不同菌種發酵乳品質與抗氧化能力研究

賈亞婷，郭艷梅，蔡逸安，李昕悅，趙玉明，馬玲

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

不同菌種發酵乳品質與抗氧化能力研究

賈亞婷1，郭艷梅1，蔡逸安1，李昕悅1，趙玉明2，馬玲1

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

研究了由不同菌種制作的酸奶發酵乳在冷藏期21 d內品質、抗氧化活性的變化，研制具有高抗氧化活性的發酵乳。通過對比傳統發酵乳與兩種益生菌發酵乳貯藏期的pH值、滴定酸度、黏度、持水力、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原能力等指標，研究益生菌對發酵乳品質和抗氧化活性的影響。結果表明，益生菌發酵乳在維持酸奶品質、延長市場貨架期方面優于傳統發酵乳，在冷藏期21 d內三種菌種發酵乳DPPH自由基清除能力和還原能力均有明顯的增加（P＜0.05），動物雙歧桿菌BB-12發酵乳A700nm最高達0.481±0.06。在冷藏期1～7 d益生菌發酵乳ABTS自由基清除能力明顯高于傳統發酵乳。

發酵乳；菌種；冷藏；品質；抗氧化活性

Abstract:In order to develop yoghurt with higher antioxidant activity,the properties and antioxidant changes of yoghurts made with differ?ent starter strains in 21 days cold(4℃)storage periods were determined,Indexes of pH,acidity,viscosity,water-holding power,ABTS free radical scavenging ability,DPPH free radical scavenging rate and total reducing power were investigated for both the traditional fermented milk and two kinds of probiotic fermented milk during cold(4℃)storage.The results showed that the probiotic fermented milk in mainting the yogurt quality,extend the shelf life of the products was better than the traditional fermented milk,all samples for DPPH radical scaveng?ing ability and reducing power has increased significantly during the 21 d cold storage(P＜0.05),the reduce power for BB-12 fermented milk as higher as up to 0.481± 0.06.the ABTS free radical scavenging ability for probiotic fermented milk was significantly higher than the tradi?tional fermented milk in 1～7 d cold storage.

Key words:yoghurt;strains;cold storage;quality;antioxidant activity

0 引言

乳酸菌作為一種天然的抗氧化劑，具有抗癌、降低膽固醇、治療各種胃腸道疾病及增強免疫力等的作用[1]，同時乳酸菌介導的發酵可以提高食品的風味和營養價值。因此，發酵乳添加益生菌后可以將菌種的保健作用與發酵乳的健康功效完美結合起來。

目前相關方面也有一些研究，張睿[2]等的研究結果表明在貯藏期21 d內，添加干酪乳桿菌與植物乳桿菌的益生菌發酵乳在硬度、稠度、黏度與凝聚性上與傳統發酵乳相比均有所增加。趙志文[3]等研究了單一及組合乳酸菌發酵乳對體外抑菌、抗氧化和降膽固醇等功能的影響，結果表明混合乳酸菌清除超氧陰離子的能力強于各組單菌株發酵乳。本研究將比較分別由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1∶1組成的混合發酵劑、動物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14制備的發酵乳在冷藏期21 d內的品質及抗氧化活性，為進一步開發新型高抗氧化活性發酵乳提供導向和理論依據。

1 實 驗

1.1 材料試劑

生鮮牛乳，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等菌種（山西農業大學食品科學與工程學院畜產品加工實驗室保存），蔗糖(市售)，2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS,1,1-二苯基-2-苦肼基（自由基）DPPH，TCI原裝；其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，HPP-9272電熱恒溫培養箱，0～4℃冰箱，ST2100pH計，NDJ-1指針式黏度計，FA2004電子分析天平，LD5-2B低速離心機，7200型分光光度計，XH-C漩渦振蕩器，恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將生鮮牛乳滅菌，冷卻至室溫后，分裝至滅菌后的試管中，然后分別接種保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、動物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14凍干粉，置于恒溫培養箱中進行凝乳培養，反復傳代，直到符合生產發酵劑要求。

