三種醬油發酵曲霉酶活力的比較

譚永水，郭琳，劉新利*，侯麗華

(1.齊魯工業大學 生物工程學院，濟南 250353；2.天津科技大學新農村發展研究院，天津 300457)

三種醬油發酵曲霉酶活力的比較

譚永水1，郭琳2，劉新利1*，侯麗華2

(1.齊魯工業大學 生物工程學院，濟南 250353；2.天津科技大學新農村發展研究院，天津 300457)

制曲對醬油釀造至關重要，影響著醬油的品質。因此，本研究對醬油制曲過程中的米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8 3種曲霉在不同時間的酶活力進行了研究，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。結合酶活力的變化趨勢、原料水解度以及釀造后期淋油的綜合情況，最終確定在制曲42 h對3株曲霉所制備的大曲進行收曲，比較發現米曲霉A100-8在收曲時，各種酶活表現最佳。

醬油制曲；米曲霉A；米曲霉A100-8；米曲霉3.042；酶活

制曲直接影響醬油釀造的原料利用及品質形成，這一過程由可分泌多種酶系的曲霉主導完成。 作為底物的植物性原料性質決定了制曲過程多酶系配合的重要性。蛋白酶將原料中的蛋白質分解為氨基酸、低分子肽、多肽和胨，這些是醬油中非揮發性滋味物質及揮發性風味物質的前體。淀粉酶與淀粉糖化酶負責原料中淀粉的分解，對醬油品質有重大影響。如：糖化作用完全，醬油香氣濃郁、甜味適當、體態濃厚、無鹽固形物含量高，品質也較好[1]。纖維素酶使大豆細胞壁溶解，細胞膜膨脹軟化破壞[2]，內溶物充分釋放，增加原料利用率。果膠酶可降低釀造體系粘度，利于色素溶出及淋油過程，增加醬油色澤與感官度，促進多種香氣的形成。研究表明：鮮味物質谷氨酸的累積量不僅與谷氨酰胺酶有關，還與亮氨酸氨肽酶有直接關系[3]。此外，米曲霉在大曲制備階段產生大量的高活力植酸酶與磷酸酶協同釋放曲料中的植酸結合磷，為發酵階段酵母生長代謝提供所需磷酸鹽。

本研究通過3種米曲霉在不同制曲時間產生的酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶8種酶活進行了比較，并確定最佳的收曲時間及表現最優的米曲霉，為后續的醬油發酵奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 原料及菌株

原料：麩皮、豆粕。

菌種：米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8為本實驗室保藏。

1.2 實驗方法

1.2.1 制曲工藝

1.2.1.1 三角瓶種曲的制備

從保藏的米曲霉的米曲汁斜面上挑取3～4環孢子，無菌條件下接種到制備好的三角瓶種曲培養基中，充分混勻，堆積后放置于32 ℃恒溫培養箱中培養。

培養約15 h左右，將堆積培養的曲料打散，即為第1次搖瓶，以此達到二次接菌的目的，并將溫度調至30 ℃，平鋪培養。

培養約22 h后，進行第2次搖瓶，繼續平鋪培養。

培養約72 h后，自然風干，裝入袋子中備用。

1.2.1.2 大曲的制備

取300 g大小均勻的黃豆，用自來水清洗3遍干凈后，加入2.5倍水，浸泡12～15 h，至大豆子葉吸水完全，發白，無發暗。

將潤水后的大豆瀝干水分，用曲布包好裝入不銹鋼框內，放入壓力滅菌鍋內121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

滅菌后的曲料取出后，及時用手(帶上已消毒的橡膠手套)將其打散，使其迅速降溫。

待曲料溫度降至40 ℃左右，按照黃豆∶面粉為6∶4(干重)的比例加入面粉，拌勻后混入原料重量0.3%的種曲。

將充分拌勻后的大曲放入30 ℃恒溫培養箱中進行堆積培養，培養12～16 h，菌絲生長、結塊正常、曲料品溫達到38 ℃時進行第1次翻曲，確保溫度降至30 ℃左右。培養過程控制濕度95%以上。

