血根堿對大鼠結腸炎及炎癥通路中相關因子的影響△

柳亦松，唐昭山，劉兆穎，蔣昊航，段志貴，曾建國

(1.湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南師范大學 生命科學學院，湖南 長沙 410081；4.湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128)

·基礎研究·

血根堿對大鼠結腸炎及炎癥通路中相關因子的影響△

柳亦松1，2，唐昭山1，劉兆穎1，2，蔣昊航1，段志貴3，曾建國2，4*

(1.湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南師范大學 生命科學學院，湖南 長沙 410081；4.湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128)

目的探討血根堿對葡聚糖硫酸鈉致潰瘍性結腸炎的療效及可能的機制。方法建立葡聚糖硫酸鈉致潰瘍性結腸炎大鼠模型，隨機分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、血根堿組。觀察各組大鼠體質量、腹瀉及隱血情況；通過熒光定量PCR(qPCR)分析炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α在結腸組織中的表達量；利用免疫組化實驗檢測NF-κB通路中關鍵因子p65。結果與模型組相比，血根堿組和陽性組大鼠的結腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6表達降低，而IL-10的表達升高；同時，免疫組化實驗發現血根堿組與模型組相比，其核內轉入因子核蛋白p65顯著下調。結論血根堿可能通過調節NF-κB通路中的核轉入因子p65，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的表達，同時提高炎癥因子IL-10的表達，從而對炎癥起到抑制作用。

血根堿；結腸炎；炎癥因子；NF-κΒ(p65)

腸道與動物的健康生長有著密切的聯系，保護好腸道的健康[1]，對動物生長有著重要的作用。目前動物炎性腸病(IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病，這種疾病防治越來越困難。炎性因子在潰瘍性結腸炎的發展過程中起著關鍵性的作用。促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)在潰瘍性結腸炎的血清中顯著增加。IL-10是一種多能干細胞因子，它在炎癥過程中起重要的抑制作用；在炎癥性腸病患者中，可以檢測到IL-10的表達水平超出正常值。NF-κB是炎癥發生的重要信號通路之一[2-3]，尤其對于促炎性細胞因子的調節。NF-κB家族包括5個成員：KRelA(P65)、RelΒ、c-Rel、P(105/50/52)和P100。在未受刺激的細胞中，NF-κB是以p50和p65二聚體形式處于失活狀態。刺激后，核蛋白二聚體磷酸化或降解，核轉入因子NF-κB由胞漿轉入細胞核[4]，進而產生更大的炎癥反應。有文獻表明[5-6]，在炎性疾病患者的結腸黏膜中巨噬細胞增加，同時炎癥因子TNF-α，IL-1和IL-6的表達也增加，表明NF-κB的活化增加了炎性細胞因子的表達。因此，有效抑制NF-κΒ途徑、調節細胞因子的表達，有利于減輕炎性疾病。

血根堿是一種主要存在于罌粟科、藍堇科及蕓香科植物中的苯并菲啶類生物堿，主要來源植物為血水草、博落回和白屈菜，化學結構見圖1，具有抗炎、抗菌、促進動物生長、抗腫瘤及殺蟲等作用[7-9]，其作為一種植物源成分，還具有低殘留、無環境污染等優點，在獸醫領域具有抗菌作用和促進動物生長等的應用前景。近年許多實驗研究表明，血根堿在抑制炎癥的發生發展中具有重要價值[2-3]。

