萊克多巴胺新型分子印跡納米管膜的研究及應用

陳 忻, 陳曉剛, 潘嘉慧,沈國權, 趙亮亮, 梁 勇

(1. 佛山科學技術學院, 佛山 5282311; 2. 佛山市質量計量監督檢測中心, 佛山 528225; 3. 華南師范大學化學與環境學院, 廣州 510006)

萊克多巴胺新型分子印跡納米管膜的研究及應用

陳 忻1, 陳曉剛1, 潘嘉慧2,沈國權2, 趙亮亮2, 梁 勇3*

(1. 佛山科學技術學院, 佛山 5282311; 2. 佛山市質量計量監督檢測中心, 佛山 528225; 3. 華南師范大學化學與環境學院, 廣州 510006)

基于表面引發原子轉移自由基聚合 (ATRP), 采用陽極氧化鋁 (AAO) 膜合成了萊克多巴胺印跡聚合物(MIP)納米管膜, 以甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體,n(萊克多巴胺)∶n(MAA)為1∶6. 利用掃描電子顯微鏡 (SEM) 對MIP納米管膜的形態進行表征, 結果顯示, 在AAO表面成功修飾了MIP納米管膜. 與萊克多巴胺NIP納米管膜相比, MIP納米管膜對萊克多巴胺及其類似物有更高的吸附容量和更好的選擇性. 建立了MIP納米管膜萃取與HPLC聯用, 針對β2-腎上腺素受體激動劑檢測的方法. 萊克多巴胺(RAC)的線性范圍是10～1 000 μg/L, 克倫特羅(CLEN)、腎上腺素(EP)和多巴胺(DA)的線性范圍為100～1 000 μg/L, 特布他林(TER)的線性范圍是200～1 000 μg/L. 檢出限的范圍在0.74～2.50 μg/L. 該方法能對豬肉樣品中β2-腎上腺素受體激動劑實現有效檢測.

分子印跡聚合物; 陽極氧化鋁膜; 原子轉移自由基聚合;β2-腎上腺素受體激動劑

萊克多巴胺 (Ractopamine, RAC) 屬于β2-腎上腺素受體激動劑類藥物, 能促進動物肌肉生長和蛋白質堆積, 但是, 過量使用會導致其在動物組織中累積, 可能影響人類健康. 因此, 對樣品中RAC的殘留進行檢測顯得尤為重要[1]. 目前用于萊克多巴胺的檢測方法有氣相色譜法[2]、高效液相色譜法 (HPLC)[3]、氣相色譜-質譜聯用法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5-6]、分子印跡聚合物萃取-液相色譜聯用[7-8]和分子印跡聚合物電化學傳感器[9-10]等. 無論采取何種分析方法, 為了降低檢出限和消除干擾, 通常需要富集和洗脫等步驟.

分子印跡技術是能夠設計和構建對目標分子實現特異性識別的三維空穴的體系[11]. 多數研究將萊克多巴胺印跡聚合物(MIP)用作吸附劑[7-12]. 雖然這些方法操作簡便, 且能選擇性地提取β2-腎上腺素受體激動劑, 但是吸附量并不高. 因此, 建立一種對于監測β2-腎上腺素受體激動劑的簡便、高效、高選擇性、穩定的預處理方法顯得尤為重要.

陽極氧化鋁 (AAO) 膜是一種表面積極大的二維納米點陣材料, 并且有良好的吸附性能[13]. 由于擁有高度有序六邊形納米孔序列, 以及孔徑、厚度、形狀可調的優點, AAO可用于制造各種各樣納米結構的材料, 比如納米點、納米棒、納米線、納米管、納米孔陣列[14-20]. 利用AAO作為分子印跡的納米反應器可以有效克服傳統印跡存在的問題. 六邊形的AAO通道可以固化單體和模板分子的納米反應器. 制得的AAO-MIP尺寸小, 具有極高的比表面積, 因此, 大多數的模板分子位于MIP的表面或表面附近, 并有望提高結合能力、改善結合動力學, 以及增加模板進入識別位點的機會[21].

