設計空間法研究龍血竭酚類提取物的精制工藝

張建 張欣 畢宇安 徐桂紅 黃文哲 王振中 蕭偉

[摘要]運用質量源于設計（QbD）理念，采用“設計空間”方法優化龍血竭酚類提取物的精制工藝。首先將龍血素B、7，4′二羥基黃酮含量及其轉移率、總干膏收率等5個指標做為關鍵質量屬性（CQA），采用PlackettBurman設計實驗，發現關鍵工藝參數（CPP）為堿濃度、堿倍量和堿溶溫度。再采用BoxBehnken設計建立CQA和CPP間的數學模型，方差分析顯示模型P均小于005，失擬值均大于005，可以較好的描述CQA和CPP之間的關系。設定龍血素B、7，4′二羥基黃酮含量及其轉移率、總干膏收率5個指標的控制限度，通過Monte Carlo仿真法計算獲得基于概率的設計空間并驗證。結果表明，優化后的純化方法能夠保證龍血竭酚類提取物精制工藝穩定，有助于提高酚類提取物批次間質量均一性，為生產自動化控制提供數據支撐。

[關鍵詞]龍血竭酚類提取物； 精制工藝； 關鍵工藝參數； 關鍵質量屬性； 設計空間

Studying on purification technology of Resina Draconis phenol

extracts based on design space method

ZHANG Jian1，3， ZHANG Xin2，3， BI Yuan2，3， XU Guihong2，3， HUANG Wenzhe2，3， WANG Zhenzhong2，3， XIAO Wei1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process Newtech for Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]The "design space" method was used to optimize the purification process of Resina Draconis phenol extracts by using the concept of "quality derived from design" （QbD） The content and transfer rate of laurin B and 7，4'dihydroxyflavone and yield of extract were selected as the critical quality attributes （CQA） PlackettBurman design showed that the critical process parameters （CPP） were concentration of alkali， the amount of alkali and the temperature of alkali dissolution Then the BoxBehnken design was used to establish the mathematical model between CQA and CPP The variance analysis results showed that the P values of the five models were less than 005 and the mismatch values were all greater than 005， indicating that the model could well describe the relationship between CQA and CPP Finally， the control limits of the above 5 indicators （content and transfer rate of laurine B and 7，4'dihydroxyflavone， as well as the extract yield） were set， and then the probabilitybased design space was calculated by Monte Carlo simulation and verified The results of the design space validation showed that the optimized purification method can ensure the stability of the Resina Draconis phenol extracts refining process， which would help to improve the quality uniformity between batches of phenol extracts and provide data support for production automation control

[Key words]Resina Draconis phenol extracts； refining process； critical process parameters； critical quality attributes； design space

龍血竭酚類提取物為中藥5類新藥龍血通絡膠囊的原料藥，具有活血化瘀通絡之功效，可用于中風病經絡（輕中度腦梗死）恢復期血瘀證。其有效部位總酚主要包括查耳酮類、黃酮類、黃烷類、色原酮類、茋類及簡單酚類[1]，具有抗炎、鎮痛、活血、止血、抗細菌、真菌、改變血液流變學等藥理作用，其中7，4′二羥基黃酮、龍血素B具有抗血栓、抗血瘀、抗凝血、鎮痛多重功效[2]。endprint

由于龍血竭酚類提取物中酚類化合物與雜質間溶解度和pKa等性質接近，總酚和雜質組分復雜（已指認出18種化合物[3]），對其溶解度的影響因素多且存在交互作用，難以通過單因素等簡單實驗或者正交試驗獲得所有參數的合理范圍，所以其精制工藝一直是工業生產控制的難點。

目前，質量源于設計（QbD）的理念正推動中藥制劑生產模式的轉變[4]，認為只有應用“正確”的過程才能生產出“優質”的產品[5]。在ICH Q8中，設計空間被定義為：可以確保產品質量的輸入變量（例如原材料屬性）和工藝參數之間的多維結合與相互作用。在設計空間之內的操作不稱為工藝變更，設計空間之外的操作則視為工藝變更[6]。