血根堿(Sanguinarine，SA)圖1 血根堿結構式

潰瘍性結腸炎臨床癥狀為腹瀉和黏液膿血便等特征，病變在腸道黏膜及黏膜下層，在病變部位形成潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細胞減少、炎性細胞浸潤等。常見的人造動物潰瘍性結腸炎模型有葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型、乙酸模型、角叉菜膠模型等。DSS模型廣泛用于研究腹瀉及炎癥[10-12]。該方法采用5% DSS水溶液給大鼠自由飲用，連續7 d，大鼠的病變從肛門開始自后而前地發展，黏膜充血水腫，散在性糜爛或潰瘍；在4～5 d出現腹瀉，用隱血試紙檢測成陽性，在5～7 d可出現不同程度的肉眼便血。大鼠出現腹瀉的同時，體質量也會減輕，呈現以淋巴細胞浸潤為主的非特異性炎癥，與人類的潰瘍性結腸炎(UC)病變類似。本實驗采用DSS模型來驗證血根堿的抑制或緩解大鼠結腸炎的作用并說明其可能的機制。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠，SPF級，體質量(200±10)g、雄性，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK湘2011-0003。

1.2 主要藥品與試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS，MP Biomedicals，LLC，Cat No.160110 M.W=36 000～50 000)、便隱血(FOB)檢測試紙(艾博生物醫藥有限公司，批號：2015020127)、柳氮磺吡啶腸溶片(上海中西三維藥業有限公司，批號：20141115)、98%氯化血根堿(湖南美可達生物資源股份有限公司，批號：1408011)、羧甲基纖維素鈉CMC-Na(北京北瑞達醫藥科技有限公司，批號：20121015)、qPCR Master Mix 2×(Cat：#K0361)購自Thermo Scientific 公司；動物組織RNA提取試劑盒(Cat：#DP431)購自天根生物科技有限公司；Prime ScriptTM RT Master Mix第一鏈合成試劑盒(Cat：RR036A)購自TaKaRa公司。p65 免疫組化試劑盒(上?？撇噬锟萍加邢薰?，批號：20120406)。

1.3 主要儀器

7300熒光定量PCR儀器(美國應用生物系統公司)，MILLI-Q純水儀(德國默克-密理博實驗室設備有限公司)，J12-21M型離心機(Beckman Model)，CR21型高速立式離心機(HITACHI)，DRP-9271型電熱恒溫培養箱(上海森信試驗儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組

選取健康大鼠32只，全部雄性，體質量為(200±10)g，恒溫25 ℃適應性飼養3 d后，隨機分為4組：空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、血根堿組。

2.2 實驗模型建立與給藥方式

第1天到第14天血根堿組和柳氮磺吡啶組大鼠每天分別按體質量灌胃75 mg·kg-1的血根堿(該劑量設定來自于前期研究基礎)[10]和225 mg·kg-1的柳氮磺吡啶[13]，灌胃體積為1 mL，空白組、模型組灌胃等體積的CMC-Na溶液；模型組、柳氮磺吡啶組和血根堿組在第8天到第14天自由飲用含5% DSS的蒸餾水，空白組飲用蒸餾水。

2.3 實驗觀察與記錄

每天定時(早上9時)稱量并記錄每只大鼠體質量，大便性狀及出血級別，并計算每只大鼠的日常疾病活動指數(DAI)。DAI具體評分指標見表1，DAI=(體質量+大便性狀+便血)評分/3。

表1 DAI具體指標評價方法

注：大便正常：正常成形的；大便松軟：黏糊狀，但并不黏在肛門上；腹瀉：糞便呈液體狀，在肛門處有殘留；糞便潛血檢測：使用便隱血(FOB)快速檢測試紙檢測。

2.4 動物處理

第15天處死大鼠，取出結腸，一部分保存于甲醛溶液中，用于觀察結腸部位的病理變化；一部分結腸組織和血清于-80 ℃保存，用于炎癥因子的檢測。

2.5 熒光定量PCR

總RNA提?。好拷M大鼠結腸組織各自于-80 ℃取50 mg立即放入裝有液氮的研缽，用研缽棒研磨成粉末狀，加入RNA提取試劑盒對應量體積的RL裂解液，后續步驟按試劑盒提取操作說明，獲得總RNA。各組取1 μg RNA進行cDNA第一鏈的合成。利用表2設計好的引物對炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α進行熒光定量(qPCR)分析。qPCR條件：95 ℃ 30 s 1個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。數據采用2-ΔΔCt方法處理，對每個組織設立3個重復，首先計算各組織的目的基因與β-actin的Ct差值，即ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，選取空白組的平均ΔCt作為對照，用其他基因的ΔCt減去其平均ΔCt，即為ΔΔCt；2-ΔΔCt表示各組織基因的表達相對于空白組基因的變化倍數。