本文利用表面引發原子轉移自由基聚合在多孔氧化鋁陽極氧化膜上合成了萊克多巴胺MIP納米管膜. 原子轉移自由基聚合 (ATRP) 是基于鹵素原子從引發劑轉移到單體的, 隨后的聚合物鏈增長是由調節轉移的過渡金屬復合物催化發生的. 作為活性可控自由基聚合的一種, ATRP可應用在各種諸如硅膠、納米管膜和酵母的印跡載體上的表面接枝印跡聚合[22-25]. 本研究建立了MIP納米管膜萃取-高效液相色譜聯用的檢測方法, 并實現對復雜樣品中β2-腎上腺素受體激動劑的檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑

陽極氧化鋁(AAO)板 (上海上木科技有限公司)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、無水乙醇、甲苯、二氯甲烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(97%, 阿拉丁試劑有限公司)、α-甲基丙烯酸 (MAA, 99%, 阿拉丁試劑有限公司)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMOS, 阿拉丁試劑有限公司)、1,1,4,7,7-五甲基二乙烯基三胺 (PMDETA, 阿拉丁試劑有限公司)、2-溴代異丁酰溴 (BMBB, 阿拉丁試劑有限公司)、溴化亞銅 (阿拉丁試劑有限公司)、多巴胺 (DA, 阿拉丁試劑有限公司)、腎上腺素 (EP, 阿拉丁試劑有限公司)、特布他林 (TER, 阿拉丁試劑有限公司). 萊克多巴胺 (RAC) 和克倫特羅 (CLEN) 購自德國Ehrenstorfer GmbH實驗用水為雙蒸水, 且經濾膜(孔徑0.45 μm)過濾器過濾.

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(LC-20ATVP, 日本島津公司)、配有二極管陣列檢測器、用于萊克多巴胺、克侖特羅、腎上腺素、特布他林、多巴胺的分析. 陽極氧化鋁膜用帶注射器式過濾器的蠕動泵洗脫. 掃描電子顯微鏡(S-4300, 日本株式會社日立制作所)用于研究MIP納米管膜的形貌觀察.

1.3 色譜條件

色譜柱: Venusil HILIC 色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm); 流動相A: 0.1%(V/V)磷酸緩沖液; B: 甲醇; 流速: 0.6 mL/min; 梯度洗脫: 7 min內B的體積分數φB從20% 線性增加至67%, 隨后維持4 min, 最后調節φB恢復至20%. 波長: 223 nm (萊克多巴胺), 243 nm (克侖特羅、腎上腺素、特布他林、多巴胺).

1.4 AAO膜的表面修飾

AAO膜的修飾采用文獻[12]的方法. ATRP引發劑修飾的AAO膜的制備采用兩步法. 第一步是在厚度為140 μm, 帶有孔徑為200 nm的氧化鋁板修飾APTMOS. 在100 mL的圓底燒瓶中依次加入3 mL無水乙醇, 0.5 mL APTMOS, 待其充分混勻后再加入0.2 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0), 搖勻. 將多孔氧化鋁膜浸入上述溶液中, 并將此圓底燒瓶抽真空10 min, 以保證氧化鋁膜的納米孔洞完全浸潤在溶液中. 從溶液中取出氧化鋁膜, 在100 ℃下真空加熱反應2 h. 第二步是將大分子引發劑ATRP (2-溴代異丁酰溴) 接枝到硅烷化的AAO膜上, 作用于后續的分子印跡聚合物的聚合過程. 經充分干燥的三口燒瓶中加入4 mL無水二氯甲烷和160 μL無水三乙胺, 將經硅烷化的氧化鋁膜浸入該溶液中, 氮氣保護, 冰浴20 min. 在冰浴條件下, 不斷搖蕩, 將4 mL含100 μL 2-溴代異丁酰溴的無水二氯甲烷溶液緩慢地逐滴加入上述溶液體系中, 室溫下反應12 h. 將反應后的氧化鋁膜取出, 依次用二氯甲烷和丙酮清洗, 真空40 ℃下干燥備用.

