基于拉曼光譜對人舌鱗癌動物模型的建立與檢測

鐘會清， 張 武， 侯雨晴， 蘇成康， 劉智明， 姜雪梅， 郭周義*, 劉寧湘

(1. 華南師范大學生物光子學研究院，國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室，廣州 510631；2. 暨南大學附屬第一醫院,廣州 510632)

基于拉曼光譜對人舌鱗癌動物模型的建立與檢測

鐘會清1， 張 武2， 侯雨晴1， 蘇成康1， 劉智明1， 姜雪梅1， 郭周義1*, 劉寧湘2

(1. 華南師范大學生物光子學研究院，國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室，廣州 510631；2. 暨南大學附屬第一醫院,廣州 510632)

建立人舌鱗癌細胞體外癌變模型, 采用激光共焦顯微拉曼光譜儀對其進行檢測,從分子層面對其進行分析. 通過培養CAL-27細胞，然后注射在裸鼠皮下成瘤，采用激光共焦顯微拉曼光譜儀和蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察其癌變的情況. 結果表明，正常皮膚組織的切片清晰可見，其細胞層次清晰、整齊，但是腫瘤組織發現上皮異常增生，細胞多形性，結構層次非常不清楚；采用共焦顯微拉曼光譜技術，結合主成分分析法和線性判別技術對健康裸鼠和人舌鱗癌細胞體外癌變組織進行分類，其得到診斷靈敏度為98.3%，特異性為95.0%，診斷正確率為96.7%. 該方法可以很好地對該動物模型進行在體的檢測.

激光共焦顯微拉曼光譜儀； 人舌鱗癌細胞； HE染色； 主成分分析法； 線性判別技術

舌癌的發病率位居頭頸部惡性腫瘤之首，且有逐年上升的趨勢，易發于男性，發病年齡在40～60歲居多，但近年來有女性增多及發病年齡年輕化的趨勢，盡管醫學工作者及研究人員在不斷努力，而舌癌Ⅰ期的早期診斷病例僅占10.9%～25.4%，其5年存活率仍一直徘徊在50%～60%左右[1-4]. 但其發生發展機制至今仍不清楚， 在一定程度上限制了舌癌預防、診斷和治療水平的進一步提高[5]. 同時建立舌癌體外動物模型則是研究發生發展機制必需的實驗平臺[6]. 之前研究者主要采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察動物模型組織的形態變化來研究舌癌的機制問題， 該方法準確率相對高，但是繁瑣、工作量大、有創傷、不能進行實時監測. 拉曼光譜屬于分子振動譜，由于不同分子的化學鍵或官能團具有不同的振動能級，所以可以通過分子振動和轉動能級差的特征頻移得到分子結構或成分的信息. 因此，拉曼光譜具有分子指紋特征，能從分子水平上探測組織細胞內的蛋白、核酸、脂類、糖類等生物分子的精細結構和信息，它是研究分子結構和功能的有效方法之一，具有快速、簡單、無損、準確等優點[7-8]. 目前，拉曼光譜已被廣泛應用于人體組織(皮膚、乳腺、胃、肺等)和體液(血清、血漿、尿液、唾液、眼淚和精液等)的檢測，常被用于疾病的診斷，特別是癌癥早期的檢測與診斷的研究[9-16]. 本文采用激光共焦顯微拉曼光譜對人舌鱗癌細胞體外癌變模型進行在體檢測，從而為進一步研究舌癌發生發展機制提供一個更好方法.

1 研究方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM細胞培養基粉末(高糖)GIBCO (Grand Island, NY, United States)、胚牛血清(FBS)和胰蛋白酶(含0.25%EDTA)(天津TBD生物試劑公司). BALB/C-nu/nu裸鼠(中山大學動物中心提供，4周齡，雌雄兼用. 本文動物實驗已向華南師范大學倫理委員會備案并獲批.)、人舌鱗癌細胞CAL-27(上海瑞鹿生物科技有限公司).

Renishaw inVia型共聚焦顯微拉曼光譜系統(英國雷尼紹貿易有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 人舌鱗癌細胞(CAL-27)培養及體外人舌鱗癌細胞模型的建立 細胞培養方式：10%小牛血清的DMEM(高糖)培養液，于37 ℃ CO2恒溫培養箱內常規培養. 取對數增值期貼壁生長的人舌鱗癌CAL-27細胞，消化后，再將DMEM(高糖)培養液沖洗、吹打、離心. 所有動物隨機分2組(空白對照組和模型組)，每組60只. 空白對照組不進行任何處理，但模型組按照35 μg/g體質量腹腔注射1.25%戊巴比妥鈉麻醉BALB/C-nu/nu裸鼠，將細胞懸液(4×1010個/孔， 0.05 mL)注入裸鼠背部皮下，再將動物放入動物培養箱里繼續飼養，每天對其進行觀察，15 d后在接種位置發現一個透明的小包.

