結果：腫瘤實質區域熒光強度高于腫瘤邊界和瘤周水腫(P=0.01)。1H-MRS代謝物分析結果：不同熒光強度的GBM實質，NAA和Cho峰高度不同(P=0.01，P=0.02)，Cho/NAA不同(P=0.01)；不同熒光強度的GBM邊界，NAA峰高度差異無統計學意義，Cho峰高度不同，Cho/NAA不同(P=0.02，P=0.00)；不同熒光強度GBM瘤周水腫中，NAA和Cho峰高度、Cho/NAA差異無統計學意義(P=0.23，P=0.09，P=0.14)。GBM腫瘤邊界免疫組織化學結果：不同熒光顯影邊界，Ki67表達程度不同(P=0.03)。結論 GBM腫瘤實質熒光強度高于其他區域，不同熒光強度的GBM，代謝水平不同；FLs標記下實施GBM手術治療，需重視術前1H-MRS提供的代謝信息，并就兩者的相關性做進一步探討。

膠質母細胞瘤；氫質子磁共振波譜；熒光素標記

作為重要的非侵襲性腫瘤生物化學定量檢測方法，氫質子磁共振波譜成像(proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)能夠反映膠質瘤生物化學代謝異常的信息，彌補常規核磁共振檢查的不足，對于膠質瘤術前診斷與定位腫瘤有著潛在價值。本研究將1H-MRS與術中熒光素(fluorescein sodium，FLs)標記技術優勢聯合，針對臨床診斷的膠質瘤母細胞瘤(glioblastoma，GBM)患者行磁共振掃描成像(magnetic resonance imaging，MRI)常規+磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy，MRS)檢查，利用熒光實時導航切除腫瘤，并在腫瘤不同區域取材，行光鏡和免疫組織化學檢測，針對腫瘤代謝、熒光顯影強度和分子病理對比分析，探討不同熒光強度GBM組織代謝水平的變化，為GBM熒光手術治療提供客觀依據。

資料和方法

臨床資料 2014年4月1日至2015年12月31日山東大學齊魯醫院(青島)神經外科經MRI平掃+增強序列新診斷的GBM，全部病例完成1H-MRS檢查，開顱行顯微外科手術治療，術中使用FLs標記腫瘤，術后常規病理檢查確定診斷。納入標準：(1)MRI平掃+增強掃描新診斷GBM；(2)行1H-MRS檢查；(3)首次顱內腫瘤切除術；(4)行FLs標記下顯微外科手術治療。排除標準：(1)病理檢查排除GBM；(2)拒絕行1H-MRS檢查；(3)GBM復發；(4)FLs過敏；(5)拒絕FLs標記顯微手術治療；(6)接受過放射或化學治療；(7)合并嚴重肝、腎、心血管、血液系統疾病無法耐受手術；(8)年齡≥80歲和≤3歲?；颊呒覍俸炇鹬橥鈺?。

MRI和1H-MRS檢查 由本院MRI室2名副主任醫師采用雙盲法閱片，分別進行并取平均值。

MRI檢查：所有病例均采用荷蘭PHILIPS Ingenia 3.0T超導磁共振掃描機，使用全數字15通道并行采集相控陣頭線圈進行掃描。常規MRI掃描包括橫軸位擾相自旋回波T1加權成像(重復時間：2000 ms，回波時間/反轉時間：20 ms/800 ms)、擾相自旋回波T2加權成像(重復時間/回波時間2365 ms/107 ms)、T2加權液體衰減反轉回復序列(重復時間11 000 ms，反轉時間2800 ms，回波時間125 ms)、彌散加權成像(b=1000)，層厚/層間距：6 mm/1 mm，視野=210 mm×210 mm，重建矩陣=384×384。增強掃描行矢狀位、橫斷面及冠狀面 T1加權增強掃描，經肘前靜脈注射造影劑釓賁替酸葡甲胺，劑量為0.2 mmol/kg體質量。