1.5 AAO膜上萊克多巴胺MIP的制備

在AAO膜上利用原子轉移自由基聚合的方法合成萊克多巴胺MIP (AAO@MIP)(圖1). 由于萊克多巴胺在其他溶劑中溶解度較低, 因此聚合反應采用的溶劑為二甲基亞砜 (DMSO). 經過計算機軟件模擬和實驗條件優化, 功能單體以及交聯劑分別選擇MAA和EGDMA. 模板、功能單體和交聯劑的最佳物質的量之比是1∶6∶30. 混合溶液在室溫下攪拌2 h以形成印跡分子和功能單體復合體. 溶液經過通氮氣20 min除氧, 然后加入4 μmol PMDETA和2 μmol金屬有機催化劑CuBr, 將表面引發ATRP引發劑化的氧化鋁膜浸入上述溶液中, 在氮氣保護下70 ℃反應24 h. 將氧化鋁膜取出, 分別用甲醇-乙酸(體積比9∶1)和甲醇作洗脫劑沖洗氧化鋁膜的納米孔洞, 最后將氧化鋁膜60 ℃下真空干燥. 空白的AAO非印跡聚合物 (AAP@NIP) 的合成, 除了不加入模板萊克多巴胺之外，完全采用上述的方法合成.

圖1 基于ATRP在AAO膜表面接枝MIP的示意圖

Figure 1 Schematic of the grafting of MIP on AAO template via ATRP

1.6 吸附性能測試

為探究AAO@MIP納米管膜的吸附效果, 對其進行動態和靜態吸附實驗. 將AAO@MIP納米管膜置于循環洗脫系統中, 取10 mL不同濃度的萊克多巴胺甲醇試液, 在蠕動泵的作用下，在一定的時間內，在系統中對納米管膜進行洗脫. MIP納米管膜對萊克多巴胺的吸附量可以通過測定溶液中萊克多巴胺的剩余量測得. 吸附和競爭識別研究分別采用AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜在RAC、EP、CLEN、TER和DA的甲醇溶液 (500 μg/L) 中進行試驗.

1.7 樣品制備

豬肉樣品的制備參照文獻[7]的方法. 稱取豬肉樣品5.0 g, 絞碎, 分別加入 2.0 μg/g 和20 μg/g的RAC及其類似物標準物, 并向樣品中加入10 mL乙腈和1 mL 4 mol/L的碳酸鉀溶液, 使蛋白質變性. 劇烈震蕩5 min, 混合物在4 ℃下, 5 000 r/min離心20 min. 上層溶液與20 mL乙腈飽和正己烷溶液混合, 除去樣品中的脂肪. 震蕩5 min后, 乙腈層析出, 加入20 mL飽和NaCl溶液以防止發生乳化, 震蕩 2 min. 分離出乙腈相, 用Na2SO4干燥, 樣品殘渣用2 mL乙腈洗滌. 蒸干乙腈后, 用5 mL甲醇溶解并用AAO@MIP納米管膜萃取. 經過甲醇和乙酸混合液 (體積比9∶1) 解吸后, 用HPLC檢測, 分析樣品中RAC的含量.

2 結果與討論

2.1 氧化鋁膜和萊克多巴胺印跡納米管膜的表征

對比AAO與AAO@MIP的SEM圖(圖2)可知，空白的AAO膜表面光滑，而AAO@MIP膜網狀表面均勻包覆了一層MIP分子，結果表明，氧化鋁膜表面經過ATRP路線反應成功合成MIP納米管薄膜.

圖2 氧化鋁膜和萊克多巴胺分子印跡納米管膜的SEM圖

2.2 AAO@MIP膜對萊克多巴胺的吸附容量

萊克多巴胺AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜的吸附容量測試在萊克多巴胺的甲醇標準溶液中進行, 提取時間為50 min(圖3). 在100～800 μg/L的范圍內, 隨著多巴胺質量濃度的增大, 吸附量也增大, 并在ρ(DA)=800 μg/L時達到吸附平衡. AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜的吸附量分別為50.26 mg/g和6.89 mg/g, AAO@MIP的吸附量為AAO@NIP的7.3倍. 可見, AAO@MIP納米管膜相比AAO@NIP對于萊克多巴胺有更高的吸附容量.

