單增李斯特菌vip基因缺失菌株的構建與篩選

李 森， 牟俊潔， 劉武康

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093)

單增李斯特菌vip基因缺失菌株的構建與篩選

李 森， 牟俊潔， 劉武康

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是廣泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌，作為胞內寄生菌，它可以引起強烈的細胞免疫，是潛在的優良疫苗載體。vip是單增李斯特菌的毒力基因，與其侵襲能力密切相關。因此構建vip基因敲除株可為單增李斯特菌疫苗載體的研發打下重要基礎。從單增李斯特菌EGDe基因組中擴增出vip基因上、下游序列，連接到穿梭載體pKSV7中得到敲除載體pKSV7-Δvip，將其以電穿孔的方式轉入單增李斯特菌后，通過同源重組利用氯霉素和溫度雙重壓力篩選得到vip基因的敲除突變株，并對敲除菌株的生長曲線進行分析發現vip敲除對細菌的生長沒有顯著影響，為進一步研究vip基因功能、單增李斯特的致病機制和疫苗載體的研發提供參考。

單增李斯特菌；vip基因敲除；突變株；同源重組

LI Sen, MU Jun-jie, LIU Wu-kang

(Schl.ofMed.Instrum. &FoodEngin.,ShanghaiUni.ofSci. &Techonol.,Shanghai200093)

單核細胞增多性李斯特菌簡稱單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM),廣泛存在于自然界中，是一種人畜共患病的病原菌[1]，主要通過污染的食物引起人、畜的李斯特菌病，易感染者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人和免疫功能缺陷者，死亡率高達30%以上[2]。單增李斯特菌對食品的污染與危害，已引起世界各國的普遍關注和高度重視，被世界衛生組織列為四大食源性致病菌之一[3]。單增李斯特菌主要隨污染食物進入腸道，侵襲腸道上皮細胞穿透腸道屏障后進入血液循環引起其他器官的感染。研究發現內化素InlA和InlB是細菌進入腸道細胞的關鍵因子[4]，ActA(actin-assembby inducing protein precursor)等對于單增李斯特菌在細胞與細胞間擴散是必不可少的[5]。vip基因是單增李斯特菌的重要毒力基因，其表達的Vip蛋白可以被錨定在細菌的細胞壁上，介導單增李斯特菌對宿主細胞的侵襲[6]，但目前對于vip基因如何介導單增李斯特菌對宿主細胞侵襲的研究仍然十分有限。因此vip基因功能的研究有助于進一步闡述單增李斯特菌的致病機理。單增李斯特菌是一種細胞內寄生菌，進入人體后主要寄生在巨噬細胞和單核細胞內，可以引起有效的細胞免疫反應[7]。并且單增李斯特菌獨特的生物學特點使其具備了作為疫苗載體的優秀潛質，如表面的肽聚糖、載脂蛋白等可以起到加強抗原提呈的作用[8-9]。如果將單增李斯特菌做減毒處理，將其作為載體轉入腫瘤抗原等制成腫瘤疫苗，就可以起到激發細胞免疫特異殺傷腫瘤細胞的作用[10]。如何獲得安全無害的減毒株是目前研究的重點之一。本研究擬通過同源重組的方法構建單增李斯特菌vip基因敲除突變株，為進一步研究vip基因的功能，闡述其在單增李斯特菌侵襲感染宿主細胞中的作用，及減毒疫苗載體的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株與質粒 單增李斯特菌EGDe(血清型為1/2a)；穿梭載體pKSV7；克隆載體pMD19-T(Takara 公司)。

1.1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP等(Takara公司)；基因組DNA提取試劑盒，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，質粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)；限制性內切酶SalI、HindIII、BamHI，T4 DNA連接酶(天根生物科技有限公司)；氨芐青霉素、氯霉素(上海勵瑞生物科技有限公司)；BHI培養基(北京陸橋技術股份有限公司)。

1.1.3 引物及測序 引物根據NCBI序列(ID：987538)設計(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本實驗中的所有相關DNA測序工作均由華大基因完成。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Veriti，Applied Biosystem公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；全自動凝膠成像系統(G:Box，基因公司)；離心機(Eppendorf公司)；恒溫搖床、恒溫培養箱(上海世平實驗設備有限公司)；電穿孔儀(Micropulser，Bio-Rad公司)等。

