基于ITS2序列的博落回屬植物鑒定研究△

黃鵬，劉金鳳，徐敏，夏麗瓊，柳亦松，3，唐其，唐昭山，曾建國*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128；4.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·基礎研究·

基于ITS2序列的博落回屬植物鑒定研究△

黃鵬1，劉金鳳1，徐敏1，夏麗瓊2，柳亦松1，3，唐其1，唐昭山4，曾建國1*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128；4.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

目的采用ITS2序列對博落回屬藥用植物進行鑒定。方法通過對來自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶的30個博落回屬植物ITS2序列進行擴增和測序，并對其進行擴增效率及測序成功率、堿基構成、種內和種間變異分析及NJ系統進化樹分析來評估ITS2序列鑒定效果。結果博落回屬藥用植物ITS2序列長度在500 bp以內，擴增效率和測序成功率為100%，并獲得30條博落回ITS2序列。結論ITS2序列可以有效準確鑒別博落回屬植物。

博落回屬；ITS2序列；DNA條形碼；物種鑒定；遺傳分化

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.與小果博落回M.microcarpa(Maxim.)Fedde.屬于罌粟科博落回屬植物?，F代藥理研究表明博落回屬植物中的4種主要生物堿：原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿對治療多種炎癥有效，并對畜禽類有較好的腸道菌群調節作用，目前已作為飼用抗菌藥的替代品在歐洲等地區銷售[1]。博落回與小果博落回主要分布于中國、東亞、北美洲和歐洲，兩者的形態區別主要是果莢部分，博落回的果莢呈倒卵形，而小果博落回的果莢呈近圓形。前期研究顯示博落回與小果博落回中的4種主要生物堿具有組織分布特異性，其中血根堿和白屈菜紅堿主要分布在博落回的果莢和小果博落回的葉片中，而原阿片堿和別隱品堿主要分布在博落回葉片、根和小果博落回果莢中[2]。由于在博落回屬植物中一般只有博落回的果莢才是用來提取血根堿的原料，因此開發一種簡單、準確的方法區分博落回與小果博落回具有重要的意義。

DNA條形碼技術是一種基于DNA分子進化原理，通過一段通用的標準短序列對物種進行鑒定的新生物學技術[3]。近年來，DNA條形碼作為物種鑒定的工具已廣泛應用于動植物的物種鑒定及種間親緣關系的分析，在眾多的DNA條形碼中，ITS2序列具有序列片段較短、進化速率較快等特點，已經成功運用于許多傳統中藥材的鑒定[4-9]。這些研究均證明ITS2特征序列在中藥材的鑒定方面具有廣泛的應用價值[10]。雖然應用ITS2條形碼特征序列鑒別物種的研究越來越多，但是系統地用于博落回屬植物鑒別的報道很少。因此，利用ITS2序列片段建立一種準確鑒定博落回屬植物的分子鑒定體系，不僅可以對其進行準確分類，而且對用藥安全具有十分重要的意義。本研究對博落回屬植物ITS2序列進行比較分析和快速準確鑒定，旨在為博落回屬植物分子鑒定提供理論依據。

1 材料

共收集30份博落回屬植物根部材料，采自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶等地，均用網袋及泥土包裹根部材料運送至湖南省長沙市湖南農業大學國家中藥材生產(湖南)技術中心。在種植1年后待長出地上部分再采集葉片進行DNA提取，具體樣本信息見表1。

表1 博落回屬植物樣本信息

2 方法

2.1 DNA提取和序列擴增

博落回與小果博落回新鮮葉片用超純水洗凈之后，用滅菌濾紙吸凈表面水分。加入適量液氮充分研磨成粉末；再用取樣小勺稱取200～300 mg粉末樣本置1.5 mL離心管中，使用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA(TIANGEN#DP342-01)。在凝膠成像儀下觀察拍照并篩選出提取效果較好的樣品用于下一步的PCR擴增。PCR反應體積為25 μL，體系內包含：ddH2O 12 μL、2 Taq mastermix 10 μL、DNA模板1 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL。本實驗參照遠志屬研究結果[11]，引物正向為：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，反向為：GACGC-TTCTCCAGACTACAAT。擴增程序：94 ℃變性5 min，再進行35個循環(94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸7 min。

