利用反相高效液相法測定馬乳中的乳清蛋白

李敏婧，楊潔，楊迎春，王紅娟，呂岳文，申彤，劉軍，阿里木江·阿布都拉

(新疆大學 生命科與技術學院，新疆 烏魯木齊，830049)

利用反相高效液相法測定馬乳中的乳清蛋白

李敏婧，楊潔*，楊迎春，王紅娟，呂岳文，申彤，劉軍，阿里木江·阿布都拉

(新疆大學 生命科與技術學院，新疆 烏魯木齊，830049)

乳清蛋白是馬乳中主要的蛋白質，不同物種間蛋白質組成存在差異。該研究利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對馬乳清中的蛋白進行分離和定量分析，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對主要分離組分進行鑒定。結果表明，馬乳乳清蛋白中主要組分為LYS，α-lg和β-lg。利用建立的色譜分析方法對乳清蛋白定量測定結果顯示，LYS，α-lg和β-lg在(0.1～1.0)(R2=0.999 3)、(0.2～0.8)(R2=0.996 9)和(0.2～1.0) g/L(R2=0.990 3)線性關系良好。該方法的穩定性、精密度、重現性的相對標準偏差(RSD)均小于5%，加標回收率分別為：88.05%～96.26%，86.03%～95.70%和91.79%～100.97%，能夠滿足實際檢測的需要。測得馬乳乳清中的LYS，α-lg和β-lg，含量為別為(3.38±0.32)、(2.64±0.37)及(0.52±0.06) g/L。

反相高效液相色譜法；馬乳；溶菌酶；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白

新疆是多民族聚居地區，養馬業發達，當地牧民有飲用馬奶及酸馬奶的傳統。馬乳含1%脂肪、2%蛋白質、7%的乳糖[1]，馬乳相對于其他乳制品，有一些結構和功能上的特性使得它更符合人們的營養需要，乳糖含量高于其他乳品，更利于腸道微生物的生長，改善腸道問題等[2]。由于不同哺乳動物幼崽所需要的營養物質不同，因此不同物種乳中蛋白質組成不同，馬乳中α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-la)，β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-lg)，免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，具有抑菌作用的溶菌酶(lysozyme ,LYS)，乳鐵蛋白(lactoferrin , Lf)，乳凝集素(lactadherin)含量較高，除了乳清酸蛋白以上這些蛋白質的比例在物種之間差異較大：α-la占牛乳乳清蛋白50%，而馬乳中α-la所占比例較少，駝乳、馬乳中β-lg含量要高于牛乳，且馬乳β-lg較牛β-lg易消化[3]，馬乳、駝乳和牛乳α-la均含123個氨基酸，對馬乳，駝乳和牛乳主要蛋白質氨基酸序列利用NCBI進行比對，發現其氨基酸序列有明顯差異，差異性為17.34%[4]。從結構上來看，駝乳α-la比牛乳α-la多5個折疊，馬乳中β-lg中2個異構體包含162及163個氨基酸，每個異構體中含有2個二硫鍵，但在牛乳中并未發現二硫鍵。

由于其獨特的品質和功能，馬乳在輔助疾病治療方面以及在食品行業中的應用有巨大的潛力，新疆馬乳的生產大部分來自小規模飼養的牧民，難以控制生乳及其制品的質量[5]。目前，對乳蛋白質進行檢測的主要方法有高效液相色譜法(HPLC)，雙向凝膠電泳(2-DE)，層析分離(chromatography),非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption-lonization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)等。國外學者多用蛋白質組學方法——電泳、多維液相色譜與質譜聯用技術等，依據不同乳中的特征蛋白鑒別不同來源的乳制品，MIRANDA等[6]使用RP-HPLC，2-DE和MALDI-TOF-MS依據不同蛋白分子質量以及N端序列不同成功鑒別牛乳、馬乳、人乳以及山羊乳中LYS，α-lg和β-lg。BESMA S等[4]利用HPLC，MALDI-TOF-MS等蛋白質組學技術識別駝科乳中酪蛋白及乳清蛋白等，并且依據不同物種乳中的乳清蛋白的分子質量及氨基酸序列鑒定駝科乳。YANG等[7]使用2-DE和MALDI-TOF-MS依據α-la，β-lg等不同蛋白質在2-DE膠圖中所表現的不同斑點，以其作為分子標志檢測牛乳摻偽的駝乳、山羊乳等。

本研究采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對馬乳與牛、駝、酸馬乳乳清中差異蛋白乳清蛋白進行檢測，為監測新疆特色乳品質量以及優化產品加工方式提供技術理論基礎。