表1 實驗中使用的PCR引物序列

1.2方法

1.2.1 PCR擴增同源臂 將EGDe單克隆接種于BHI液體培養基中，37 ℃搖床振蕩培養16 h。取5 mL左右菌體離心后利用基因組抽提試劑盒抽提EGDe全基因組。取2 μL基因組DNA為模板，分別利用VIP-5F、VIP-5R和VIP-3F、VIP-3R引物擴增vip基因上下游序列。利用SalI 將擴增得到的兩個片段進行單酶切并連接轉入克隆載體pMD-19T中得到pMD-19T-Δvip，送公司測序。

1.2.2 敲除載體pKSV7-Δvip的構建 將測序正確的pMD-19T-Δvip進行質粒抽提，并以質粒作為模板利用VIP-5F 和 VIP-3R擴增Δvip片段，DNA凝膠回收試劑盒回收后，分別將Δvip片段和pKSV7穿梭載體進行BamHI 和HindIII的雙酶切，用T4連接酶將二者連接得到pKSV7-Δvip敲除載體，涂氨芐青霉素抗性平板，對單克隆進行PCR鑒定后將陽性克隆送公司測序。測序正確的克隆接種于液體LB培養基培養后抽提質粒備用。

1.2.3 單增李斯特菌的電穿孔 將1 μg 左右的重組穿梭質粒pKSV7-Δvip與200 μL單增李斯特菌感受態細胞混合均勻，轉移至電轉杯中冰浴10 min后用電轉儀進行電轉化(1 kV，5 ms)。電轉后立即加入1 mL新鮮的BHI培養基，用移液槍轉移到1.5 mL的EP管中，30 ℃搖床培養2 h后1 000 r/min離心5 min，涂含10 μg/mL氯霉素的BHI平板，置于30 ℃培養箱中培養至平板上長出單菌落。

1.2.4vip敲除菌株的篩選 挑取氯霉素平板上的克隆接種于BHI培養基中進行震蕩培養，以菌液為模板，利用VIP-5F和VIP-3R做菌液PCR鑒定。得到陽性菌落后將其接種于含氯霉素(10 μg/mL)的BHI培養基中41 ℃振蕩培養，每12 h傳代1次。8～10代后將末次培養產物進行平板劃線(含氯霉素10 μg/mL)。挑取平板上的克隆接種于無抗性BHI培養基，30 ℃培養，每12 h傳代1次。待6～8代抗性質粒丟失后，將末次培養產物分別進行氯霉素抗性板劃線和無抗性板劃線培養，得到在抗性板上不生長、在無抗性板上生長的克隆，即為vip敲除克隆。

1.2.5vip敲除菌株的鑒定 將上述克隆培養后進行菌液PCR鑒定，以EGDe菌株作為陰性對照，以pksv7-Δvip載體作為陽性對照，為排除引物的污染將ddH2O作為引物的陰性對照。野生型擴增片段為2 200 bp左右，敲除vip后擴增片段為1 100 bp左右。

1.2.6 生長曲線測定 分別挑取EGDe和Δvip單個菌落接種于BHI液體培養基中，37 ℃搖床過夜培養16 h。取部分菌液按1∶100稀釋于新鮮培養基，將OD調至0.1左右。37 ℃搖床振蕩培養1 h后，取200 μL菌液于分光光度計中測定OD600值，每1 h測定1次，連續測量12 h，記錄細菌生長情況。

1.2.7 細菌RNA的抽提和RT-PCR 將EGDe和Δvip單個菌落接種于BHI液體培養基中培養過夜后收集菌體于1.5 mL離心管中。加入1 mL預冷的苯酚乙醇(1∶9)重懸，冰浴30 min后5 000 r/min離心5 min，棄上清加入含50 U變溶菌素和1.25 mg溶菌酶的裂解液超聲裂解30 min。再用RNA 提取試劑Trizol(Takara公司)繼續抽提RNA。將抽提的RNA反轉為cDNA 后利用VIP-KO-F和VIP-KO-R引物進行PCR檢測。

2 結果與分析

2.1目的基因片段的克隆

vip基因位于單增李斯特菌基因組344850～346049區段，根據其序列信息設計基因敲除構建策略如圖1 所示。

圖1 單增李斯特菌vip基因敲除菌株構建策略Fig.1 The construction of vip knockout Listeria monocytogenes

用引物分別擴增上下游序列后得到與預期大小一致的條帶，上游為616 bp，下游為515 bp(圖2A)。將上下游片段經酶切連接轉入pMD-19T載體后得到T-Δvip，菌液PCR鑒定結果如圖2B所示，抽提2號菌中的質粒作為模板構建穿梭載體。