1H-MRS檢查：所有病灶均在術前行多體素1H-MRS檢查，采用二維點分辨波譜分析法技術，重復時間2000 ms，回波時間144 ms，翻轉角90°，選擇性水激發水抑制技術(水抑制帶寬140 Hz，水抑制率>96%，二次激發角300，半高全寬32 Hz)。視野120 mm×120 mm～140 mm×140 mm，采集次數=1，重建矩陣512×512，成像時間286 s。數據后處理采用本機或原裝工作站軟件Spetro View進行數據處理。以健側的正常腦組織作為對照，在增強后橫斷面T1加權圖像上定位感興趣區(region of interest，ROI)層面位于腫瘤的實質(盡可能包括目的腫瘤強化區)、強化邊緣區(腫瘤邊界)和周圍水腫組織。掃描結束后，測定N-乙酰門冬氨酸(N-acetylaspartate，NAA)、肌酸(creatine，Cr)、膽堿(choline，Cho)的峰下面積，采用LCModel軟件對磁共振頻譜Pfile文件數據進行基線校正等后處理，應用內參考標準(腦白質水的濃度)進行絕對定量分析；并計算 Cho/Cr、Cho/NAA、NAA/Cr的比值。

手術方法和FLs標記 完善術前常規檢查，行鎖骨下或頸內靜脈穿刺置管。FLs皮試：將0.5 ml的20%FLs注射液(3 ml∶600 mg，廣州白云山明興制藥生產，國藥準字：H44023400)稀釋至3%，由深靜脈推注5 ml，監測患者生命體征及有無皮疹發生；無異常者將20%FLs稀釋至1%～1.5%，以3 mg/kg靜脈推注。均采用氣管插管及靜脈復合全麻，氣管插管后不再使用肌松藥，常規開顱，掀起骨瓣后暴露腫瘤(推注后60～75 min)。在激發狀態下，通過安裝YELLOW 560 nm 濾光片的Pentero 900手術顯微鏡(Carl Zeiss Meditec，Oberkochen，Germany)觀察到腫瘤及瘤周水腫組織可呈現強熒光顯影區(明黃色)、弱熒光顯影區(淺黃色)或無熒光顯影。根據熒光染色強度，結合MRI強化邊界及MRS定位的感興趣區等影像學信息，分辨和切除腫瘤。腫瘤切除過程中，腦葉塌陷造成的腦移位可能導致影像與腫瘤空間位置的差異，手術切除程度仍以熒光染色強度為主，并以腫瘤與正常腦組織質地的差異為參考。熒光可保持3～4 h，然后自行消退。

組織學檢查方法 新鮮切除腫瘤標本，常規固定、包埋、切片，HE染色后鏡下觀察。腫瘤邊界免疫組織化學檢測Ki67表達：取石蠟切片，貼附于載玻片上備用。采用SP法，單克隆抗體選用Ki67，抗體購自福州邁新公司。判斷標準及評價：陽性以胞漿染色呈棕黃色為判定標準，評估染色百分率并分級：無陽性細胞或陽性細胞<10%為陰性；陽性細胞比率在10%～50%陽性(+)；陽性細胞比率>50%強陽性(++)。

統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示；GBM定位ROI層面與熒光強度的比較采用多個構成比比較的χ2檢驗；GBM中不同腫瘤區域1H-MRS主要代謝物比較，1H-MRS 中NAA、Cho峰度及 Cho/NAA與GBM中熒光強度的比較，均采用單因素方差分析，雙向P值，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

常規MRI平掃+增強檢查結果 33例常規MRI平掃+增強診斷為GBM的病例符合本研究納入標準，其中男19例、女14例，年齡29～74歲，平均(39.5±0.45)歲。MRI表現為病灶信號不均，并伴出血、鈣化、壞死或囊變，瘤周水腫及占位效應明顯，T2加權液體衰減反轉回復序列像病灶呈高或混雜高信號；注射釓噴替酸葡甲胺增強掃描后，3例未見明顯強化，1例輕度強化，余29例呈環形、花環形或不均勻強化(圖1)。

1H-MRS分析結果 25例考慮為高級別膠質瘤，表現為病變區域NAA峰明顯降低，Cho明顯增高；腫瘤實質、邊界和瘤周水腫Cho/NAA 和 Cho/Cr 比值較對照區顯著升高(圖1D)；腫瘤實質區域NAA峰明顯低于腫瘤邊界和瘤周水腫(F=7.33，P=0.00)，腫瘤實質區域Cho峰明顯高于腫瘤邊界和瘤周水腫(F=5.79，P=0.02)，不同腫瘤區域Cr峰度差異無統計學意義(F=1.25，P=0.11)；腫瘤實質區域Cho/NAA和Cho/Cr明顯高于邊界和瘤周水腫(F=5.98，F=6.84，P=0.02，P=0.01)、NAA/Cr明顯低于邊界和瘤周水腫(F=6.32，P=0.00)(表1)。