1.3.2 發酵乳的加工工藝流程

原料奶→均質→加糖→殺菌→冷卻→接種→發酵→冷藏→后熟

接種3%由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌按1∶1組成的混合發酵劑制作的發酵乳記為LB+ST，接種3%動物雙歧桿菌BB-12發酵劑制作的發酵乳記為BB12，接種3%嗜酸乳桿菌LA-14發酵劑制作的發酵乳記為LA14。

pH值直接用ST2100pH計測定；黏度采用NDJ-1指針式黏度計測定。

1.3.3 酸度的測定[4]

取10 g發酵乳于三角瓶中，加入20 mL蒸餾水，滴入2～3滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定，不斷輕微搖動，直至微紅色在30 s內不消失為止。樣品的酸度按下面公式計算：

式中：c為標準氫氧化鈉的濃度（mol/L）；V為滴定所消耗標準氫氧化鈉的體積（mol/L）；m為樣品質量（g）；0.1為酸度理論定義NaOH的摩爾濃度（mol/L）。

1.3.4 發酵乳持水力的測定[5]

準確稱量一定質量樣品于離心管中，轉速為4 000 r/min離心10 min后，去除上清液后稱重。樣品的保水性按下式計算：

式中:m1為離心前所稱取樣品質量（g）；m2為離心后去掉上清液樣品質量（g）。

1.3.5 發酵乳抗氧化性的測定

樣品處理：將待測發酵乳與蒸餾水以體積比1:2的比例混勻配置成樣品溶液，按照如下方法分別測定三項抗氧化指標。

（1）ABTS自由基清除能力

參考Linghong Liang[6]等的方法并略作改動。將濃度為7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀混勻在室溫避光條件下放置12～16 h，形成ABTS儲備液。ABTS儲備液用磷酸鹽緩沖溶液PBS（0.1 mol/L,pH=7.4）稀釋使其在734 nm波長處吸光值為0.70±0.02。吸取0.5 mL待測樣品于反應試管中，然后加入5 mL的ABTS稀釋液，用漩渦振蕩器充分混勻，暗處反應6 min,于734 nm波長處測反應液吸光值。

式中：AS為樣品吸光值；AC為對照組吸光值，即用同體積PBS代替ABTS稀釋液；Ab為樣品空白組吸光值。

（2）DPPH自由基清除能力

參考Linghong Liang[6]等的方法并略作改動。將1 mL待測樣品與5 mL 0.1 mmol/L DPPH混合均勻，室溫下放置暗處反應30 min，在517 nm波長處測其吸光值。

式中：AS為樣品吸光值；AC為對照組吸光值，即用同體積無水乙醇代替DPPH；Ab為樣品空白組吸光值。

（3）總還原能力的測定

[7-8]中的方法并略作改動。將1 mL待測樣品與2 mL磷酸鹽緩沖溶液PBS（濃度0.2 mol/L，pH=6.6），2 mL質量濃度為10 g/L鐵氰化鉀混合后放于50℃恒溫水浴中20 min。反應后加入2 mL質量濃度為100 g/L的TCA混勻后離心（4 000 r/min,10 min），取上清液4 mL加入0.5 mL質量濃度為1 g/L的FeCl3.混合液放置室溫反應至溶液澄清后在600 nm處測吸光值。吸光值越大，表明抗氧化能力越大。

2 結果與分析

2.1 發酵乳的貯藏特性研究

2.1.1 冷藏期間產酸能力的測定結果

圖1為傳統乳酸菌LB+ST、動物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14發酵乳冷藏期酸度的變化趨勢；圖2為冷藏期21 d pH值的變化趨勢。

圖1 不同菌種發酵乳冷藏期滴定酸度的變化趨勢

圖2 不同菌種發酵乳冷藏期pH的變化趨勢

由圖1和圖2可以看出，不同菌種產酸能力差異較大。在發酵初期（即冷藏1～7 d），LB+ST，BB12，LA14滴定酸度均明顯增加，且pH值的變化趨勢正好相反，這是由于在冷藏初期，菌種具有較強的代謝乳糖從而產酸的能力，酸度增加幅度較大。隨著冷藏期的延長，滴定酸度增加趨勢和pH下降趨勢均逐漸平緩，這可能是酸性物質增加抑制菌種的代謝產酸所致。酸度是衡量酸奶保質期的一個重要指標，由圖1可以看出，在冷藏1～7 d，傳統發酵乳酸度由67.5°T上升到98.5°T，變化幅度為31.0°T，而BB12和LA14分別由56.7°T上升到77.0°T、56.8°T上升到78.0°T，變化幅度分別為20.3°T和21.2°T。即在相同的冷藏條件下，動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌發酵乳的產酸速度均低于傳統發酵乳，后酸化程度弱，這樣較好的保存了酸乳特征口味的穩定，有利于延長酸乳市場貨架期。