2.2 電泳檢測

稱取0.5 g瓊脂糖凝膠于錐形瓶中，加入50 mL 50×TAE緩沖液，中高火微波2 min，將錐形瓶置于水中5 min，加入0.5 μL GelRed，混勻后倒于凝膠模具中20 min后使用。取PCR產物點樣電泳，100 V，23 min后，在凝膠成像系統中對凝膠拍照，得到結果。

2.3 數據處理

選擇PCR擴增成功的DNA樣品交由擎科生物有限公司進行測序，將測序結果輸入計算機后應用Clustal W軟件對所有ITS2序列對位排列，并用Geneious 10.0.2對校對后的序列進行分子進化遺傳分析。

3 結果與分析

3.1 DNA提取、PCR擴增

對30份博落回樣品的ITS2序列分析發現，所有實驗樣本的PCR擴增及測序成功率均為100%，序列獲得率(有效序列比例)亦為100%，經瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴增電泳圖(見圖1)，擴增效果較好，條帶較亮，沒有拖尾現象，產物大小在500 bp以內。

注：泳道上序號對應樣本序號。圖1 30份博落回樣本的ITS2序列凝膠電泳圖

3.2 測序及序列分析

博落回屬的30份樣本ITS2序列的PCR及測序成功率均為100%。ITS2序列博落回種內遺傳距離為0.001 4～0.009 4，平均值為0.003 2。種間的遺傳距離為0.077 2～0.084 8，平均值為0.079 3。表明其種間遺傳距離要明顯大于種內遺傳距離。

3.3 堿基構成分析

由表2可知，博落回屬植物ITS2序列中A、C、G、T堿基的變化范圍分別為1.27%、2.17%、0.9%、2.99%。其中，湖南株洲縣產地的博落回A堿基含量最高，為21.3%；江西瑞昌縣產地的博落回A堿基含量最低，為16.7%。河南嵩縣產地的小果博落回C堿基含量最高，為33.9%。浙江臨安縣產地的博落回C堿基含量最低，為28.9%。浙江臨安縣產地的博落回以及重慶巫山、湖北襄陽市南漳縣、陜西商洛市產地的小果博落回G堿基含量最高，為32.6%；湖南株洲縣產地的博落回G堿基含量最低，為29.4%。江西瑞昌縣產地的博落回T堿基含量最高，為21.9%。湖北襄陽市南漳縣小果博落回T堿基含量最低，為14.7%。

表2 博落回屬植物ITS2序列堿基構成

3.4 構建系統進化發育樹

利用Geneious10.0.2軟件，采用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹(見圖2)。拓撲結構的可靠性用1000次重復的自展檢驗(Bootstrap analysis)來評估，分支的支持值低于50%的略去。結果顯示博落回分為一支，小果博落回被分為另一支。

圖2 基于ITS2序列構建的NJ樹

4 討論

近年來，隨著DNA條形碼技術的不斷發展及應用，越來越多的藥用植物都使用該技術進行物種鑒定，如野豌豆屬[11]、遠志屬[12]、千斤拔屬[13]和黃芩屬[14]等大量的藥用植物均已成功使用DNA條形碼技術進行物種鑒定。陳士林等[10]認為應當建立以ITS2為核心、psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系，這為中藥材準確、可靠鑒定及臨床用藥安全提供新的技術手段。

本課題組已于2012年完成了博落回屬植物的轉錄組高通量測序[1]，對不同時間的根葉果材料的轉錄組以及生物堿生源合成可能的機理進行了探索，之后又對博落回進行了全基因組測序，為下一步的功能基因挖掘和分子育種提供基礎數據。由于博落回是目前最主要的血根堿來源植物，在博落回屬植物中只有博落回的果莢才是用來提取血根堿的原料。而分辨博落回與小果博落回的主要區別也是果莢部位，因此在博落回屬植物生長早期區分兩者困難較大。本實驗運用ITS2序列鑒定博落回屬植物，結果顯示所有實驗樣本的PCR擴增和測序成功率均達到100%，表明ITS2序列適合于博落回屬植物的鑒定且穩定性較好。除了運用ITS2序列以外，本實驗樣本涵蓋了湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶等多個產地，鑒定結果表明不同產地的博落回屬植物種內差異較小，說明博落回屬植物遺傳多樣性較低并且符合本實驗室之前的SSR實驗結果[15]。從最終數據分析，ITS2條形碼序列構建的NJ進化樹顯示ITS2序列能夠準確鑒別博落回與小果博落回，保證了原料收集的準確性。

[1] Zeng J，Liu Y，Liu W，et al.Integration of transcriptome，proteome and metabolism data reveals the alkaloids biosynthesis in Macleaya cordata and Macleaya microcarpa[J].Plos One，2013,8(1)：2159-2163.