FLs標記手術和病理學檢查結果 所有病例在注射FLs 60～70 min后均能清晰看見組織熒光(圖1C)，平均手術時間(192 ±7.5)min(91～ 235 min)。術中YELLOW 560 nm濾光器可以通過顯微鏡手柄上的按鈕順利打開和關閉。33例中29例全切、4例次全切。術后無急性腦膨出，癲癇發生2例。術后病理證實33例術前診斷的GBM，其中28例獲得病理確診(22例與1H-MRS診斷一致)，余5例分別為間變性星形細胞瘤2例(與1H-MRS診斷一致)、轉移瘤2例(與1H-MRS診斷一致)、淋巴瘤1例(1H-MRS代謝表現為高級別膠質瘤)。

GBM定位不同ROI層面中熒光強度的比較結果 腫瘤實質區域熒光強度高于腫瘤邊界和瘤周水腫(χ2=10.28，P=0.01)(表2)；1H-MRS 中NAA、Cho峰度及 Cho/NAA與GBM中熒光強度的比較顯示，強熒光腫瘤實質中，NAA峰度最低，Cho峰度最高(F=7.24，F=4.91，P=0.01，P=0.02)，Cho/NAA高于弱熒光和無熒光腫瘤實質(F=5.33，P=0.01)；不同熒光強度腫瘤邊界中，NAA峰度差異無統計學意義(F=1.17，P=0.46)，Cho峰度不同，Cho/NAA不同(F=5.00，F=7.08，P=0.02，P=0.00)；不同熒光強度瘤周水腫中，NAA和Cho峰度、Cho/NAA差異無統計學意義(F=2.95，F=1.83，F=2.46，P=0.23，P=0.09，P=0.14)(表3)。不同熒光強度GBM腫瘤邊界的Ki67表達程度比較顯示，GBM腫瘤邊界不同的熒光強度組織，其Ki67表達程度不同，強熒光腫瘤邊界，Ki67表達高于弱熒光腫瘤邊界組織(χ2=9.01，P=0.03)。

GBM：膠質母細胞瘤；MRI：磁共振掃描成像；1H-MRS：氫質子磁共振波譜成像；NAA：N-乙酰門冬氨酸；Cr：肌酸；Cho：膽堿GBM：glioblastoma；MRI：magnetic resonance imaging；1H-MRS：proton magnetic resonance spectroscopy;NAA：N-acetylaspartate；Cr：creatine；Cho：choline

A.術前MRI平掃及增強影像顯示右側額葉不規則環形強化病變；B.術后MRI增強影像顯示右側額葉無異常強化；C.腫瘤組織不同區域熒光顯影程度不同(1：腫瘤實質；2：腫瘤邊界；3：瘤周水腫)；D.1H-MRS顯示腫瘤區域NAA峰明顯減低，Cr峰稍減低，Cho峰明顯升高，Cho/Cr、Cho/NAA 值增高

A.preoperative MRI plain scan and enhanced image displayed a irregular ring enhanced lesion in right frontal lobe；B.postoperative MRI images showed no abnormal enhancement in right frontal lobe；C.different fluorescence imaging in different tumor regions(1：tumor parenchyma；2：tumor boundary；3：peritumoral edema)；D.1H-MRS showed significantly decreased NAA peak，slightly decreased Cr peak，significantly increased Cho，and increased values of Cho/Cr and Cho/NAA in tumor region

圖 1 男，39 歲，右側額葉GBM

Fig 1 A 39-year-old male patient with GBM in right frontal lobe

表 1 28例GBM中不同腫瘤區域1H-MRS 主要代謝物比較(-±s)Table 1 Comparisons of major metabolites of 1H-MRS of different tumor regions in 28 GBM(-±s)

F、P：腫瘤實質區域與腫瘤邊界和瘤周水腫區域比較

F,P：tumor parenchymavs.tumor boundary and peritumoral edema

表 2 28例GBM不同定位感興趣區層面中熒光強度的比較(n)Table 2 Comparison of fluorescence intensity in different regions of interest in 28 GBM(n)

χ2、P：腫瘤實質區域與腫瘤邊界和瘤周水腫區域比較

χ2,P：tumor parenchymavs.tumor boundary and peritumoral edema

表 3 GBM中熒光強度與1H-MRS 中NAA、Cho峰度及 Cho/NAA比值的比較(-±s)Table 3 Comparison of the fluorescence intensity GBM and 1H-MRS in the kurtosis of NAA and Cho and the ratio of Cho/NAA(-±s)

