艾葉揮發油誘導白念珠菌凋亡

施高翔 汪天明 吳生兵 汪云霞 邵菁 周美啟 汪長中

[摘要]研究艾葉揮發油（Artemisia argyi essential oil，AAEO）誘導白念珠菌凋亡的活性。實驗采用微量液基稀釋法檢測AAEO對白念珠菌（Candida albicans）SC5314的MIC；采用XTT還原法檢測AAEO對白念珠菌SC5314代謝的影響；采用流式細胞儀檢測AAEO對白念珠菌SC5314細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平的影響；采用AnnexinV/PI法測定AAEO對白念珠菌SC5314細胞凋亡率的影響；采用熒光顯微鏡觀察AAEO對白念珠菌SC5314細胞Caspase酶活性的影響；采用DAPI染色法觀察AAEO對白念珠菌SC5314細胞核固縮的影響。結果顯示，AAEO對白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1；XTT代謝活性顯示AAEO對白念珠菌SC5314代謝呈劑量依賴性的抑制；>05 mL·L-1的AAEO干預后，白念珠菌SC5314細胞內活性氧水平顯著升高、線粒體膜電位顯著降低、凋亡比例明顯增加、metacaspase活性顯著升高、細胞核固縮。AAEO具有誘導白念珠菌細胞凋亡的活性，該作用可能與ROS積累和線粒體損傷相關。

[關鍵詞]艾葉揮發油； 白念珠菌； 凋亡； 活性氧； 線粒體

Activity of essential oil extracted from Artemisia argyi in inducing

apoptosis of Candida albicans

SHI Gaoxiang1，2， WANG Tianming1，2， WU Shengbing4， WANG Yunxia1，2，

SHAO Jing1，2， ZHOU Meiqi3*， WANG Changzhong1，2*

（1. School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

2. Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

3. Division of Science and Technology， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

4. Experimental Center of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract]To explore the activity of essential oil extracted from Artemisia argyi （AAEO） in inducing the apoptosis of Candida albicans SC5314. The effect of AAEO on reactive oxygen species（ROS） and mitochondria membrane potential（MMP） of C. albicans SC5314 was detected by flow cytometry. Phosphatidylserine externalization was observed under fluorescence microscopic with AnnexinV/PI staining at the early stage of apoptosis in C. albicans. Metacaspase activity was observed under fluorescence microscopic with FITCVADFMK staining at the early stage of apoptosis in C. albicans. C. albicans morphology was observed by DAPI nuclear staining and fluorescence microscopy. After intervention with 0.5 mL·L-1 AAEO， apoptosis of C. albicans significantly increased， metacaspase activity increased， nuclear pyknosis and fragmentation， and intracellular ROS were significantly increased， and mitochondrial membrane potential decreased significantly. The certain concentrations of AAEO could induce the apoptosis of C. albicans.

[Key words]Artemisia argyi essential oil； Candida albicans； apoptosis； ROS； mitochondrial

臨床上，皮膚發生病毒、細菌或真菌等病原體感染時，除了常規的全身或局部用藥外，艾灸往往也能產生顯著療效[12]。艾灸具有藥物作用、溫熱作用與近紅外輻射作用三大作用機制，其中藥物作用與其含有的揮發油密切相關[3]。課題組前期研究表明，艾葉揮發油（Artemisia argyi essential oil，AAEO）對臨床常見皮膚致病性真菌尤其是白念珠菌具有較強的抗菌活性[4]，但其作用機制不詳。有研究表明，植物揮發油可以通過誘導真菌凋亡而發揮其抗菌作用[5]，本實驗著重探討艾葉揮發油是否能通過凋亡方式發揮抗白念珠菌活性。endprint