第1次翻曲后繼續培養，培養大約6～8 h左右，曲料品溫進一步上升至38 ℃時，進行第2次翻曲。

之后控制溫度在28 ℃進一步培養至出曲。

1.2.2 大曲酶活力的測定

蛋白酶活力的測定根據SB/T 10317-1999[4]中的方法進行測定。淀粉酶活力的測定根據Young J Yoo等的方法進行測定[5]。糖化酶活力的測定根據Satheesh Kumar Gudi和孫淑琴等改良后的方法進行測定[6，7]。纖維素酶活力的測定根據Anuradha等的方法進行測定[8]。果膠酶活力的測定根據黨敏娜的方法進行測定[9]。亮氨酸氨肽酶活力的測定根據李詩雯的方法進行測定[10]。谷氨酰胺酶活力的測定根據袁振遠等的康維皿法進行測定[11]。植酸酶的測定根據彭益強的方法進行測定[12]。

2 討論分析

2.1 蛋白酶活

曲霉具有的強大蛋白酶系是其最重要的特性。這些胞外酶將變性的蛋白質進行分解，使其從大分子水解為小分子物質。這在釀造過程中對原料的降解起到了至關重要的作用。根據國標的定義，在40 ℃下每1 min水解酪蛋白1 μg的酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。醬油發酵是在酸性條件下進行的，所以本研究測定了3種曲霉制備大曲過程中不同時間的酸性蛋白酶酶活力變化情況，見圖1。

圖1 酸性蛋白酶活力的變化Fig.1 The change of acid protease activity

由圖1可知，在制曲24～36 h期間3株曲霉酸性蛋白酶活力均呈現逐漸升高的趨勢，在36 h時，米曲霉A100-8酶活力已經遠高于其他2株菌，米曲霉A酶活力又高于米曲霉滬釀3.042酶活力，且保持這一優勢到制曲結束。米曲霉滬釀3.042在制曲36 h后酶活力出現下降的趨勢，但在42 h后又有增加趨勢，應選擇在酶活力較高的情況下進行收曲，大致時間為40 h左右。此時米曲霉A100-8酶活力為1600 U/g左右；米曲霉A為1300 U/g左右；米曲霉滬釀3.042為660 U/g左右。

2.2 淀粉酶活

(1)支模前，應根據構件尺寸進行模板設計，對模板支撐體系進行設計與驗算，保證模板具有足夠的強度和剛度。

淀粉酶在醬油釀造生產的過程中起到分解淀粉質原料的作用。生成還原糖、糊精等成分，為微生物進行酒精發酵、有機酸發酵提供底物，并增加醬油中固形物的含量。1 g干重大曲中的淀粉酶在40 ℃，5 min內水解1 mg淀粉量定義為1個淀粉酶活力單位。

圖2 淀粉酶活力的變化Fig.2 The change of amylase activity

由圖2可知，在制曲24～36 h內，米曲霉A和米曲霉滬釀3.042酶活力均呈緩慢增長的趨勢，而米曲霉A100-8酶活力呈先升高后降低的趨勢。在制曲36～42 h內，3株曲霉的酶活力均大幅增加。40 h后米曲霉A100-8酶活力逐漸下降，米曲霉滬釀3.042酶活力也增加緩慢。因此，將收曲時間定為42 h左右較為恰當。此時米曲霉A100-8酶活力最高，為1115.13 U/g；米曲霉滬釀3.042次之，為1034.48 U/g；米曲霉A最弱，為954.91 U/g。

2.3 糖化酶活

醬油生產中糖的代謝水平或產生能力更多地體現在促進微生物的醇代謝、酯代謝等代謝活動，進而表現在產品的芳香性組分的變化上。糖化酶等活力的增加可以增加醬醪中的碳源，加強酵母的碳代謝強度，從而增加芳香物質的產生，增加總酯的含量。在40 ℃，pH 4.6條件下，每1 h水解淀粉產生1 mg葡萄糖作為1個酶活力單位。