F、P：強熒光與弱熒光和無熒光區域比較

F,P：strong fluorescence intensityvs.weak and none fluorescence intensity

討 論

2001年，Croteau等[1]提出MRS有望成為精準引導腦腫瘤手術切除的重要手段，Son等[2]認為MRS 判定的腫瘤代謝信息與病理組織學所見一致。Hall等[3]肯定多體素1H-MRS確定膠質瘤活檢部位的積極作用，指出定位于Cho 最大和NAA最小(腫瘤細胞增生最活躍)的活檢區域可提高活檢的確診率。Laprie等[4]認為異常波譜顯示的病變進展較常規影像及臨床表現早2～5個月。目前，MRS與FLs的對比或相關性研究報道較少見。有學者指出，FLs能夠很好地分辨和定位膠質瘤，血腦屏障的破壞是熒光素鈉進入組織的前提。作為一種熒光染料，FLs通過被破壞的血腦屏障進入腫瘤細胞內，使腫瘤組織及腫瘤浸潤的部分在熒光顯微鏡下呈現特定的熒光影像，從而定位腫瘤并區分邊界[5- 6]。但是熒光邊界和腫瘤代謝之間的聯系，尚不明確。

本研究顯示，不同1H-MRS感興趣區，即腫瘤不同區域的熒光強度不同(P<0.05)。分析原因可能為：(1)腫瘤實質、邊界和瘤周水腫等不同區域，血腦屏障受破壞的程度不同，所以FLs在GBM不同區域的分布有差異[7- 10]；(2)FLs劑量、FLs給藥時間亦影響熒光顯影效果。注射FLs后30～45 min，白光下瘤體已開始呈現淺黃色并逐漸加深，60～70 min后能清晰看見組織熒光，90～120 min達到高峰，3～4 h后開始消退；本研究平均手術時間(192±7.5)min(91～ 235 min)，其中切除腫瘤的操作時間與FLs達峰時間基本一致，目的是減少藥物血管內衰減對熒光顯影效果的影響。此外，雖然FLs應用于眼科診斷的安全性已獲肯定，但是應用FLs標記腫瘤的劑量并不統一：歐洲和北美學者報道的劑量普遍較大(5～12 mg/kg)，甚至曾報道20 mg/kg用量[10- 13]；國內多報道5 mg/kg左右劑量，日本學者應用5～10 mg/kg劑量，除了進行膠質瘤切除手術，還進行顱內動脈瘤和動靜脈畸形術中的血管顯影[14]。本研究劑量在3 mg/kg，除發生2例皮疹過敏反應外，未發生術中血壓、心率突變情況，熒光顯影的持續時間較理想。后續研究擬分析FLs濃度梯度與顯影程度的關系，進一步優化給藥劑量。

不同腫瘤區域NAA和Cho峰度不同，Cho/NAA、NAA/Cr和Cho/Cr在不同腫瘤區域有差異(P<0.05)，是GBM等高級別膠質瘤在1H-MRS的特征性表現，提示GBM這種高度惡性的腫瘤細胞分裂失控，細胞膜轉換增強，腫瘤細胞對正常神經元的破壞也明顯增強[1，4]；因此，本研究結果提示GBM的血腦屏障破壞與NAA、Cho等主要代謝物的代謝水平之間，可能存在一致性關系，需要從相關性、敏感性和特異性等方面進一步驗證。但是，不同熒光強度的腫瘤邊界中，Cho峰度不同，Cho/NAA不同，而NAA峰度無差異，似乎與上述推論有悖。分析與以下因素有關：(1)GBM的異質性表現為不同的GBM腫瘤個體，或者同一GBM腫瘤個體的不同區域，其腫瘤分子病理和生物學行為特點可能具有較大差異[15- 17]。本研究不同熒光強度的腫瘤邊界免疫組織化學檢測提示，GBM腫瘤邊界的強熒光顯影組織和弱/無熒光顯影組織，其Ki67表達程度不同。受樣本量限制，只能按Ki67的兩個表達程度范圍進行比較(Ki67≤10%和Ki67>10%)，今后將擴大樣本量，進一步分析GBM腫瘤實質、邊界、瘤周水腫等區域主要代謝物與Ki67等分子病理標志物的相關性；(2)腦漂移是實時熒光導航難以避免的局限性。由于腫瘤切除過程中腦葉不斷塌陷，相對于術前增強MRI和1H-MRS的定位結果，術中實時觀察到的腫瘤邊界將發生有限的位移，手術病理取材和成像位置無法完全對應，造成GBM代謝邊界和熒光邊界的偏倚[8- 9，11- 12]；(3)目前熒光定量仍以熒光顯微鏡下的顯影效果為主，缺乏客觀的絕對定量，在一定程度掩蓋了主要代謝物在不同熒光強度腫瘤組織間變化的實際差異，腫瘤組織熒光光度分析方法有望減少誤差的出現[18]。