[2] 劉秀斌.博落回屬植物中生物堿代謝累積研究[D].長沙：湖南農業大學，2012.

[3] Hebert P D，Ratnasingham S，DeWaard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci，2003，270(Suppl 1)：S96-S99.

[4] Chen J，Zhao J，Erickson D L，et al.Testing DNA barcodes in closely related species of Curcuma(Zingiberaceae)from Myanmar and China[J].Mol Ecol Resour，2015，15(2)：337-348.

[5] Ashfaq M，Asif M，Anjum Z I，et al.Evaluating the capacity of plant DNA barcodes to discriminate species of cotton(Gossypium：Malvaceae)[J].Mol Ecol Resour，2013，13(4)：573-582.

[6] Yan L J，Liu J，Moller M，et al.DNA barcoding of Rhododendron(Ericaceae)，the largest Chinese plant genus in biodiversity hotspots of the Himalaya-Hengduan Mountains[J].Mol Ecol Resour，2015，15(4)：932-944.

[7] Yang J B，Wang Y P，Moller M，et al.Applying plant DNA barcodes to identify species of Parnassia(Parnassiaceae)[J].Mol Ecol Resour，2012，12(2)：267-275.

[8] Yuan Q J，Zhang B，Jiang D，et al.Identification of species and materia medica within Angelica L.(Umbelliferae)based on phylogeny inferred from DNA barcodes[J].Mol Ecol Resour，2015，15(2)：358-371.

[9] 辛天怡，雷美艷，宋經元.中藥材DNA條形碼鑒定研究進展[J].中國現代中藥，2015，17(2)：170-176.

[10] Chen S，Pang X，Song J，et al.A renaissance in herbal medicine identification：from morphology to DNA[J].Biotechnol Adv，2014，32(7)：1237-1244.

[11] 李驍，趙龍，王佩，等.野豌豆屬蒙藥藥用植物的rDNA-ITS序列分析[J].中草藥，2015，46(12)：1814-1818.

[12] 樊杰，白妍，束明月.遠志屬7種藥用植物ITS1和ITS2序列分析[J].中草藥，2015，46(4)：562-565.

[13] 張忠廉，宋美芳，李海濤，等.千斤拔屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究[J].中草藥，2015，45(1)：118-122.

[14] 夏至，高致明，張紅瑞，等.黃芩及其同屬近緣種的DNA條形碼鑒定研究[J].中草藥，2014，45(1)：107-112.

[15] 朱鵬程，柳亦松，黃鵬，等.博落回SSR引物的開發以及遺傳多樣性分析[J].生命科學研究，2013，17(2)：120-124.

IdentificationofPlantsinMacleayaspp.BasedonITS2Sequence

HUANG Peng1，LIU Jinfeng1，XU min1，XIA liqiong2，LIU Yisong1，3，TANG Qi1，TANG Zhaoshan4，ZENG Jianguo1*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，
HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.Schoolofpharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；3.VeterinaryFacultyofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；4.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Objective：To identify the medicinal plantMacleayaspp.by using ITS2 sequence.MethodsThe ITS2 sequence and sequence of 30 samples collected from Hunan，Jiangxi，Zhejiang，Hubei，Henan，Shanxi，Chongqing was amplified and the amplification efficiency，the sequencing success rate，the constitution of base pair，intra- and inter-specific variation and NJ(Neighbor-Joining) tree were analyzed，in order to evaluate the ITS2 sequencing results.ResultsThe ITS2 sequence length ofMacleayaspp.was within 500 bp；the amplification efficiency and the success sequencing rate was 100% and 30 ITS2 sequences were obtained.ConclusionThe ITS2 sequence can be effective and accurate for identification ofMacleayaspp..

Macleayaspp.；ITS2 sequence；DNA barcode；Species identification；Genetic differentiation

國家重點實驗室培育基地開放項目(15KFXM09)；湖南省科技重點計劃(2016SK3002)

*

曾建國，博士生導師，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.003

2017-02-20)