圖3 糖化酶活力的變化Fig.3 The change of saccharifying enzyme

由圖3可知，在制曲24～48 h之間，3株菌的糖化酶酶活力呈逐漸上升的趨勢。并且大體上米曲霉滬釀3.042酶活力最高，米曲霉A100-8酶活力次之，米曲霉A酶活力最弱。在制曲48 h時3株曲霉酶活力均達到最高值。其中米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為1935.5107 U/g；米曲霉A100-8次之，為1708.1099 U/g；米曲霉A最弱，為1565.7674 U/g。

2.4 纖維素酶活

纖維素酶作用于植物細胞外壁，使其分解，從而促進蛋白質等內溶物質的溶解，進而促進其他酶的作用效果，提高原料利用率，改善醬油的品質。纖維素酶活過低，會導致氨基態氮水平低的情況，但纖維素酶活力過高不利于之后的淋油，也應對此注意。纖維素、半纖維素水解后釋放大量的糖類，包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖等，其中六碳糖易經微生物酵解生成乙醇。酵母在無氧條件下，經糖酵解途徑將葡萄糖分解產生丙酮酸，再在脫羧酶的作用下脫羧生成乙醛，在乙醇脫氫酶作用下將乙醛還原成乙醇，因此纖維素酶活力高還可以提高醇類的生成量。纖維素水解羧基纖維素分子中β-1,4-葡萄糖苷鍵，釋放出的還原糖(以葡萄糖計)與3,5-二硝基水楊酸(DNS)反應，產生顏色變化，這種顏色的變化與釋放還原糖的量成正比，即與酶活性成正比。通過對應標準曲線(以葡萄糖為標準)可以確定還原糖的含量，從而確定酶的活力單位。1 g干重大曲在40 ℃，pH 4.8條件下，1 h水解CMC產生相當于1 mg葡萄糖的還原糖定義為1個纖維素酶活力單位。

圖4 纖維素酶活力的變化Fig.4 The change of cellulase activity

由圖4可知，在制曲24～36 h期間，3株曲霉酶活力均呈明顯上升趨勢。在制曲36 h后，米曲霉A酶活力出現下降，其他2株曲霉酶活力依然增加，但纖維素酶活力過高并不利于之后的淋油過程，當其滿足需要量300 U/g曲即可，因此在40 h左右進行收曲較為合適。此時米曲霉A100-8酶活力較高，為310 U/g左右；米曲霉A緊隨其后，為280 U/g左右；米曲霉滬釀3.042較弱，為240 U/g左右。3株曲霉此時的纖維素酶活可以保證既能充分水解植物原料中的纖維素，提高原料的利用率，又能保證之后的淋油過程順利進行。

果膠酶是分解植物主要成分——果膠質的酶類，其起到改善醬醪粘度和過濾性、增強醬油體態的作用，但在曲霉分泌該酶的過程中，其表達水平逐漸降低，有報道認為該酶產生過量不利于后期淋油。果膠酶對果膠質有酯解、裂解、水解的作用，能夠作用于α-1,4-糖苷鍵，水解得到D-半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等物質，它們都含有一定量的醛基，有還原性，與DNS共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內，還原糖的含量與反應液的顏色強度成正比。在pH 4.4，45 ℃水浴條件下，每1 min水解果膠質產生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個果膠酶活力單位。

圖5 果膠酶活力的變化Fig.5 The change of pectinase activity

由圖5可知，在制曲24～30 h內，米曲霉滬釀3.042與米曲霉A100-8 2株曲霉果膠酶活力呈上升趨勢，米曲霉A呈降低趨勢。30～36 h內，3株曲霉酶活力均呈下降趨勢，但36 h后3株曲霉酶活力逐漸上升，除米曲霉A100-8在制曲42 h后酶活力出現小幅下降的情況。由于果膠酶活力過高同樣不利于之后的淋油，當其滿足需要量250 U/g曲即可。因此在制曲42 h左右進行收曲，此時米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為252.5 U/g；米曲霉A100-8次之，為241.8 U/g；米曲霉A最弱，為233.8 U/g。該收曲時間可保證酶的作用充分發揮。