1 材料和方法

1.1材料

馬乳：選擇新疆烏魯木齊水西溝天然放牧的馬匹，現場采集10匹泌乳母馬的乳汁，混勻后使用冰盒帶回實驗室后立即離心，得到馬乳乳清于-50 ℃冰箱保存備用。

1.2試劑

標準物質：溶菌酶(LYS)、牛源α-乳白蛋白(α-la)、牛源β-乳球蛋白(β-lg)，純度均≥90%，均購自sigma；乙腈(HPLC級)，三氟乙酸(TFA)和其余試劑均為分析純，α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)，純度99%，購自sigma；Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Analyzer(ABI)。

1.3儀器

高效液相色譜儀(LC-10ATvp),日本島津；低溫離心機(3K30) ,德國Sigma；超聲波清洗儀(B3200S),美國BRANSON；超純水儀(NW Ultra-pure Water System),香港heal force；改良砜復合膜(Biomax系列),美國Millipore；電子天平(AL104型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超級恒溫水浴鍋(DKB-501A型),上海精宏實驗設備有限公司；質譜儀4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer ，ABI(Foster City)。

1.4實驗條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 5u 100? C4(150×4.6) mm；流動相：A液0.1% TFA水， B液0.09% TFA乙腈; 流速：1.0 mL/min；檢測波長：215 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；外標法定量。采用梯度洗脫方式分離檢測馬乳乳清中的蛋白組分，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

注：A:A液0.1﹪TFA 水; B:B液0.09﹪TFA 乙腈。

1.4.2 質譜條件

樣品靶：384 Opti-TOF 123 mm×81 mmss ，ABI；檢測方式：正離子反射檢測；基質：CHCA。

1.4.3 標準液制備

溶菌酶標準貯備液：準確稱取溶菌酶標準品1.0 mg，用1 mL超純水溶解。

用同樣的方法制得質量濃度為1.0 g/L的α-la和β-lg標準貯備液。

1.4.4 樣品處理

取馬、牛、駝、酸馬乳，4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，去除上層乳脂和下層酪蛋白等沉淀，將得到的乳清二次離心，去除殘余的少量乳脂和酪蛋白沉淀，取二次離心后的乳清1 mL，用超純水稀釋至2 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.4.5 樣品測定

將經過1.4.3樣品處理的馬乳乳清樣品，按照1.4.1的色譜條件進行分析。

2 結果與討論

2.1方法學考察

2.1.1 檢測波長的選擇

選用215 nm和280 nm檢測波長對同一樣品進行分析[8-9]，目標蛋白(1:LYS ; 2:α-la; 3:β-lg) 在215 nm檢測波長下有較高的響應(圖1)，確定215 nm為最佳檢測波長。

A-215 nm; B-280 nm; 1-LYS; 2-α-la; 3-β-lg圖1 不同檢測波長下RP-HPLC測馬乳乳清蛋白的色譜圖Fig.1 Chromatography proles for mare whey protein by RP-HPLC, detected at 215 nm(A)and 280 nm(B)

2.1.2 梯度洗脫程序的選擇

起始梯度洗脫程序為95%的A液，5%的B液，乳清蛋白幾乎完全與固定鍵合相發生疏水作用。隨著B液濃度不斷提高(圖2)，逐步破壞蛋白與固定相之間的疏水作用，最終蛋白被一一洗脫下來。當濃度達到30%時開始有較大的峰(β-lg)，直到濃度達到45%時不再有峰?？梢源_定25%～50%的B液可以將乳清蛋白中的組分完全洗脫。

圖2 不同B液濃度下馬乳的洗脫色譜圖Fig.2 RP-HPLC profile of clarified mare’s milk on a Kromasil C4 column

2.1.3 流速的選擇

柱溫為40 ℃，分別選用0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min五個流速進行洗脫(圖3)[10]，隨著流動相流速的增大，色譜峰的峰形變的尖銳對稱，并且保留時間被大大縮短，峰的分離度增大，分離效果明顯提高。由于流速對面積百分比的影響較小，因此流速不會影響最終各組分的定量結果。綜合考慮，最終選擇1.0 mL/min作為洗脫流速。

1-0.4 mL/min; 2-0.5 mL/min; 3-0.6 mL/min; 4-0.8 mL/min; 5-1.0 mL/min圖3 不同流速對馬乳清蛋白分離影響的色譜圖Fig.3 Chromatography proles with different flow velocity

2.1.4 色譜柱柱溫的選擇

固定其他條件不變，選擇不同溫度進行恒定柱溫洗脫(圖4)[10]，柱溫升高，使色譜峰變得尖銳對稱，實驗結果中溫度對3個大的組分峰的保留時間影響不明顯，但隨著柱溫升高，LYS峰面積有減少的趨勢，β-lg峰面積有增加的趨勢，而α-la峰面積隨著柱溫的升高幾乎不變。綜合考慮LYS，α-lg和β-lg三種蛋白的最佳峰面積，選擇40 ℃作為最終檢測柱溫。