2.1.2 冷藏期間黏度、持水力的測定結果

由圖3可以看出，在21 d冷藏期間LB+ST、BB12、LA14的黏度變化趨勢均是先增大后減小。LA14黏度在冷藏第7 d達到最大值，之后下降，LB+ST和BB12黏度在冷藏第14天達到最大值后緩慢下降。在冷藏期21 d內，與LB+ST、LA14比較，BB12發酵乳黏度變化較為緩慢，這可能與菌種的穩定性及自身代謝有關[9]。圖4為LB+ST，BB12，LA14冷藏期持水力的變化趨勢。

圖3 不同菌種發酵乳冷藏期黏度的變化趨勢

圖4 不同菌種發酵乳冷藏期持水力的變化趨勢

由圖4可以看出，在冷藏期21 d內，三種菌種持水力均呈現下降趨勢。這可能是因為在發酵乳冷藏期間菌種不斷代謝需要水的參與[10]，也可能與發酵乳冷藏過程中較低的pH值環境破壞了凝膠體的結構有關。BB12和LA14持水力均呈現先增大后減小的趨勢。BB12在冷藏1～7 d內持水力不斷增加，第7 d時達最大值61.80%，隨后持水力下降，在冷藏第21 d時達最小值47.84%。LA14在冷藏1～7 d內持水力由56.50%上升至66.90%，之后不斷下降，第21天時持水力達最小值50.69%。傳統乳酸菌發酵乳在冷藏期21 d內持水力下降不明顯。BB12和LA14在冷藏1～14 d內持水力均大于傳統乳酸菌發酵乳，因此從持水力的角度來看，在一定保質期內，益生菌發酵乳品質優于傳統發酵乳。

2.2 發酵乳的抗氧化性活性測定結果

2.2.1 ABTS自由基清除能力的測定結果

ABTS法目前已被廣泛的應用于抗氧化劑的體外抗氧化活性測定。在反應體系中，ABTS經氧化后生成相對穩定的藍綠色的水溶性自由基ABTS+，抗氧化劑與ABTS+反應后使反應體系褪色，體系褪色越明顯表示被測物質的抗氧化性活性越強。在ABTS自由基的特征吸收波長下（734 nm）檢測吸光度的變化，能反應抗氧化劑清除ABTS自由基活性的高低[11]。

由表1可知，LB+ST在冷藏期21 d內，ABTS自由基清除率的變化范圍為（52.84%±0.17%）～（85.98%±0.30%），抗氧化活性有明顯的增加（P＜0.05）；發酵乳BB12在冷藏期21d內，ABTS自由基清除率的變化范圍為（70.15%±0.11%）～（96.17%±0.16%），抗氧化活性有明顯的增加（P＜0.05）；發酵乳LA14在冷藏期21d內，抗氧化活性無顯著變化（P＞0.05）。由表1可知，在冷藏期第1 d和第7 d時，動物雙歧桿菌BB-12和嗜酸乳桿菌LA-14發酵乳均具有較強的ABTS自由基清除能力，與傳統菌種酸乳LB+ST相比差異顯著（P＜0.05）。

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定結果

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在乙醇溶液中形成一種紫紅色的穩定的自由基，且在特征吸收波長下（734 nm）具有典型的吸收峰。當體系中存在抗氧化劑時，抗氧化劑提供氫電子和原子給DPPH自由基，使其生成無色產物，導致溶液的特征吸收峰值下降，吸光值變小。在此反應中，在734 nm下檢測反應體系吸光值的變化，能反應被檢測物質抗氧化能力的強弱[12]。