QbD理念采用的設計空間法能夠提供穩健生產的工藝參數范圍，確保產品質量的一致性，目前已用于水提、醇沉、水沉和柱色譜等工藝的參數優化[711]。本文以龍血竭酚類提取物為研究對象，運用QbD理念優化龍血竭酚類提取物精制工藝，建立關鍵工藝參數和關鍵質量屬性間的數學模型，通過Monte Carlo仿真法計算獲得基于概率的設計空間并進行驗證。

1材料

Ultimate 3000高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器（德國Thermo Fisher公司）；Mettler XP6電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Mettler AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Sartorius BSA 224SCW型電子分析天平（德國Sartorius公司）；MilliQ Academic純水機（美國Millipore公司）；H1659臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；K250DB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

龍血素B（批號111558201407，供含量測定用）、7，4′二羥基黃酮（批號111787201002，供含量測定用）對照品購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈（色譜純，美國天地公司）、甲酸（色譜純，ROE Scientific公司）、氫氧化鈉（南京化學試劑股份有限公司）、無水乙醇（南京化學試劑股份有限公司）、鹽酸（南京化學試劑股份有限公司）、水為超純水，其余試劑均為分析純。

龍血竭干膏由龍血竭提取、濃縮、干燥制得（江蘇康緣藥業股份有限公司）。

2方法

21龍血竭酚類提取物精制工藝

取龍血竭干膏20 g，加入一定濃度氫氧化鈉溶液中攪拌溶解，濾液用稀鹽酸調pH，沉淀干燥，粉碎，即得。

22分析方法及方法學驗證

221混合對照品溶液的制備取7，4′二羥基黃酮、龍血素B對照品適量，精密稱定，加80%乙醇配制成質量濃度分別為3884，5088 mg·L-1的混合對照品溶液，即得。

222供試品溶液的制備取龍血竭酚類提取物，混勻，研細，取約05 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入80%乙醇適量，超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，即得。

223色譜條件Kromasil 1005 C18色譜柱（46 mm×250 mm， 5 μm），流動相乙腈（B）01%甲酸水（C）溶液，梯度洗脫（0～30 min，22%～40% B；30～60 min，40%～48% B），體積流量10 mL·min-1，檢測波長280 nm（龍血素B定量測定）和325 nm（7，4′二羥基黃酮定量測定），柱溫35 ℃，進樣量10 μL[1213]?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻返腍PLC圖見圖1。

224標準曲線和線性范圍考察精密稱取龍血素B 302 mg，7，4′二羥基黃酮297 mg，以80%乙醇溶解并定容至5 mL量瓶，作為標準曲線的最高濃度，逐倍稀釋至標準曲線各濃度溶液。以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制回歸曲線，計算回歸方程、相關系數和線性范圍。

225加樣回收率樣品制備方法取同一供試品，研細，取約025 g，精密稱定，共稱取6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（各指標成分質量濃度分別為7，4′二羥基黃酮405 mg·L-1、龍血素B 496 mg·L-1）5 mL，加入80%乙醇適量，

232回歸模型的建立根據PlackettBurman實驗篩選出的關鍵工藝參數，采用BoxBehnken設計研究建立龍血竭酚類提取物精制過程的關鍵工藝參數和關鍵質量屬性之間的數學模型。各因素和相應水平見表3，具體條件見表4，試驗設計由DesignExpert 80（美國StatEase公司）完成。

3結果與討論

31酚類提取物含量測定分析方法學驗證

根據本研究樣品的實際含量，對文獻[13]方法進行方法學驗證，標準曲線結果分別為龍血素B：Y=9559X-5048，r=0999 9，線性范圍1890～6047 mg·L-1；7，4′二羥基黃酮：Y=18679X+4873，r=0999 7，線性范圍1859～5948 mg·L-1。加樣回收率結果為龍血素B、7，4′二羥基黃酮平均回收率分別為9967%，1009%，RSD均小于26%，證明該分析方法準確、可靠，可用于本研究中酚類化合物含量測定。