2.6 免疫組化和HE染色

2.6.1 石蠟制片 取保存在10%甲醛溶液中的結腸組織進行石蠟切片：第一步，石蠟包埋，取結腸組織進行方塊修整用紗布包好置流水下沖洗過夜，再進行70%、80%、95%、100%乙醇進行脫水，二甲苯進行透明，置于溶好的石蠟中進行包埋。第二步，將包埋好的組織在切片機上切成厚度4 μm并貼片到載玻片上。制成好的切片將進行HE染色和免疫組化。

表2 相關炎癥因子的引物

2.6.2 免疫組化 切片脫蠟、水化：二甲苯10 min→100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→85%乙醇5 min→80%乙醇5 min→75%乙醇5 min→60%乙醇5 min→50%乙醇5 min→30%乙醇5 min→自來水1 min；PBS洗2～3次各5 min；3%H2O2(80%甲醇)滴加在切片上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次各5 min?？乖迯停豪描蹤此徕c緩沖液(pH=6.0)在微波爐中加熱至沸騰，然后將脫臘、水化的組織切片放入，斷電，間隔5～10 min，反復1～2次；PBS洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，甩去多余液體；滴加Ι抗(p65抗體)50 μL，室溫靜置1 h或4 ℃過夜或37 ℃ 1 h；4 ℃過夜后需在37 ℃復溫45 min；PBS洗3次每次2 min；滴加Ⅱ抗45～50 μL，室溫靜置或37 ℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染2 min，鹽酸乙醇分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明，30%乙醇3 min→50%乙醇3 min→70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→95%乙醇3 min→100%乙醇3 min→二甲苯20 min；封片、鏡檢。免疫組化后觀察p65蛋白在結腸中的表達情況。

免疫組化結果評判標準：1)陽性著色細胞數：每只大鼠觀察5張切片、每張切片上觀察5個高倍視野(×200)，計數陽性細胞百分比，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。2)陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。3)兩者計分相乘即為陽性等級。

2.6.3 HE染色 脫蠟：二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ5 min；水化：100%乙醇Ⅰ5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ5 min→95%乙醇Ⅱ5 min→85%乙醇3 min→5%乙醇2 min→蒸餾水沖洗1 min；染色：蘇木精染色5 min→自來水洗→鹽酸乙醇分化15 s→自來水洗15 min→蒸餾水洗2 min→75%乙醇2 min→85%乙醇2 min→0.5%伊紅染色1 min→95%乙醇Ⅰ5 min→95%乙醇Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min；封片：中性樹膠封片，上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發生氣泡。HE染色后觀察結腸組織病理情況。