1材料

11菌株和試劑 白念珠菌（Candida albicans， C albicans）SC5314由第二軍醫大學藥學院姜遠英教授惠贈；艾葉購于安徽中醫藥大學第一附屬醫院并經鑒定；氟康唑（Fluconazole，FLC，Mr 30627，中國食品藥品檢定研究院，批號100314）；兩性霉素B（Amphotericin B，AmB，Mr 92408，Sigma A9528）；RPMI1640培養基（美國Gibco公司）；XTT[2， 3bis （2methoxy4nitro5sulfophenyl）2Htetrazolium5carboxanilide]（加拿大BBI公司）；維生素 K3 （美國Alexis公司）；AnnexinV/FITC試劑盒（上海貝博生物公司）；FITCVADFMK（Promega公司）； 活性氧檢測試劑盒（Solarbio公司）；線粒體膜電位檢測試劑盒（Solarbio公司）。

12儀器24孔細胞培養板、96孔細胞培養板（美國Corning公司）；Spectra Max M2e多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；恒溫培養箱（上海博迅實業公司）；流式細胞儀（Flow Cytometer，Accuri C6，美國BD公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus IX 81， 日本）。

2方法

21AAEO的制備參照文獻并有所改動[6]，將艾條燃燒后產生的艾煙通入玻璃冷凝器中，于10 ℃以下進行冷凝，收集玻璃冷凝器表面產生的冷凝液滴，去除冷凝物中的顆粒狀沉淀，收集透明的、具有濃郁芳香氣味的液體即得。經鑒定純度≥98%。

22菌液的配制從4 ℃保存的YPD平板上挑取白念珠菌單菌落，接種至液體沙氏培養基，37 ℃恒溫培養箱過夜培養，離心收集菌體，血細胞計數板計數，以RPMI1640培養基將菌液濃度調整至2×106 CFU/mL備用。

23AAEO對白念珠菌SC5314的MIC的測定[7]取100 μL菌液（2×10

3 CFU/mL）與100 μL終濃度分別為32，16，8，4，2，1，05，025，0125，0062 5 mL·L-1的AAEO于96孔板中混合，設陽性藥組（氟康唑1 mg·L-1）和空白組（不含藥物），37 ℃培養48 h后，肉眼觀察，以觀察不到白念珠菌生長的最低藥物稀釋度為MIC（minimum inhibitory concentration，MIC）。實驗平行重復3次。

24AAEO對白念珠菌SC5314的代謝活性的影響[8]取100 μL菌液（濃度為2×106 CFU/mL），與100 μL終濃度分別為32，16，8，4，2，1，05，025 mL·L-1AAEO于96孔板中混合，設陽性藥組（氟康唑32 mg·L-1）和空白組（不含藥物），37 ℃培養24 h后，吸棄上清，每孔加入50 μL XTTVK3溶液，37 ℃避光繼續孵育2 h。以多功能酶標儀檢測492 nm處各孔的A。實驗平行重復3次。

25AAEO對白念珠菌SC5314活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響[9]取菌懸液（2×106 CFU/mL），分別加入AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），37 ℃作用12 h，3 000 r·min-1離心5 min收集細胞，無菌PBS緩沖液清洗3次后，重懸細胞至5×106 CFU/mL。臨用前以DMSO溶解DCFHDA（-20 ℃避光存）得10 mmol·L-1儲備液。加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFHDA染液和不加DCFHDA液的對照菌液，37 ℃孵育20 min。流式細胞儀檢測ROS水平。

26AAEO對白念珠菌SC5314線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影響[10]取濃度為2×106 CFU/mL菌液，分別加入不同濃度的AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），37 ℃干預12 h，離心（3 000 r·min-1）5 min收集細胞，無菌PBS緩沖液清洗3次后，重懸細胞調整濃度至5×106 CFU/mL。按照試劑盒說明書加入熒光染料JC1染色工作液，于暗處30 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，采用流式細胞儀檢測熒光強度。

27AAEO對白念珠菌SC5314磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine，PS）外翻和凋亡率的影響[11]在C albicans SC5314細胞懸液（5×106 CFU/mL）中分別加入AAEO（終濃度為1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），設空白對照組，37 ℃孵育12 h。離心收集菌體，對各組細胞進行脫壁處理，轉移至15%蝸牛酶溶液中，30 ℃，100 r·min-1搖床孵育45 min，無菌PBS洗3次后，得脫壁的原生質體狀態的白念珠菌。