1.2.2 形態學觀察 在裸鼠接種15 d后且經過拉曼光譜掃描之后，處死裸鼠，將接種位置的皮膚取下，計算成瘤率，并將標本放入含有10%中性甲醛的棕色瓶中固定，然后按照常規石蠟包埋、切片、HE染色、光學顯微鏡下觀察.1.2.3 激光共焦顯微拉曼光譜的檢測及數據處理 使用顯微共焦拉曼光譜儀,光譜測量范圍600～1 800 cm-1，光譜分辨率約1 cm-1，激發光源為785 nm半導體激光，樣品上的激發功率約為0.5 mW，激光光斑直徑為5 μm. 儀器配套的顯微鏡為萊卡DM2500，物鏡放大倍數50×. 每條譜線累計測量2次，每次10 s. 每個樣品在不同位點測量3次，然后取平均譜. 所有譜線都在相同條件下測量，光譜的獲取與分析均使用拉曼軟件包WIRE 3.2.

為了去除拉曼譜線背景噪聲，采用五階多項式擬合背景曲線后從原始譜線中扣除. 為了便于比較不同樣品光譜形狀和譜峰的相對強度，對曲線下的光譜面積進行歸一化處理. 光譜的平滑和基線修正采用Vancouver拉曼算法,Vancouver是一個能進行批處理的扣除熒光背景噪聲和曲線平滑的算法.

2 結果與討論

2.1 腫瘤組織形態學

在裸鼠左后背部皮膚接種后，再讓動物繼續在動物房飼養并觀察(圖1)，正常裸鼠皮膚組織結構層次清晰(圖1A)，能明顯區分角質層、表皮層、真皮層，但是在接種后15 d后，可觀察到一個透明的小胞(圖1B)，接種組腫瘤組織結構層次混亂，難以區分各層. 從該圖可見造模成功. 空白對照組和模型組的裸鼠在拉曼檢測之后，采用麻醉藥麻醉后取小胞及其周圍組織以及正常裸鼠該位置的皮膚進行病理組織切片實驗.

圖1 空白對照組與CAL-27細胞接種組的照片及其HE染色病理切片圖(100×)

Figure 1 The photo and HE photo of control group and CAL-27 cell vaccination group (100×)

2.2 皮膚組織與腫瘤組織在體檢測的拉曼光譜

對120只裸鼠進行檢測，最后得到的光譜用于主成分和線性判別分析. 圖2顯示了腫瘤裸鼠和健康裸鼠皮膚的平均譜及差譜. 在健康皮膚與腫瘤皮膚的譜中，主要的拉曼峰有751、831、854、940、1 004、1 032、1 086、1 129、1 159、1 208、1 341、1 451、1 557、1 657 cm-1，詳細的譜峰歸屬見表1. 從圖2中差譜發現在1 004、1 451、1 657 cm-1處腫瘤皮膚相對健康皮膚的峰要強[17]，但是在751 cm-1的位置其相對健康皮膚要弱.

圖2 正常皮膚組織與腫瘤組織的平均譜及差譜

Figure 2 Average Raman spectra of cancer tissue from nude mouse, normal tissue, and cancer-normal difference spectra

表1 舌癌動物模型皮膚接種的拉曼光譜歸屬

Table 1 Tentative assignments of major vibrational modes identified in carcinoma of the tongue model skin of nude mouse

峰位置/cm-1歸屬751色氨酸的對稱呼吸模型831酪氨酸O—P—O伸縮模型854酪氨酸和脯氨酸環C—C伸縮呼吸模型940膠原蛋白的C—C骨骼α螺旋纈氨酸1004苯丙氨酸的對稱呼吸振動模型1032苯丙氨酸C—H對稱伸縮模型1086蛋白C—N伸縮模型1129脂類C—C伸縮模型1159蛋白C—C/C—N伸縮模型1208蛋白質色氨酸、丙氨酸的C—C6H5伸縮振動模型1341膠原蛋白和核苷酸鏈CH3CH2搖擺模型1451蛋白和脂類CH3CH2變形振動模型1557色氨酸1657角蛋白AmideICC伸縮模型

采用主成分析法來區分正常組織和癌變組織. 通過正交變換，數據集中的變量極大減少而所包含的信息沒有損失. 該研究主要采用主成分分析用于處理拉曼光譜，并取主要貢獻的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)作散點圖(圖3). 采用主成分分析法分析其前2個成分的散點圖可區分健康皮膚和腫瘤皮膚.