2.2基因敲除穿梭載體的構建

以T-Δvip質粒為模板，用VIP-5F 和VIP-3R擴增得到Δvip片段，連入穿梭載體pKSV7后得到pKSV7-Δvip，即重組穿梭載體。對該載體的酶切鑒定結果見圖3，4個克隆均為陽性，取1號克隆送測序，結果顯示序列同源性99%以上，為陽性克隆。

圖2 vip上下游同源臂片段的克隆與連接Fig.2 The construction of vip upstream and downstream fragmentsM：DNA分子量標準品；A：vip上下游片段的PCR擴增結果，1～8：不同PCR反應管編號；B：vip上下游片段連接到pMD-19T載體后的菌液PCR鑒定結果，1～5：菌落編號M：DNA marker；A：the PCR results of vip upstream and downstream fragments，1-8：the number of PCR reaction tubes；B：the PCR results of bacterial clones after the ligation of vip upstream and downstream fragments with pMD-19T，1-5：the number of clones

圖3 pKSV7-Δvip敲除穿梭載體的酶切鑒定Fig.3 The verification of the shuttle vector pKSV7-Δvip by enzyme digestionM1、M2：不同的DNA分子量標準品；1～4：不同克隆菌落編號M1,M2:different DNA marker;1-4:the number of clones

2.3基因敲除菌株的篩選

將pKSV7-Δvip質粒通過電穿孔轉入單增李斯特菌后，將含有重組載體的菌落進行氯霉素和溫度篩選。菌落PCR鑒定結果如圖4 所示，只有2 200 bp左右片段為陰性克隆，只擴增得到1 100 bp左右片段的為陽性克隆，顯示鑒定的9個克隆中除5號外均為陽性克隆。同時氯霉素抗性板培養結果顯示，8個克隆均不能在抗性板生長，為vip基因敲除 陽性克隆。

圖4 vip基因敲除菌株的PCR鑒定Fig.4 The verificati Identification of Δvip strains by PCRM：DNA分子量標準品；1～9：菌落編號；Vector：pKSV7-Δvip質粒M：DNA marker；1-9：the number of clones；Vector：the pKSV7-Δvip plasmid

2.4vip基因敲除菌株的RT-PCR驗證

為進一步驗證vip敲除菌株中vip基因的表達情況是否有改變，進一步利用RT-PCR檢測了敲除菌株中vip的轉錄水平，結果如圖5所示。在EGDe中可以檢測到vip基因的表達，而在敲除菌株1號和2號則檢測不到目的條帶(1號中條帶偏小為雜帶)。

圖5 vip敲除菌株的RT-PCR鑒定Fig.5 RT-PCR results of vip knockout strainsM：DNA分子量標準品；1～2：敲除菌株編號M：DNA marker；1-2：the number of mutant strains

2.5單增李斯特菌EGDe和Δvip的生長曲線測定

為進一步研究vip基因的敲除是否對單增李斯特菌的生長活性產生影響，分別測定了野生型菌株和vip敲除菌株的生長曲線。結果顯示兩者的生長曲線無明顯區別(圖6)，提示vip基因的敲除不影響單增李斯特菌的生長活性。這一結果與Cabanes等[6]的發現并不一致，他們通過對EGDe (ATCC BAA-679)菌株中的vip敲除后發現敲除菌株在2～8 h內的生長速率低于野生型菌株，但最后達到相同密度。這一結果的差異可能因為不同的敲除策略造成，Cabanes等完全敲除了vip基因的讀碼框，而我們的敲除策略中保留了C末端的30個氨基酸，這段氨基酸序列包含Vip蛋白的分選信號和膜定位信號。

圖6 vip敲除菌株的生長曲線Fig.6 The growth curve of vip knockout strains橫軸的0代表菌液稀釋后未培養前，1～12依次為培養1～12 h后0 point on axis represents the time point before culture, 1-12 represent the time point after culturing for 1-12 h

3 討 論

基因敲除不僅是研究基因功能的重要分子生物學手段，也是制備減毒疫苗的重要策略之一，對毒力基因的敲除可以大大加快減毒疫苗的研發速度。本研究構建了既能在大腸埃希菌表達又能在單增李斯特菌表達的基因敲除穿梭載體，利用生物體內的同源重組，在抗性和溫度的作用下篩選得到了單增李斯特菌的vip基因敲除菌株，并且發現vip基因的敲除對細菌的生長活性沒有明顯影響，為基因功能的研究和減毒疫苗的研發奠定基礎。