圖3 AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜的吸附量

Figure 3 Extraction amounts for ractopamine of AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes

為了研究AAO@MIP的吸附平衡時間, 探討了AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜對RAC的平衡吸附量隨吸附時間的變化(圖4). 在40 min內, 對RAC的吸附量快速增加, 這是因為在AAO@MIP納米管膜的表面有大量對RAC有高度親和力的空穴, 使得RAC再吸附的位阻減小. 隨后, RAC逐漸填滿結合位點, 并逐漸在50 min后到達吸附平衡. 因此, 在后續實驗中選用50 min 的結合時間.

圖4 AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜對100 μg/L萊克多巴胺溶液的動態吸附曲線

Figure 4 Adsorption kinetic curves of AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes for ractopamine in solution of 100 μg/L

2.3 MIP納米管膜對萊克多巴胺的選擇性

MIP納米管膜的選擇性實驗采用EP、TER、CLEN和DA作為結構類似物(圖5), 并配成500 μg/L溶液進行實驗. AAO@MIP納米管膜對各種類似物的吸附量比AAO@NIP納米管膜的高(圖6), 說明了選取的類似物在結構上與RAC相似. 這一結果可以證明, AAO@MIP納米管膜的識別原理是基于模板分子的大小和結構的. 由于AAO@NIP納米管膜并沒有模板分子的特異性識別位點, 因此其吸附量明顯小于AAO@MIP納米管膜, 這一點在對于模板以及其他競爭分子的吸附沒有明顯的差異.

圖5 萊克多巴胺及其結構類似物的化學結構

Figure 5 Chemical structures of ractopamine and its structural analogues

圖6 AAO@MIP和AAO@NIP納米管膜對500 μg/L的RAC、TER、EP、CLEN 和DA吸附量

Figure 6 Absorption capacities of RAC, TER, EP, CLEN and DA with AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes at the concentration level of 500 μg/L

2.4 AAO@MIP納米管膜的重現性試驗

為測試AAO@MIP納米管膜的穩定性和復用性, 使用 100 μg/L 的萊克多巴胺溶液對其進行了5周期的再生(吸附/解吸)實驗. AAO@MIP納米管膜采用甲醇-乙酸洗脫液. 實驗測定數據相對標準偏差 (RSD) 為5.27%, 表示AAO@MIP納米管膜有良好的穩定性和復用性.

2.5 AAO@MIP與HPLC的聯用

2.5.1 分析方法的有效性 建立AAO@MIP納米管膜萃取與HPLC聯用檢測萊克多巴胺及其類似物的方法：萊克多巴胺用熒光檢測器檢測, 而克侖特羅、特布他林、腎上腺素和多巴胺則用紫外光檢測器檢測. 通過不斷降低加標樣品的質量濃度測定其峰高, 然后算出3倍信噪比, 可得該方法的檢出限. 經過優化，該分析方法的線性范圍、相關系數、檢出限、重現性見表1.

表1 AAO@MIP納米管膜萃取-HPLC聯用檢測RAC、CLEN、EP、TER、和DA的線性范圍、檢出限(LOD)、相關系數(R2)和相對標準偏差(RSD)

Table 1 Linear ranges, limits of detection (LOD), correlation coefficients (R2) and RSD of AAO@MIP nanotube membrane coupled with HPLC for the detection of RAC, CLEN, EP, TER and DA

化合物線性范圍/(μg·L-1)R2LOD/(μg·L-1)RSD/%RAC10～10000.99960.742.79CLEN100～10000.99971.403.49EP100～10000.99982.004.16TERDA200～1000100～10000.99790.99952.501.204.342.87

RAC的線性范圍是10～1 000 μg/L, CLEN、EP和DA的線性范圍為100～1 000 μg/L, TER的線性范圍是200～1 000 μg/L. 檢出限在0.74～2.50 μg/L. 相對標準偏差范圍是2.79%～4.34%. 上述數據表明這種新型的方法在對β2-腎上腺素受體激動劑的檢測中表現良好. 2.5.2 實際樣品的分析 為了驗證對于測定豬肉樣品中RAC殘留量的準確性, 往豬肉樣品中加入2.0 μg/g和20 μg/g兩個質量濃度梯度的RAC及其類似物的標準溶液. 在萃取之前, 豬肉樣品需經過乙腈飽和的正己烷和Na2SO4去除脂肪酸和水, 排除分子識別的干擾. 隨后, 分析物移入甲醇中, 并用AAO@MIP納米管膜萃取, 并用上述方法檢測分析.