圖3 裸鼠正常皮膚組織和腫瘤組織拉曼光譜經PCA主成分分析的散點圖

Figure 3 Scatter plot of PCA result for normal and cancer groups with PC1 and PC2 as two axes

將人舌鱗癌細胞接種于裸鼠皮膚上，采用主成分分析法和線性判別分析技術搜索腫瘤組織病理特征拉曼光譜. 利用主成分分析法結合留一交叉檢驗法，繪制裸鼠皮膚正常組織與腫瘤組織拉曼光譜的線性判別得分散點圖(圖4)，分界線產生的診斷靈敏度為98.3%(59/60)，特異性為95.0%(57/60)，總診斷準確率為96.7%(116/120). 從上述結果說明利用主成分分析法結合線性判別分析技術可為人舌鱗癌細胞接種于裸鼠皮膚上腫瘤的快速無創診斷發展了一條新的途徑.

圖4 正常皮膚組織與腫瘤組織采用主成分分析和線性判別得分散點圖

Figure 4 Scatter plot of the linear discriminant scores of normal skin and skin of carcinoma of the tongue of animal model using PCA-LDA

為了進一步驗證構建的PCA-LDA算法的有效性，采用工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲線方法來評價該算法. ROC曲線越靠近左上角，判別的準確性就越高，最靠近左上角的點是錯誤最少的最好閾值，其假陽性和假陰性的總數最少. ROC曲線下的面積與診斷準確性緊密相關，處于ROC下方的面積(Area Under ROC Curve, AUC)越接近于1，說明診斷效果越好. 對PCA-LDA診斷模型所得判別函數得分進行分析得到ROC曲線(圖5), 該ROC曲線下的面積為0.983，說明本文提出后方法具有較高準確性，該結果進一步驗證了PCA-LDA算法的診斷能力.

圖5 PCA-LDA算法的被試工作特性曲線

Figure 5 Receiver operating characteristic curve of PCA-LDA algorithm

3 結論

提出一種高效的人舌鱗癌細胞體外動物癌變的拉曼光譜診斷模型，該模型是通過主成分分析法和線性辨別分析技術挑選與生化成分相關的特征拉曼帶. 利用該模型獲得了較高的總診斷準確率、靈敏度和特異性. 相對于HE染色方法具有無創傷、可在體檢測等優點. 結果表明，拉曼光譜結合主成分分析法和線性判別技術在無創傷探測和診斷人舌鱗癌體外動物模型方面有巨大的潛力，為研究舌癌發生發展機制提供有效的途徑.

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【中文責編：譚春林 英文審校：肖菁】

Establishment and Detectionof a Carcinogenesis Model of Human Squamous Tongue Cancer Based on Raman Spectrometer

ZHONG Huiqing1, ZHANG Wu2, HOU Yuqing1, SU Chengkang1, LIU Zhiming1, JIANG Xuemei1, GUO Zhouyi1*, LIU Ningxiang2

(1. SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology, College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. The First Affiliated Hospital of Jinan University, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The aim of this paper is to establish a carcinogenesis model of human squamous tongue cancer cell in vitro. The model is tested by laser confocal micro Raman spectrometer and is analyzed from the molecular level. The CAL-27 cells are cultivated, and injected subcutaneously in nude mice into a tumor, then using laser confocal micro Raman spectrometer and Hematoxylin-eosin (HE) staining, the canceration is obtained. From the normal skin tissue slice, it can be seen that the cellular level is clear and neat. But it can be found that the tumor epithelial dysplasia is cellular pleomorphism and the structure level is not clear. After laser confocal micro Raman spectrometer observing, the principal components analysis (PCA) combination with linear discrimination analysis (LDA) are used to classify the health nude mice and human tongue squamous cancer cells in vitro tumor tissue. It can be obtained the diagnostic sensitivity of 98.3%, specificity of 95.0% and accuracies of 96.7%. It is shown that this method is very good for detecting the animal modelinvivo.

laser confocal micro Raman spectrometer; human squamous tongue cancer cell; HE staining; principal components analysis (PCA); linear discrimination analysis(LDA)

2017-03-20 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目 (31300691，61675072，21505047，61335011，11404116)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目 (20134407120003)；廣東省科技計劃項目(2014A020212282)；廣東省自然科學基金重點項目 (9251063101000009)；廣東省重大科技專項項目 (2012A080203008)；廣東省教育廳科技創新項目 (2013KJCX0052)

O433.1,R739.86

A

1000-5463(2017)04-0001-04

*通訊作者:郭周義,教授，Email: ann@scnu.edu.cn.