由表1可以看出，在冷藏期1～21 d內發酵乳的DPPH自由基清除能力均有明顯的增加（P＜0.05），LB+ST、BB12、LA14發酵乳的增加趨勢幾乎一致。LB+ST在冷藏期第7 d時DPPH自由基清除率有明顯的增加（P＜0.05），在第21 d時達到最大值84.24%±0.14%；BB12在冷藏期第1～14 d內變化范圍為（61.11±0.25）～（97.26±0.18），抗氧化活性明顯增加（P＜0.05）；LA14在冷藏期第21 d達到最大值82.14±0.30，抗氧化活性明顯增加（P＜0.05）。在同一冷藏期三種不同菌種的清除DPPH能力無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.3 還原能力的測定結果

抗氧化劑的還原能力與抗氧化活性成正相關。根據還原力的測定方法，A700nm越大，則抗氧化劑的還原能力越強，即抗氧化活性越強[13]。由表1可以看出，無論傳統發酵乳還是益生菌發酵乳，還原能力隨著冷藏期的延長均呈增強的趨勢。在冷藏期第14天和第21 d時，發酵乳BB12的還原力明顯高于LB+ST和LA14（P＜0.05），其A700nm最高達0.481±0.06。

表1 發酵乳冷藏期抗氧化活性測定結果

唐雪梅[14]研究了干酪乳桿菌胞外多糖的抗氧化性能，結果表明隨著干酪乳桿菌胞外多糖濃度的增大，對DPPH自由基的清除率也增大。T.Amatayakul等[15]的研究由牛奶添加不同比例酪蛋白和乳清蛋白制作的酸奶在4℃冷藏21 d內的胞外多糖濃度變化，發現在冷藏期21 d內胞外多糖的濃度均有所增加。王曦等[11]對35株乳酸菌的菌體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行研究，結果表明抗氧化活性物質較多分布在胞外分泌物中。本研究結果表明三種不同菌種發酵乳在21 d冷藏期抗氧化活性均增強。由此推測引起發酵乳中起抗氧化作用的物質主要是胞外多糖，其具體作用機制還需要進一步研究闡明。Vaya Chouchouli等[16]以DPPH自由基清除率和還原能力為指標，研究乳酸菌發酵乳在冷藏32 d內的抗氧化活性，結果表明隨著貯藏期的延長DPPH自由基清除率降低，而還原能力在貯藏1～21 d時先增加后降低。與本研究存在差異，推測原因可能是發酵乳制作工藝的不同及菌種配比不同。

3 結論

（1）本研究主要研究了不同菌種發酵乳在4℃冷藏21 d的pH值、酸度、粘度與持水力的變化。結果表明傳統發酵乳和益生菌發酵乳的酸度隨冷藏期的延長均增加，而pH值、黏度與持水力均降低，發現益生菌發酵乳的后酸化程度較傳統發酵乳弱，黏度、持水力變化程度弱（P＜0.05），其在維持酸奶品質、延長市場貨架期方面優于傳統發酵乳。

（2）以ABTS自由基清除率為指標測定時，在4℃冷藏第1天和第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST，在第21 d BB12的自由基清除率大于LB+ST和LA14；從DPPH自由基清除率的結果來看，在冷藏第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST；還原力的測定結果可以看出，在冷藏第1天BB12和LA14的抗氧化活性大于LB+ST，在冷藏第14 d和第21 d時BB12的抗氧化活性大于LB+ST和LA14（P＜0.05）。綜合以上三個測定指標，益生菌發酵乳的抗氧化活性在一定的貯藏期內強于傳統發酵乳，具有較好的市場前景，也為進一步開發新型高抗氧化活性發酵乳提供了依據。

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Research of quality and antioxidant capacity for fermented milk with different strains

JIA Yating1，GUO Yanmei1，CAI Yian1，LI Xinyue1，ZHAO Yuming2,MA Ling1
（1.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2.Biology Institute of Shanxi,Taiyuan 030006,China）

TS252.54

A

1001-2230（2017）09-0022-04

2017-02-28

山西省大學生科技創新項目（201610113045）；山西省重點研發計劃重點項目（201603D21108-02）。

賈亞婷（1995-），女，本科，研究方向為食品質量與安全。

馬玲