幾十年來，單增李斯特菌一直被作為一種研究病原菌-宿主免疫相互作用關系的重要的模式菌株。通過多年的研究，科學家對其基因組和基因的功能有了更為深入的了解，大量的毒力基因被發現。由于單增李斯特菌在激發天然免疫和T細胞免疫方面的優勢，近年來科學家致力于將其作為腫瘤免疫治療的疫苗載體，通過基因重組等手段獲得減毒疫苗治療腫瘤。目前已有許多單增李斯特菌的腫瘤疫苗應用于臨床I/II期研究。比如溶血毒素LLO是單增李斯特菌侵襲宿主、逃逸吞噬小體造成細胞間傳播的重要毒力因子[11]。目前已開發出多種LLO敲除的重組疫苗，如含有乳頭瘤病毒DNA的預防乳頭瘤的減毒疫苗，可以治療黑色素瘤的減毒疫苗。Advaxis公司開發的減毒活疫苗已進入臨床實踐階段，他們將截斷的無溶血活性的LLO與乳頭瘤病毒E7蛋白融合制成疫苗，可以有效治療乳頭瘤病毒引起的宮頸癌等[12-13]。2015年，Lucia等研制的LLO相關的疫苗可以將黑色素瘤細胞轉化為樹突狀細胞，起到抗原提呈的作用，激發有效的細胞免疫，清除腫瘤細胞，同時一并清除細胞內的細菌，無需額外使用抗生素[14]。目前，如何平衡毒力和有效激發免疫能力是疫苗研發的關鍵。除了LLO，其他毒力基因的敲除菌株如actA[15-16]、plcB[17]等也被作為潛在的疫苗載體得到研究。

表面蛋白是單增李斯特菌侵襲感染宿主細胞的重要毒力因子。在單增李斯特菌中存在40多種表面蛋白，其中有20多種只存在于具有侵襲感染能力的毒力株中，表明表面蛋白和細菌的侵襲密切相關[18]。vip基因編碼的Vip蛋白只在有毒力的單增李斯特菌株中表達，具有LPTGX序列，可以被Sortase酶錨定在細胞膜上[6]。研究發現Vip蛋白可以通過與細胞上的受體GP96作用，介導細菌對細胞的侵襲和感染，并在此過程中通過信號轉導干擾機體的免疫系統，使得細菌在細胞內得以存活[19]，但是目前對其中具體的分子機制并不清楚。本研究構建的vip敲除菌株雖未進行毒力檢測，但可推測當Vip蛋白缺失后細菌的侵襲能力會受到破壞，造成細菌毒力降低。另外，敲除vip基因會破壞Vip與GP96之間的相互作用，可能減弱細菌對宿主細胞免疫系統的干擾，誘發免疫激活?；谝陨贤茰y，vip敲除菌株將會是一種優良的減毒疫苗載體。因此，本研究為單增李斯特菌減毒疫苗的研發提供了新的思路，對vip敲除菌株的侵襲能力及是否能有效激發細胞免疫的評價將是今后研究的重點。

[1]Hernandez A, Payeras-cifre A. What is new in listeriosis?[J]. BioMed research international, 2014, 2014(4):358051.

[2]Drevets D A, Bronze M S.Listeriamonocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion[J]. FEMS immunology and medical microbiology, 2008, 53(2): 151-165.

[3]Centers For Disease Prevention. Vital signs: Listeria illnesses, deaths, and outbreaks--United States, 2009-2011[J]. MMWR Morbidity and mortality weekly report, 2013, 62(22): 448-452.

[4]Werbrouk H, Grijspeerdt K, Btteldoorn N, et al. Differential inlA and inlB expression and interaction with human intestinal and liver cells byListeriamonocytogenesstrains of different origins[J]. Applied and environmental microbiology, 2006, 72(6): 3862-3871.

[5]Carvalho F, Sousa S, Cabanes D. HowListeriamonocytogenesorganizes its surface for virulence[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology, 2014, 4(48):1-22.

[6]Cabanes, Sousa S, Cebria A, et al. Gp96 is a receptor for a novelListeriamonocytogenesvirulence factor, Vip, a surface protein[J]. The EMBO journal, 2005, 24(15): 2827-2838.