AAO@MIP納米管膜對RAC及其類似物有相當高的選擇性(圖7)，曲線a為 200 μg/Lβ2-腎上腺素受體激動劑標準液和豬肉樣品提取液的混合液, 曲線b是經過AAO@MIPs膜萃取后再解吸的加標樣品液. 表2為豬肉樣品的加標結果,β2-腎上腺素受體激動劑在2個質量分數梯度下的加標回收率分別為86.32%～96.95%和87.84%～95.73%. 相對標準偏差范圍在2.67%～5.72%. 結果表明, 這種方法對于復雜樣品中β2-腎上腺素受體激動劑的檢測結果是準確可信的.

1：克倫特羅；2：特布他林；3：腎上腺素；4：萊克多巴胺

Figure 7 HPLC-UV Chromatograms of spiked sample solution at 223 nm

表2 豬肉樣品的β2-腎上腺素受體激動劑加標回收率平均值(n=3)

Table 2 Average recoveries of β2-agonists for spiked pork samples (n=3) %

3 結論

制備了一種新型的萊克多巴胺MIP納米管膜. 使用陽極氧化鋁膜作為分子印跡的微反應器的方法, 有效克服了傳統印跡的缺點, 如模板洗脫不完全、 吸附容量小、傳質效率低、材料形狀不規則. 這種方法通過增加材料表面結合位點的數量, 顯著提高了吸附容量和印跡材料的動力學. 在重復吸附實驗中, AAO@MIP表現出良好的識別性能和高吸附容量. 近來, 分子印跡技術已經應用于各種各樣的模板分子, 從分子量小的有機分子到多肽, 再到蛋白質, 因此, MIP納米管膜在實現化學分離和傳感具有廣闊前景.

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【中文責編：譚春林 英文審校：李海航】

Novel Molecularly Imprinted Polymer Nanotube Membranes for Ractopamine

CHEN Qi1, CHEN Xiaogang1, PAN Jiahui2, SHEN Guoquan2, ZHAO Liangliang2, LIANG Yong3*

(1. Foshan University, Foshan 528231, China; 2. Department of Chemistry and Textile, Foshan Supervision Testing Center of Quality and Metrology, Foshan 528225, China; 3. School of Chemical andEnvironment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

A method for the synthesis of ractopamine molecularly imprinted polymer (MIP) nanotube membranes using an anodic alumina oxide (AAO) template by surface-initiated atom transfer radical polymerization (ATRP) was presented. Methacrylic acid (MAA) was selected as functional monomer and the polymerization rate ofn(ractopamine)∶n(MAA) was 1∶6. The morphology of MIP nanotube membranes were characterized by scanning electron microscope (SEM). The SEM results showed that ATRP route works well in the formation of MIP nanotubes within AAO template. A series of adsorption experiments revealed that the MIP nanotube membranes showed better extraction capacity and good selectivity than that of non-imprinted polymer (NIP) nanotube membranes for ractopamine and its analogues. In order to evaluate the usability of the MIP nanotube membranes, a methodology by combining MIP nanotube membranes extraction coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) detection for the determination ofβ2-agonists in complex samples was developed. The linear ranges were 10～1 000 μg/L for ractopamine, 100～1 000 μg/L for clenbuterol, epinephrine and dopamine, and 200～1 000 μg/L for terbutaline. The detection limits were within the range of 0.74～2.50 μg/L. The proposed method is suitable for the determination of traceβ2-agonists in pork samples.

molecularly imprinted polymer; anodic alumina oxide template; atom transfer radical polymerization;β2-agonists

2016-02-21 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

廣東省自然科學基金項目(2014A030307008)；佛山市禪城區產學研專項資金項目(20141072018)

O652

A

1000-5463(2017)04-0039-06

*通訊作者:梁勇, 教授, Email: liangy@scnu.edu.cn.