32關鍵工藝參數的篩選

關鍵工藝參數篩選見表2。首先對關鍵質量屬性（Y1～Y5）進行標準化處理[1416]，然后通過多元線性回歸建立工藝參數和指標之間的定量模型，見公式（1）。

Y=a0+∑5i=1axiXi（1）

其中a0為常數項，Xi為工藝參數，ai為參數Xi對指標Y的偏回歸系數。然后將各偏回歸系數的絕對值加權求和。多元線性回歸計算由DesignExpert 80（美國StatEase公司）完成。各指標相應的偏回歸系數及決定系數見表5。結果顯示5個模型的R2在0864～0956，表明各個模型均能較好的描述工藝參數對指標成分的影響。endprint

為了簡化計算，假設所有指標成分的重要性相同，在計算各工藝參數偏回歸系數的絕對值之和時，將所有指標模型中的偏回歸系數權重均設為1，即表5中偏回歸系數絕對值大小表征各個工藝參數對每個指標成分的影響。其中偏回歸系數絕對值之和排列順序為：堿溶溫度>堿倍量>堿濃度>pH>酸沉溫度，由此可知堿溶溫度、堿倍量和堿濃度是龍血竭酚類提取物精制過程的關鍵工藝參數。

33回歸模型的分析

331模型的建立及分析關鍵工藝參數與關鍵質量屬性之間的數學模型采用下式計算，見公式（2）。

y=b0+∑3i=1biXi+∑3i=1bjX2j+∑2i=1∑3j=i+1bijXiXj（2）

其中，b0為常數項，bi，bj，bij為偏回歸系數。采用逐步回歸法簡化方程，模型移入或移除特定項的P設定為010。逐步回歸采用DesignExpert 80（美國StatEase公司）計算。BoxBehnken結果見表4，采用二次多項式模型對CQA（Y1， Y2， Y3， Y4， Y5）及相應的CPP（A， B， C）分別進行擬合，模型的偏回歸系數、R2和P結果見表6。

5個模型的擬合決定系數R2均大于093，說明模型能解釋大部分變異，響應值的實際值與預測值之間具有較好的擬合度，具有很好的預測能力。方差分析結果顯示P均小于005，模型具有顯著性；失擬值均大于005，實驗誤差不顯著，說明模型對實驗擬合的情況較好，各因素與響應值之間的關系可以用此模型函數化。

方差結果分析以Y2（7，4′二羥基黃酮含量）、Y5（干膏收率）為例，見表7，8。A， B和C對Y2和Y5有顯著影響，其中Y2在回歸分析時AB， AC， BC的P均小于005，說明A， B， C之間存在交互作用。

332響應面分析以Y2（7，4′二羥基黃酮含量）、Y5（干膏收率）為例來說明指標成分的含量、干膏收率隨堿濃度、堿倍量、堿溶溫度變化而呈現的規律。

7，4′二羥基黃酮含量等高線圖見圖2，結果表明堿濃度越低，堿倍量越低，堿溶溫度越低，7，4′二羥基黃酮含量就越高。

干膏收率的等高線圖見圖3，結果表明堿濃度越高，堿倍量越高，堿溶溫度越低堿溶酸沉后干膏收率就越高。

34設計空間的確立及驗證

采用模擬重復試驗結果的 Monte Carlo法計算設計空間，由MODDE軟件（Umetrics公司）自編程序進行計算。根據產品質量要求設定5個指標下限值，計算出設計空間。關鍵質量屬性可接受范圍及達標概率，見表9，運用Monte Carlo法計算獲得基于概率的設計空間，見圖4。

堿溶溫度在55～60 ℃下設計空間形狀大致相同，所以只展示55 ℃的設計空間；圖4中顏色由綠至紅的漸變表示響應值失敗概率由05%逐漸增大。為了驗證設計空間的準確性，在設計空間內外各選3個點進行驗證，6個點分別表示為V1，V2，V3，V4，V5，V6，結果見表10。從驗證結果可知，預測值和實際值接近，模型預測性好，因此在設計空間內操作可以保證工藝的穩健性。