調整菌濃度為2×106 CFU/mL，用無菌PBS洗3次，以400 μL 1×Annexin V結合液重懸細胞，再加5 μL Annexin VFITC染液，輕輕混勻后于4 ℃避光孵育15 min，對細胞膜上的PS進行標記；再加入10 μL PI染液混勻繼續孵育5 min，對死細胞進行染色。倒置熒光顯微鏡觀察PS外翻情況并拍照，同時于流式細胞儀上分析凋亡率并統計。

28AAEO對白念珠菌SC5314細胞metacaspase活性的影響[12]取C albicans SC5314（濃度為5×106 CFU/mL），向菌液中加入AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（5 mg·L-1），設空白對照組，于37 ℃，100 r·min-1振蕩培養12 h。離心收集細胞，無菌PBS緩沖液洗3遍，加100 μL的10 μmol·L-1的FITCVADFMK于30 ℃避光染色l h，均勻涂抹在含有多聚賴氨酸的載玻片上，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。endprint

29DAPI法檢測白念珠菌SC5314細胞核碎裂[13]將經AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（5 mg·L-1）干預后的C albicans SC5314菌細胞以70%乙醇固定滲透10 min，3 000 r·min-1離心5 min收集菌體，無菌PBS緩沖液洗3次后加入10 mg·L-1的DAPI染液，室溫避光染色20 min。取菌懸液涂抹于含有多聚賴氨酸的載玻片上，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

3結果

31AAEO對白念珠菌SC5314的MIC的判定根據M27A方案，艾葉揮發油對白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1。

32AAEO抑制白念珠菌SC5314的代謝活性通過XTT還原法檢測發現，不同濃度AAEO作用后白念珠菌SC5314的代謝活性呈劑量依賴性降低，其中16 mL·L-1的AAEO能抑制50%白念珠菌的代謝活性（P<001），見圖1。

33AAEO促進白念珠菌SC5314胞內ROS的累積實驗以DCFHDA染料檢測白念珠菌SC5314胞內ROS的累積，無熒光的DCFH可以自由穿過細胞膜，被超氧陰離子和過氧化氫等ROS氧化生成發熒光。實驗結果顯示，空白組（0 mL·L-1AAEO）的熒光強度較弱（17%），不同濃度AAEO干預后，熒光強度呈劑量依賴性增強，其中05 mg·L-1AmB和02，05，1 mL·L-1AAEO能顯著提高其胞內ROS水平，分別提升91%，48%，65%，88%的活性氧水平。

34AAEO降低白念珠菌SC5314胞內MMP水平在線粒體膜電位較高時，JC1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，產生綠色熒光。通過JC1從紅色熒光到綠色熒光的轉變（FL2/FL1的比值）可檢測到細胞膜電位的變化。實驗結果顯示，與空白組（0 mL·L-1AAEO）FL2/FL1值（233）相比較，05 mg·L-1AmB使FL2/FL1降低為0492， 025，05，1 mL·L-1的AAEO能劑量依賴性的降低白念珠菌的膜電位，FL2/FL1值分別為223，165，138（P<005），見圖2。

35AAEO誘導白念珠菌SC5314 PS外翻，增加凋亡率PS外翻是真菌凋亡的典型表現之一。PS在細胞凋亡的早期，可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面。AnnexinV（膜聯蛋白）可以與暴露在膜外側的PS特異性結合，PI可標記死亡細胞?？瞻讓φ战M的細胞有少量的綠色熒光，且有紅色的熒光，陽性對照藥AmB組綠色熒光細胞最多。經不同濃度AAEO處理后，隨著藥物濃度的升高，綠色熒光細胞數量越多，表明PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，提示AAEO可誘導白念珠菌細胞的凋亡。同時，以流式細胞儀檢測AAEO對白念珠菌凋亡率的影響，結果發現，相比于空白組（0 mL·L-1AAEO）凋亡率（37%），05 mg·L-1 AmB 和025，05，1 mL·L-1AAEO可引起388%和48%，88%，105%的白念珠菌細胞凋亡（P<005），見圖3。