2.6 氨肽酶活

氨肽酶是外肽酶中的一個類別，它從肽鏈氨基末端逐個催化水解相應的疏水性氨基酸，其中有些不但能水解多肽，甚至具有催化水解完整蛋白質分子的能力。當蛋白質大分子被酶解時，肽鏈中的疏水性氨基酸處在肽鏈末端暴露在外面，接觸味蕾后產生苦味。在醬油釀造的過程中氨肽酶可以大幅提高蛋白質利用率，節省成本，還可提高氨基酸生成率，進而提高產品的鮮、香味，并為醬油著色做出貢獻。

圖6 亮氨酸氨肽酶活力的變化Fig.6 The change of leucine aminopeptidase activity

由圖6可知，在制曲24～48 h間3株曲霉酶活力均在逐漸升高，成熟大曲對亮氨酸氨肽酶的需要量為30 U/g曲，在制曲36 h時，可以達到該標準，此時米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為36.1658 U/g；米曲霉A100-8次之，為30.3304 U/g；米曲霉A較弱，為29.1423 U/g。

2.7 谷氨酰胺酶活

谷氨酰胺酶是影響發酵食品風味的一種關鍵酶，它能夠分解醬油中以谷氨酰胺形式存在的谷氨酸，生成鮮味的谷氨酸和氨。米曲霉和醬油曲霉所制成的醬油曲的浸出液，谷氨酰胺酶的作用最適pH為6.5～7.5，最適溫度為40～45 ℃。在制醪發酵的初期，借助曲霉蛋白酶的作用，原料中的谷氨酸及谷氨酰胺溶出。谷氨酰胺性質不穩定，高溫或酸性條件(pH 4.5)下易變為無味的焦性谷氨酸，在酶的作用下才能變為谷氨酸。因此必須選擇具有高活力的肽酶，特別是亮氨酸氨肽酶及高活性谷氨酰胺酶的醬油曲進行后續的發酵。

圖7 谷氨酰胺酶活力的變化Fig.7 The change of glutaminase activity

由圖7可知，3株曲霉在制曲過程中谷氨酰胺酶活力在24～42 h均呈上升趨勢，此時曲的溫度與pH均適宜積累谷氨酰胺酶。在制曲42 h之后酶活力均開始大幅下降，此時孢子成熟多，消耗曲料碳水化合物等原料，曲料pH略有下降，曲料水分活度下降，呼吸產熱。因此在制曲42 h時收曲較為合適，此時米曲霉A100-8酶活力較高，為3.427 U/g；米曲霉滬釀3.042次之，為3.182 U/g；米曲霉A稍弱，為2.938 U/g?；旧夏軌蜻_到需要量3.3 U/g曲的要求。

2.8 植酸酶活

植酸可以與蛋白質絡合影響蛋白質的利用，植酸酶可以將植物原料中的植酸及其鹽分解為肌醇和磷酸，增加了可利用磷的含量，并降低植酸對礦物質和蛋白質的結合力，從而增加礦物元素的營養效價和蛋白質利用率。此外還能夠在醬油發酵過程中分解呈味性的核酸類物質，改善醬油的滋味。

圖8 植酸酶活力的變化Fig.8 The change of phytase activity

由圖8可知，3株曲霉在制曲24～36 h植酸酶活力上升迅速，36 h后開始緩慢下降。最終3株曲霉所制備的大曲酶活力差別不大，基本穩定在9 U/g曲。在制曲42 h時，米曲霉滬釀3.042酶活力最高，為9.522 U/g；米曲霉A次之，為9.441 U/g；米曲霉A100-8最弱，為8.951 U/g。