綜上，GBM腫瘤實質熒光強度高于其他區域，不同熒光強度的GBM代謝水平不同；FLs標記下實施GBM手術治療，需重視術前1H-MRS提供的代謝信息，并擴大樣本量和分子病理標志物檢測范圍，進一步完善兩者相關性的驗證。

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Major Metabolite Levels of Preoperative Proton Magnetic Resonance Sectroscopy and Intraoperative Fluorescence Intensity in Glioblastoma

TIAN Hailong，ZU Yuliang，WANG Chaochao，LIN Tao，GUO Zhentao，JIANG Bin，YIN Xin，GUO Wenqiang，WANG Zhigang

Department of Neurosurgery，Qilu Hospital，Shandong University，Qingdao，Shandong 266000，China

WANG Zhigang Tel/Fax：0532- 66850752，E-mail：wzg1110@126.com

Objective To compare the intraoperative major metabolite level of preoperative proton magnetic resonance spectroscopy(1H-MRS)and fluorescence intensity marked with fluorescein sodium(FLs)in glioblastoma(GBM)and thus provide an objective basis for fluorescence surgical treatment of GBM.Methods All newly diagnosed patients by plain and enhanced magnetic resonance imaging from the April 1，2014 to December 31，2015 were enrolled in this study.All of them received1H-MRS and marked with FLs.The expression of Ki67 in tumor boundary were confirmed by postoperative pathology and determined by immunostaining assay.The relationship between1H-MRS metabolite levels and tumor fluorescence intensity was analyzed.Results Totally 33 patients were included in the study.Preoperative1H-MRS revealed high-grade gliomas in 25 cases.The N-acetylaspartate(NAA)decreased significantly and choline(Cho)increased significantly in high-grade gliomas.The ratios of Cho/NAA，NAA/creatine(Cr)，and Cho/Cr significantly differed in different tumor regions(P=0.02，P=0.01，andP=0.00，respectively).Surgical results were marked with FLs intraoperatively.Tissue fluorescence were clearly seen.There were 29 patients undergoing total resection and 4 cases undergoing subtotal resection.No acute encephalocele occured after operation，while 2 patients suffered from epilepsy.Postoperative pathology results included：28 cases were diagnosed as GBM(22 cases consistent with1H-MRS diagnosis).The results of GBM fluorescence imaging included：the level of fluorescence intensity in tumor parenchyma was significantly higher than that in tumor boundary and peritumoral edema(P=0.01).The result of1H-MRS metabolite analysis included：The kurtosis of NAA and of Cho and the ratio of Cho/NAA were significantly different according the fluorescence intensity in tumor parenchyma(P=0.01，P=0.02，andP=0.01).While there was no difference in the kurtosis of NAA，the kurtosis of Cho and the ratio of Cho/NAA were significantly different according the fluorescence intensity in tumor boundary(P=0.02，P=0.00).In peritumoral edema，there was no significant different in kurtosis of NAA and of Cho and in the ratio of Cho/NAA(P=0.23，P=0.09，P=0.14).Immunohistochemistry in GBM tumor boundary showed different Ki67 expressions according to different fluorescence imaging(P=0.03).Conclusions The fluorescence intensity in GBM parenchyma is higher than that in other tumor regions，and there are different metabolic levels in different fluorescence intensity.The metabolic information marked by FLs and provided by1H-MRS before operationis are important，and the correlation between them should be further investigated.

glioblastoma；proton magnetic resonance spectroscopy；fluorescence labeling

511-517

山東大學齊魯醫院(青島)科研啟動基金(QDKY2015LH01)Supported by the Initiating Research Foundation of Qilu Hospital(Qingdao)in Shandong University(QDKY2015LH01)

王志剛 電話/傳真：0532- 66850752，電子郵件：wzg1110@126.com

R616.2

A

1000- 503X(2017)04- 0511- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.04.009

2016- 03- 22)