1-30 ℃; 2-35 ℃; 3-40 ℃; 4-45 ℃; 5-50 ℃圖4 不同溫度對馬乳清蛋白分離影響的色譜圖Fig.4 Chromatography proles with differentcolumn temperature

2.2分析方法的性能指標

2.2.1 線性范圍

取LYS，α-la和β-lg標準貯備液，分別稀釋成質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L及0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標準系列溶液。按1.4.1色譜條件分析(圖3)。以標準品質量濃度為橫坐標(X)，標準品峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。本方法LYS，α-la和β-lg分別在(0.2～1.0)、(0.2～0.8)和(0.2～1.0) g/L的質量濃度范圍內線性關系良好，檢出限分別為0.59、7.3和8.7 mg/L，滿足檢測要求(表2)。

A-LYS標品; B-α-la標品; C-β-lg標品圖5 LYS(A),α-la(B) 和β-lg (C)標準品的色譜圖Fig.5 Chromatography proles of LYS(A),α-la(B) and β-lg (C) standards

名稱線性回歸方程相關系數(R2)線性范圍/(g·L-1)檢出限/(g·L-1)LYSy=17735884.7x-105401.10.99930.2～1.00.00059α-lay=7500107.8x-156482.00.99690.2～0.80.0073β-lgy=6852159.5x-321581.80.99030.2～1.00.0087

2.2.2 精密度實驗

取經1.4.3樣品處理后的待測樣品，按1.4.1的色譜條件，在同1天連續進樣3次，分別求得LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以相對標準偏差RSD表示精密度(表3)。本法相對標準偏差(RSD)分別為3.26%、0.97%和1.73%<5.00%，可知此實驗方法的精密度良好。

表3 方法精密度

2.2.3 穩定性實驗

取同一待測樣品，在檢測過程中的24 h內分別在0、8、16 h進樣1次，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以其RSD值表示天內穩定性(表4)。用上述待測樣品在第2天、第3天重復進樣，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以其RSD值表示天間穩定性(表4)。相對標準偏差RSD值均小于5%，可知該方法穩定性良好。

表4 方法穩定性

2.2.4 重現性實驗

同一個待測樣品分3等份，按照1.4.3的樣品處理方法處理，1.4.1的色譜條件，分別進樣，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值(表5)。并計算3個組分的相對標準偏差(RSD)分別為2.74%、2.17%和2.37%<5.00%，可知該方法重現性良好。

表5 方法重現性

2.2.5 回收率實驗

取同一個待測樣品共六份，其中3份測本底值，其余3份添加一定量的標準品。由于LYS、α-la和β-lg標準品分別來自蛋清、人乳及牛乳，與馬乳中相應組分存在差異，組分保留時間有偏差，因此認為加標測回收率的的樣品本底值為0。此方法測得的回收率均在86%以上(表6)。

表6 RP-HPLC法加標回收率實驗結果

2.3樣品中LYS、α-la和β-lg含量的測定

SILVIA VINCENZETTI等[11]曾指出，馬科乳乳清中的高豐度蛋白組分為LYS、α-la和β-lg，且利用反相C4柱對驢乳乳清分析所得的3個大量組分峰分別為LYS、α-la和β-lg。因此結合上述文獻記載及標準品的保留時間、出峰前后順序，最終確定圖1-A中馬乳乳清在反相C4柱中所表現出的1、2、33個大量組分峰分別為LYS、α-la及β-lg。

選擇4個不同待測馬乳樣品，分別測定LYS、α-la和β-lg的含量，結果見表7。由表7可知，馬乳乳清中LYS、α-la和β-lg的平均含量分別為(0.52±0.06)、(3.38±0.32)及(2.64±0.37) g/L。

表7 樣品乳中LYS、α-la和β-lg的含量

2.4不同家畜乳品乳清蛋白的比較

對馬乳與酸馬乳、驢乳、駝乳、牛乳中乳清蛋白樣品在相同處理條件和色譜條件下進行分析檢測，發現不同家畜乳清蛋白在反相C4柱上色譜行為差異顯著，表現出蛋白質多態性(見圖6)這與乳清蛋白組分的細微結構變化有關。馬乳與酸馬乳(圖6中的1、圖6中的2)均存在保留時間為10、17、38及42 min的蛋白峰，驢與馬親緣關系相近，驢乳(圖6中的4)含有在馬乳中也出現的保留時間為17、38及42 min的蛋白峰，與馬乳相比缺少保留時間為10 min的特征峰；駝乳只有一個保留時間為25 min的特征峰(圖6中的5)，在此保留時間馬、驢、牛乳清均無峰出現；牛乳(圖6中的3)的2個特征峰保留時間為39與45 min，在45 min處馬、驢、駝乳清均無峰出現。這種差異對乳的鑒別具有重要意義。