3 結論

制曲是醬油發酵至關重要的步驟，直接影響蛋白利用率等經濟指標。因此本文首先研究了米曲霉A、米曲霉滬釀3.042、米曲霉A100-8在制曲24，30，36，42，48 h時8種酶活力情況，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。研究發現：3株曲霉酸性蛋白酶活力在制曲40 h左右可達到最佳值，此時米曲霉A100-8酶活力最高，為1600 U/g。另外，3株曲霉的淀粉酶、谷氨酰胺酶的酶活力在制曲42 h也達到最大值，且米曲霉A100-8活力最高。纖維素酶活力在制曲40 h時可達到最佳酶活力值，且米曲霉A100-8活力最高。亮氨酸氨肽酶活力在制曲36 h即可達到需要量，米曲霉滬釀3.042活力最高。果膠酶和植酸酶活力在制曲42 h可達到最佳酶活力值，米曲霉滬釀3.042活力最高。糖化酶活力在制曲48 h時達到最大值，且米曲霉滬釀3.042活力最高。綜合上述8種酶的活力情況，確定收曲時間為42 h，此時米曲霉A100-8大多數酶酶活力相對優勢較明顯。

[1]孫常雁.自然發酵黃豆醬中主要微生物酶系的形成及作用[D].哈爾濱：東北農業大學，2007．

[2]閆博.醬油成曲分解酶系的組分檢測及分析[D].石家莊：河北大學，2010．

[3]張艷芳.多菌株制曲促進酶系優化與提高醬油質量的研究[D].無錫：江南大學，2009．

[4]SB/T 10317-1999，蛋白酶活力測定法[S]．

[5]Yoo Y J,Hong J,Hatch R T.Comparison of amylase activities from different assay methods[J].Biotechnology and Bioengineering,1986,30(1):147-151.

[6]Gudi S K,Gurramkonda C,Rather G,et al.Glucoamylase from a newly isolatedAspergillusnigerFME: detergent-mediated production,purification,and characterization[J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2013,56(4):427-433.

[7]孫淑琴，邵冬梅.比色法快速測定糖化酶活力新方法[J].河北省科學院學報，1997(2)：36-40．

[8]Anuradha J S,Valli Nachiyar C.Optimization of cellulase production byAspergillusnidulans: application in the biosoftening of cotton fibers[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,27(1):85-97.

[9]黨敏娜.高鹽稀態醬油發酵菌種的選育及工藝改良研究[D].廣州：暨南大學，2005．

[10]李詩雯.米曲霉蛋白酶系協同水解大豆蛋白的研究[D].武漢：湖北工業大學，2015．

[11]袁振遠，馮禧瑞.米曲霉的谷氨酰胺酶[J].調味副食品科技，1981(6)：6-9．

[12]彭益強.植酸酶高產菌株的誘變選育和融合篩選[D].泉州：華僑大學，2002．

ComparisonoftheEnzymeActivityofAspergillusoryzaeFermentedbyThreeKindsofSoySauce

TAN Yong-shui1, GUO Lin2, LIU Xin-li1*, HOU Li-hua2

(1.College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China;2.New Village Development Research Institute, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Koji making is very important for soy sauce brewing, which affects the quality of soy sauce. In this paper, the enzyme activities ofAspergillusoryzaeA,Aspergillusoryzae3.042,AspergillusoryzaeA100-8 at different koji-making time of soy sauce fermentation are studied. They are acid protease, amylase, saccharifying enzyme, cellulase, pectinase, leucine aminopeptidase, glutamine enzyme and phytase. Combined with the change of enzyme activity,hydrolysis degree and later brewing pour oil, 42 h is determined for ripe koji of three kinds ofAspergillusoryzae. It is found that the enzyme activity ofAspergillusoryzaeA100-8 is the best when the koji is collected.

koji making of soy sauce；AspergillusoryzaeA；AspergillusoryzaeA100-8；Aspergillusoryzae3.042；enzyme activity

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.005

1000-9973(2017)11-0024-05

2017-05-15 *通訊作者

大學生創新訓練項目(201610431015)

譚永水(1990-)，男，山東濰坊人，碩士，研究方向：微生物工程。