4結論

本文為解決龍血竭酚類提取物中酚類成分的純化工藝問題，運用質量源于設計（QbD）理念，采用“設計空間”方法優化龍血竭酚類提取物精制工藝。利用PlackettBurman設計和偏回歸系數法，研究發現堿濃度、堿倍量、堿溶溫度為關鍵工藝參數；再采用BoxBehnken設計和逐步回歸法，建立了CQA和CPP的數學模型；最后運用Monte Carlo法計算出龍血竭酚類提取物精制工藝的設計空間，并通過了實驗驗證。

酚類化合物由于結構差異，擁有不同的pKa，因此在不同pH溶液中，具有不同的溶解度。龍血竭酚類提取物精制即是通過有效成分與雜質溶解度的差異實現對龍血竭總酚的純化。本文通過尋找關鍵工藝參數、建立CQA和CPP間關系的數學模型、建立設計空間的方法有效地解決了這個問題，找到合適的設計空間，提高了工藝過程的穩健性和靈活性，為探索酚類化合物的純化工藝提供了有益的參考。優化后的純化方法能夠保證龍血竭酚類提取物精制工藝穩定，有助于提高批次間質量均一性，為生產自動化控制提供數據支撐。

[參考文獻]

[1]劉芳， 戴榮繼， 鄧玉林， 等. 龍血竭化學成分研究進展[J]. 中國藥房， 2010， 21（15）：1437.

[2]何書平 血竭的藥理研究[J]. 中國藥房， 2008， 19（254）：1912.

[3]秦建平， 李家春， 吳建雄，等. 基于UPLC結合化學計量學方法的龍血竭指紋圖譜研究[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（6）：1114.

[4]徐冰， 史新元， 吳志生，等. 論中藥質量源于設計[J]. 中國中藥雜志， 2017， 42（6）：1015.

[5]陳彬華， 文彬 QbD理念在藥品研發、生產、質量控制過程中的應用[J]. 上海醫藥， 2008， 9（10）：446.

[6]徐冰， 史新元， 喬延江，等. 中藥制劑生產工藝設計空間的建立[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（6）：924.

[7]Gong X， Li Y， Chen H， et al. Design space development for the extraction process of Danhong injection using a Monte Carlo simulation method[J]. PLoS ONE， 2015， 10（5）：e0128236.

[8]Gong X， Zhang Y， Pan J， et al. Optimization of the ethanol recycling reflux extraction process for saponins using a design space approach[J]. PLoS ONE， 2014， 9（12）：e114300.

[9]魏海龍， 賀亮， 甘慶軍，等. 茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離參數優化[J]. 浙江林業科技， 2011， 31（2）：1.

[10]郝吉福， 王建筑， 郭豐廣，等. 基于BoxBehnken實驗優化龍血竭固體脂質納米粒的制備[J]. 中成藥， 2011， 33（10）：1713.

[11]許之麟， 黃文華， 龔行楚，等. 設計空間法優化黨參一次醇沉工藝[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（22）：4411.

[12]秦建平， 吳建雄， 李家春， 等. 不同產地龍血竭中5種成分的HPLC法測定[J]. 現代藥物與臨床， 2013， 28（4）：547.

[13]秦建平， 林夏， 潘有智，等. 基于指紋圖譜分析和多成分同時定量的龍血通絡膠囊質量評價研究[J]. 中草藥， 2015， 46（20）：3028.

[14]沈金晶， 龔行楚， 潘堅揚，等. 基于質量源于設計理念的金銀花水提液石灰乳沉淀工藝優化研究[J]. 中國中藥雜志， 2017， 42（6）：1074.

[15]嚴斌俊， 郭正泰， 瞿海斌，等. 丹紅注射液醇沉關鍵工藝參數篩選方法[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（11）：1672.

[16]劉爽悅， 沈金晶， 李文龍，等. 3種關鍵工藝參數辨識方法的比較研究[J]. 中草藥， 2016， 47（18）：3193.

[責任編輯孔晶晶]endprint