36AAEO激活白念珠菌SC5314細胞metacaspase活性在C albicans細胞中，存在Caspase同源結構類似物metacaspase，負責選擇性的切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡。因此，本實驗中選用FITCVADFMK在原位檢測metacaspase的活性?？瞻捉M（0 mL·L-1AAEO）中見有少量微弱熒光的細胞，AAEO處理后的細胞，多數細胞被標記上明亮的綠色熒光，陽性對照藥AmB的熒光亮度最為明顯，說明AAEO可激活C albicans SC5314細胞內的metacaspase活性，見圖4。

37AAEO誘導白念珠菌SC5314細胞核碎裂DAPI能穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈結合產生藍色熒光?？瞻捉M（0 mL·L-1AAEO）的白念珠菌呈彌漫均勻的低強度熒光，經AAEO處理過的細胞呈現不同程度的核固縮或顆粒狀熒光。提示AAEO導致白念珠菌細胞核固縮或碎裂，見圖5。

4討論

細胞凋亡（apoptosis）是細胞普遍存在的一種生命過程。目前以細胞凋亡為研究手段，可深層次探討和揭示疾病的發生機制，尋找新的治療藥物和方法[14]。近年來發現，引起常見真菌感染的白念珠菌在環境刺激或脅迫下，生長代謝受到抑制，引發細胞ROS累積、metacaspase 酶活性激活、MMP改變、核固縮或裂解、膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻等典型凋亡特征的變化，發生凋亡[15]。文獻報道，乙酸、AmB等藥物在適當濃度下可誘導白念珠菌細胞凋亡[1617]。

艾葉為菊科多年生植物艾蒿的干燥葉，是我國的常用中藥。文獻表明艾葉及其揮發油具有殺蟲止癢、抑菌、抗炎等作用[18]。課題組前期研究結果發現艾葉揮發油具有良好的抗真菌效果，尤其對白念珠菌的效果最明顯。本實驗采用微量液基稀釋法檢測了AAEO對白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1且對白念珠菌SC5314的生物膜代謝活性有顯著影響，可劑量依賴性的下調其代謝活性，其中16 mL·L-1的AAEO可抑制50%生物膜代謝。

線粒體是真核細胞內的能量產生中心場所，對維持細胞能量代謝和正常功能活動起重要作用。在凋亡信號的刺激條件下，線粒體膜通透性增加，會引發線粒體產生一系列的變化[19]。本實驗采用DCFHDA和JC1熒光試劑，檢測白念珠菌胞內ROS和MMP水平，結果發現經不同濃度AAEO干預后，胞內ROS大量累積，線粒體膜電位卻顯著下降，該結果提示AAEO誘導白念珠菌凋亡的過程可能與線粒體損傷相關。另外，實驗以AnnexinV/PI染料染色白念珠菌后，熒光顯微鏡觀察到白念珠菌細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）出現外翻現象，提示AAEO可誘導白念珠菌PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，引發菌體凋亡。流式細胞儀檢測結果也證實，AAEO可顯著提高白念珠菌的凋亡率。endprint

有文獻表明，約40%的真菌凋亡由metacaspase介導[20]，本實驗結果表明AAEO可顯著提升胞內ROS累積，而ROS不僅可以氧化細胞內的生物大分子，引起細胞損傷，而且可以激活metacaspase活性，導致真菌凋亡。本實驗進一步測定AAEO對白念珠菌metacaspase活性的影響，結果表明AAEO可激活metacaspase活性。實驗還以DAPI染料染色后，觀察到AAEO可導致白念珠菌染色質凝集和細胞核濃縮。

綜上所述，AAEO導致白念珠菌SC5314的細胞凋亡，表現出典型的凋亡特征，包括PS外翻、染色質凝集、細胞核固縮，另外使其胞內ROS大量累積、MMP下降，激活了metacaspase活性，隨之啟動細胞凋亡。本研究首次報道AAEO可誘導白念珠菌凋亡，凋亡進程可能與線粒體損傷有關。通過藥物（包括中藥及有效成分）誘導白念珠菌的凋亡是當前抗真菌的新策略，本研究為AAEO治療皮膚常見真菌感染的作用機制研究提供了重要的實驗基礎，并進一步豐富了中醫藥抗真菌的科學理論。

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[責任編輯張寧寧]endprint