2.7 統計方法

3 結果

3.1 DAI指數

注：與模型組相比，*P<0.05；下同。圖2 各組大鼠DAI

3.2 炎癥因子的表達

圖3 IL-1β炎癥因子表達

圖4 IL-6炎癥因子表達

圖5 TNF-α炎癥因子表達

圖6 IL-10抑炎因子表達

3.3 HE染色和免疫組化

3.3.1 HE染色 根據圖7可見空白組杯狀細胞較多，具有紋狀緣；模型組紋狀緣消失，杯狀細胞減少，并且有許多炎性細胞產生。該實驗結果表明葡聚糖硫酸鈉對大鼠造模成功，符合實驗預期結果。

注：A.空白組；B.模型組。圖7 大鼠結腸組織HE染色

3.3.2 免疫組化 空白組大鼠NF-κB(p65)蛋白陽性細胞正常表達(見圖8A)，模型組中NF-κB(p65)蛋白陽性細胞最多(見圖8B)；血根堿組(見圖8C)和陽性組(見圖8D)NF-κB(p65)蛋白陽性細胞低于模型組，差異具有統計學意義，但高于空白組。通過表3組織免疫評分結果分析：模型組陽性等級為強陽性(+++，10.26±1.61)，血根堿組的陽性等級為弱陽性(+，3.20±0.96)，統計學分析P=0.009，差異具有統計學意義，血根堿組大鼠炎癥情況明顯得到了緩解，趨于正常大鼠。結果表明在正常情況下，大鼠炎癥因子NF-κB(p65)也有表達，在給予血根堿后大鼠炎癥因子NF-κB(p65)表達顯著降低。分析血根堿可能降低炎癥因子NF-κB(p65)表達，抑制或緩解炎癥發生。

注：A.空白組；B.模型組；C.血根堿組；D.陽性組；箭頭指的為陽性細胞。圖8 大鼠NF-κB(p65)蛋白免疫組化

組別 陽性等級NF?κB(p65)(x±s)空白組+213±074模型組+++1026±161血根堿預防給藥組+320±096??陽性藥物預防給藥組++640±128??

注：與模型組相比，**P<0.01。

4 討論

本研究主要基于葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導大鼠結腸炎模型，這種結腸炎造模方式已經得到了大量的實驗驗證，并且被普遍接受[12-13]。在此基礎之上，實驗通過預防灌胃75 mg·kg-1·d-1血根堿14 d，其中在第8天進行DSS誘導結腸炎大鼠模型，大鼠的DAI與模型組比較具有統計學差異。該結果表明血根堿在臨床癥狀上能起到影響體質量、減緩便血的產生，說明血根堿對治療大鼠結腸炎具有一定的保護作用。

DAI測量的指標主要包括體質量、糞便的軟硬和糞便中的隱血[13]，這3個指標能夠較好地反映所檢測動物的生理機能。本實驗中的結果表明，血根堿能夠顯著減緩葡聚糖硫酸致大鼠炎癥的產生和增強大鼠對疾病的抵抗，在生長過程中保持健康。動物臨床表現為血根堿組大鼠較模型組的大鼠更活躍和日增重高。該結果說明血根堿能夠預防動物疾病和保持動物的日增重。

組織病理變化能較客觀地反映機體的防御表現。在免疫系統中上皮細胞具有先天的天然屏障作用，同樣也具有許多與免疫相關的細胞，比如巨噬細胞、淋巴細胞、杯狀細胞，這些細胞數量和形態的改變對機體免疫的第一道防御功能具有重要意義。該實驗病理切片表明，血根堿能較好地保護上皮細胞中的杯狀細胞，能使得杯狀細胞的形態保持完整，同時保障其發揮正常的生理反應。

白介素調節因子(IL)和腫瘤壞死因子(TNF-α)在機體的免疫系統具有非常重要的作用，如IL-1、IL-6和IL-10在炎癥通路上能影響NF-κB(p65)蛋白的表達，從而影響NF-κB炎癥通路。在該實驗中，我們從熒光定量和免疫組化的實驗結果來看，血根堿可能抑制IL-1、IL-6和TNF-α的表達，聯級反應后能使NF-κB的表達降低。從機體中多種蛋白質分子中的表達來看，血根堿在抑制炎癥上可能是通過下調IL-1、IL-6和TNF-α的表達來抑制炎癥的產生。同樣，IL-10在炎癥通路上是抑制炎癥發展的重要調節因子。因此該實驗表明，血根堿能夠顯著提高IL-10調節因子的表達?；谝陨辖Y果，我們認為血根堿不僅能下調促炎因子的表達，還能提高抑炎因子的表達，通過這兩條途徑來共同減緩炎癥的發生發展。血根堿通過影響白介素和腫瘤壞死因子的表達來調節炎癥的變化，是否還通過其他途徑來調節機體免疫機制，還需要結合轉錄組學和蛋白質組學技術等動態變化分析技術進行更深入的研究。

[1] 鄭璇，鄭育洪.國內外超級細菌的研究進展及防控措施[J].中國畜牧獸醫文摘，2013，28(1)：69-75.