[7]Skoberne M, Yewdall A, Bahjat K S, et al. KBMAListeriamonocytogenesis an effective vector for DC-mediated induction of antitumor immunity[J]. The Journal of clinical investigation, 2008, 118(12): 3990-4001.

[8]Rothman J, Paterson Y. Live-attenuated Listeria-based immunotherapy[J]. Expert review of vaccines, 2013, 12(5): 493-504.

[9]周云，潘蕾，郝春秋，等. 單增李斯特菌作為疫苗載體的研究進展[J]. 中國免疫學雜志, 2011, 27(12):1132-1134.

[10]Wood L M, Paterson Y. AttenuatedListeriamonocytogenes: a powerful and versatile vector for the future of tumor immunotherapy[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology, 2014, 4:51.

[11]Lam G Y, Fattouh R, Muise A M, et al. Listeriolysin O suppresses phospholipase C-mediated activation of the microbicidal NADPH oxidase to promoteListeriamonocytogenesinfection[J]. Cell host & microbe, 2011, 10(6): 627-634.

[12]Maciag P C, Radylovic S, Rothman J. The first clinical use of a live-attenuatedListeriamonocytogenesvaccine: a Phase I safety study of Lm-LLO-E7 in patients with advanced carcinoma of the cervix[J]. Vaccine, 2009, 27(30): 3975-3983.

[13]Wallecha A, French C, Petit R, et al. Lm-LLO-Based Immunotherapies and HPV-Associated Disease[J]. Journal of oncology, 2012, 2012(5):42851.

[14]Bronchalo-vicente L, Rodriguez-del Rio E, Freire J, et al. A novel therapy for melanoma developed in mice: transformation of melanoma into dendritic cells withListeriamonocytogenes[J]. PloS one, 2015, 10(3): e0117923.

[15]Manohar M, Baumann D O, Bos N A, et al. Gut colonization of mice with actA-negative mutant ofListeriamonocytogenescan stimulate a humoral mucosal immune response[J]. Infection and immunity, 2001, 69(6): 3542-3549.

[16]Wolf B J, Princiotta M F. Processing of recombinantListeriamonocytogenesproteins for MHC class I presentation follows a dedicated, high-efficiency pathway[J]. Journal of immunology, 2013, 190(6): 2501-2509.

[17]Angelakopoilos H, Loock K, Sisul D M, et al. Safety and shedding of an attenuated strain ofListeriamonocytogeneswith a deletion of actA/plcB in adult volunteers: a dose escalation study of oral inoculation[J]. Infection and immunity, 2002, 70(7): 3592-3601.

[18]Cabanes D, Dussurget O, Dehous P, et al. Auto, a surface associated autolysin ofListeriamonocytogenesrequired for entry into eukaryotic cells and virulence[J]. Molecular microbiology, 2004, 51(6): 1601-1614.

[19]Martins M, Custodio R, Camejo A, et al.Listeriamonocytogenestriggers the cell surface expression of Gp96 protein and interacts with its N terminus to support cellular infection[J]. The Journal of biological chemistry, 2012, 287(51): 43083-43093.

ConstructionandScreeningofvipGeneKnockoutListeriamonocytogenesStrains

Listeriamonocytogenes(LM) is a foodborne pathogen that widely exists in nature and foods. As an intracellular parasitic bacterium, it can cause striking cell immunity, and could be regarded as a potential vaccine vector. Genevipis an important virulence gene and closely related to the invasiveness of LM. Therefore, construction ofvipknockout LM strain will contribute to the R & D of LM vaccine. In this study, the upstream and downstream sequences of vip gene were amplified from LM-EGDe genome, and ligated into shuttle vector pKSV7 to get the knockout vector pKSV7-Δvip. Then the vector was electroperforated into LM. Under the double stresses of chloramphenicol and temperature, the knockout mutant strains by allelic recombination were obtained. Further study revealed no obvious changes on bacterial growth activity withoutvip. This study will contribute foundation for further study on the function ofvipgene as well as pathogenic mechanism and vaccine vector R & D of LM.

Listeriamonocytogenes(LM);vipgene knockout; mutant strain; homogenous recombination

上海理工大學博士啟動基金項目(1000308001)；上海理工大學大學生創新創業訓練計劃項目(10-15-308-201)

李森 女，博士，講師。研究方向為食品安全檢測，食源性致病菌致病機理研究等。E-mail：lisen1027@gmail.com

2016-09-02；

2016-10-27

Q933

A

1005-7021(2017)04-0016-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.003

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