1-馬乳；2-酸馬乳；3-牛乳；4-驢乳；5-駝乳圖6 不同來源乳品乳清蛋白的色譜圖Fig.6 Chromatography proles of whey protein from different sources

2.5馬乳及駝乳乳清蛋白中差異蛋白的質譜鑒定

由于缺乏馬乳及駝乳乳清蛋白組分標準品，所以實驗中圖5為來源于牛乳的LYS、α-la和β-lg標準品的色譜圖，蛋白質的來源不同因此它們在C4色譜柱上所表現出的保留時間有所差異。為更進一步確認馬乳乳清蛋白在C4色譜柱分離的3個特征組分分別為LYS、α-la和β-lg，以及探究駝乳乳清蛋白在C4色譜柱分離的蛋白是何組分，對馬乳和駝乳乳清蛋白組分進行回收濃縮，并進行MALDI-TOF質譜分析。分析結果經數據庫檢索和人工比對(表8)，馬乳乳清蛋白(圖6中的1)的3個特異蛋白(17、38、42 min)為前文中推測的LYS、α-la和β-lg，但這3個蛋白組分與來源于蛋清的LYS和牛乳的α-la和β-lg保留時間有所偏差，其中主要原因就是來源于不同物種所致。駝乳乳清蛋白25 min的蛋白被鑒定為α-la，與馬乳、牛乳乳清蛋白具有很大的差異，原因可能是駝乳來源的α-la的蛋白結構與來源于馬乳、牛乳的差別較大，所以在C4色譜柱上表現出保留時間的差異明顯。

表8 質譜鑒定駝乳、馬乳WP中蛋白信息

3 結論

通過對RP-HPLC方法的考察，表明應用RP-HPLC法檢測馬乳乳清中LYS，α-lg和β-lg的方法是可行的。該方法前處理過程簡單，3種蛋白在(0.2～1.0) g/L質量濃度范圍內線性關系良好、精密度高、準確性好，適合進行較大樣本量的樣品分析檢測。在馬乳、酸馬乳、驢乳、駝乳、牛乳中乳清蛋白的分析中發現，不同物種來源乳品在反相C4柱上表現蛋白質多態性，可作為乳品摻偽檢測的依據。對馬乳和駝乳乳清蛋白特征蛋白組分進行回收濃縮，并進行Maldi-TOF-TOF質譜鑒定，分析結果經數據庫檢索和人工比對，結果表明馬乳乳清蛋白的3個蛋白(17、38、42 min)為前文中推測的LYS、α-la和β-lg，這3個蛋白組分與來源于蛋清的LYS和牛乳的α-la和β-lg的保留時間有所偏差。駝乳乳清蛋白25 min的蛋白被鑒定為α-la，這與馬乳、牛乳乳清蛋白具有很大的差異，原因可能是駝乳來源的α-la的蛋白結構與來源于馬乳、牛乳的差別較大，所以在C4色譜柱上表現出保留時間的差異明顯。

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Determinationofwheyproteinsinmaremilkbyreversed-phase

high-performanceliquidchromatography

LI Min-jing, YANG Jie*, YANG Ying-chun, WANG Hong-juan, LYU Yue-wen, SHEN Tong, LIU Jun, Alimujiang·ABUDULA

(College of Life Sciences, Xinjiang University,Urumqi 830049,China)

Whey protein are the main protein in mare milk，but are different in protein composition among different species. In this paper, reserved-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used to isolate and quantify proteins in mare whey, the main components were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The result showed that LYS, α-Ig and β-Ig are the primary components in mare whey proteins. The linear relation of LYS , α-Ig and β-Ig are in the range of 0.1-1.0 (R2=0.999 3) 0.2-0.8 (R2=0.996 9) and 0.2-1.0 μg/L(R2=0.990 3), respectively. The relative standard deviations (RSDs) value of precision and reproducibility tests were all less than 5%, and the spike recovery was in the range of 88.05%-96.26%, 86.03%-95.70% and 91.79%-100.97%, respectively. The concentration of LYS, α-lg and β-lg in mare milk were (0.52±0.06)、(3.38±0.32) and (2.64±0.37) μg/L, respectively.

reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC); mare milk; lysozyme; α-lactalbumin;β-lactoglobulin

碩士研究生(楊潔教授為通訊作者，E-mail：xindayangjie@sina.com)。

國家自然科學基金(31471645)

2016-11-21，改回日期：2017-03-10

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013452