[2] Niu X，Fan T，Li W，et al.Protective effect of sanguinarine against acetic acid- induced ulcerative colitis in mice[J].Toxicol Appl Pharmcaol，2013，267(3)：256-265.

[3] Blackwell T S，Christman J W.The role of nuclear factor-κB in cytokine gene regulation[J].Am J Respir Cell Mol Biol，1997，17：3-9.

[4] Madan M Chaturvedi，Ashok Kumar，Bryant G Darnay，et al.Aggarwal Sanguinarine (Pseudochelerythrine) Is a Potent Inhibitor of NF-κB Activation，IkBa Phosphorylation，and Degradation[J].THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1997，272(48)：30129-30134.

[5] Rogler G，Andus T.Cytokines in inflammatory bowel disease[J].World J Surg，1998，22：382-389.

[6] Rogler G，Brand K，Vogl D，et al.Nuclear factor-κB is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinal mucosa[J].Gastroenterology，1998，115：537-569.

[7] Mitscher L A，Park Y H，Clark D，et al.Antimicrobial agents from higher plants.An investigation of Hunnemannia fumariaefolia pseudoalcoholates of sanguinarine and chelerythrine[J].Lloydia，1978，41：145-150.

[8] 徐麗，曾建國，程辟，等.血根堿-黃芩苷、白屈菜紅堿-黃芩苷離子對化合物體外抗菌活性和急性毒性研究[J].中南藥學，2012，10(1)：10-13.

[9] Steven E Newman，Michael J Roll.A naturally occurring compound for controlling powdery mildew of greenhouse roses[J].Hort Science，1999，34(4)：686-689.

[10] E Vrublova，J Vostalovea，J Ehrmann，et al.The phytogenic feed additive Sangrovit modulates dextran sulfate sodium-induced colitis in rats[J].Veterinarni Medicina，2010，55(12)：610-618.

[11] Hamed Laroui1，Sarah A Ingersoll，Hong Chun Liu.Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain Length Fatty Acids in the Colon[J].Plos One，2012，7(3)：1-12.

[12] 徐麗紅，肖芳，蘭小琴，等.葡聚糖硫酸鈉誘導 C57BL/6J 小鼠急性結腸炎模型的建立與評價[J].醫學研究生學報，2014，27(9)：918-922.

[13] 肖嫻，李秀瓊，刁建新，等.白芍總苷對葡聚糖硫酸鈉致大鼠實驗性結腸炎作用機制研究[J].佛山科學技術學院學報，2012，30(2)：78-81.

EffectsofSanguinarineonInflammatoryFactorsinRatColitisandInflammatoryPathway

LIU Yisong1，2，TANG Zhaoshan1，LIU Zhaoying1，2，JANG Haohang1，DUAN Zhigui3，ZENG Jianguo2，4*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.NationalandProvincialUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.CollegeofLifeScience，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China；4.HunanCo-innovationCenterforUtilizationofBotanicalsFunctionalIngredients，Hunan，Changsha410128，China)

Objective：To explore the regulatory effect of sanguinarine on inflammation，and provide the foundation for research of sanguinarine for its anti-inflammatory effect.MethodsWith dextran sulfate sodium induced colitis in rats as a model，the regulating mechanism of sanguinarine on rat body weight，diarrhea and colitis and the occult blood detection factor was observed.The expression of IL-1，IL-6，IL-10 and TNF-αin colonic tissue was analyzed by fluorescence quantitative PCR (qPCR).ResultsCompared with the model group，the nuclear factor p65 protein in the sanguinarine group significantly decreased.ConclusionSanguinarine can up-regulate IL-10 and down-regulate IL-1β，IL-6，and inhibits inflammation.The nuclear factor p65 was also down-regulated.

Sanguinarine；colitis；inflammatory factors；NF-κΒ(p65)

國家自然科學基金(31200615)；國家重點實驗室培育基地開放項目(15KFXM09)

*

曾建國，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.008

2017-02-26)