β-胡蘿卜素對脂多糖刺激的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白表達的影響①

李若楠 洪 盼 郎伍營 鄭 鑫

(吉林農業大學動物科學技術學院,長春 130118)

β-胡蘿卜素對脂多糖刺激的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白表達的影響①

李若楠 洪 盼 郎伍營 鄭 鑫

(吉林農業大學動物科學技術學院,長春 130118)

目的為研究β-胡蘿卜素對腸上皮細胞的抗炎作用機制。方法選用仔豬空腸上皮(IPEC-J2)細胞系建立體外細胞模型，將同一代數的IPEC-J2細胞分為4組(空白對照組、β-胡蘿卜素組、β-胡蘿卜素預保護組和脂多糖組)?？瞻讓φ战M不做處理，β-胡蘿卜素組和β-胡蘿卜素預保護組均進行β-胡蘿卜素預處理，脂多糖(LPS)組和β-胡蘿卜素預保護組均采用LPS刺激。MTT法檢測細胞活力；Western blot法檢測Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平。結果LPS組IPEC-J2細胞的緊密連接蛋白表達水平均低于空白對照組，且差異有統計學意義(P<0.05)，β-胡蘿卜素預保護組緊密連接蛋白表達水平顯著高于LPS組(P<0.05)。結論提高緊密連接蛋白表達水平可能是β-胡蘿卜素對空腸上皮細胞的抗炎作用的途徑之一。

β-胡蘿卜素；IPEC-J2細胞；脂多糖；緊密連接蛋白

腸上皮細胞的主要功能之一是擔任抵抗有害物質和病原微生物的屏障，腸道受損或通透性增強均可能促進細菌及致敏性物質通過腸黏膜進入機體，導致易感性傳染病和免疫應答[1]。腸上皮細胞的緊密連接是最重要的腸上皮細胞屏障，由緊密連接蛋白組成[2]。腸上皮細胞緊密連接蛋白主要包括閉合蛋白(Claudin)、鈣黏蛋白(Cadherin)、咬合蛋白(Occludin)、帶狀閉合蛋白(Zonula occludens，ZO)家族等[3]。腸上皮細胞緊密連接蛋白在保障正常的腸道功能中起關鍵作用。

此外，緊密連接蛋白和炎癥的關系有很多報道。S?derholm等[4]研究表明，在炎性腸病發生發展和破壞腸黏膜機械屏障中，緊密連接蛋白均起重要作用。Gassler等[5]發現，與正常人群相比炎癥性腸病患者腸組織的緊密連接蛋白表達顯著下降，而炎癥未累積的腸黏膜上皮緊密連接蛋白的表達無差異。

β-胡蘿卜素是維生素A的前體，具有抗氧化、增強機體免疫、調節炎癥反應、預防癌癥等功能，并且能夠促進細胞間連接通訊[6]。有研究發現β-胡蘿卜素能夠增強免疫系統中B細胞的活力，對于調節與炎癥反應和免疫調節相關的脂質過氧化物酶有一定作用，且能夠增加自然殺傷細胞和嗜中性粒細胞的數量，提高機體的免疫力[7]。本實驗室前期研究表明β-胡蘿卜素能夠提高IPEC-J2細胞間緊密連接，增強IPEC-J2的細胞活力，對遭受炎性反應損傷的IPEC-J2細胞具有一定能保護作用[8]。然而，β-胡蘿卜素對細胞緊密連接保護作用的分子機制尚不清楚。為探究β-胡蘿卜素對腸上皮細胞的抗炎作用是否是通過提高緊密連接蛋白表達而達到。我們將IPEC-J2細胞系添加β-胡蘿卜素進行預處理，采用脂多糖(LPS)刺激細胞發生炎癥反應建立體外細胞炎癥反應模型，通過檢測緊密連接蛋白表達水平而評價β-胡蘿卜素的抗炎作用。本研究為闡明β-胡蘿卜素的抗炎作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 仔豬空腸上皮(IPEC-J2)細胞系，來自吉林農業大學動物科學技術學院細胞分子生物學實驗室；β-胡蘿卜素、LPS、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液、TBST、脫脂奶粉、HRP標記抗兔IgG、HRP標記抗鼠IgG、ECL發光液等相關試劑均購于Sigma公司(美國)；DMEM-F12培養液、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司(美國)。β-actin鼠源抗體、Claudin4兔源多克隆抗體、Occludin兔源多克隆抗體、ZO-1兔源多克隆抗體購于Abcam公司(英國)。蛋白印記膜再生液購自Merck Millipore公司(美國)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞活力 復蘇IPEC-J2細胞，用含10%FBS胎牛血清的DMEM-F12培養液在37℃二氧化碳培養箱中擴大培養。將IPEC-J2細胞接種于96孔板，對β-胡蘿卜素不同劑量添加組(0、25、50、100、150、200 μmol/L)做1、3和6 h三個時間段的處理，每組5個重復，處理前將IPEC-J2細胞采用無血清培養液培養24 h。96孔板每孔加入100 μl濃度為1 mg/ml的MTT溶液培養0.5～1.5 h，棄掉培養液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標儀檢測OD值(波長492 nm)。

1.2.2蛋白提取 同上述方法培養IPEC-J2細胞系。將密度為每孔2×106～3×106個的IPEC-J2細胞接種至6孔板。分為4組(空白對照組、LPS組、β-胡蘿卜素組、β-胡蘿卜素預保護組)，每組3個重復。處理前將IPEC-J2細胞采用無血清培養液培養24 h。按照全蛋白提取試劑盒，用RIPA蛋白提取試劑盒提取各組蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。提取出的蛋白樣品保存在-20℃。

1.2.3Western blot試驗 每個樣本取約35 μg蛋白，電壓80 V 30 min后換電壓120 V 50 min 進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉法將蛋白轉至PVDF(孔徑0.22 μmol/L)膜，電流220 mA ，時間140 min。5%脫脂奶粉封閉37℃ 1 h，TBST洗3遍，每遍10 min。加入一抗，4℃過夜。次日TBST洗5遍，每遍10 min，加入HRP標記二抗(羊抗兔、羊抗鼠)37℃ 1 h后TBST洗3遍，每遍10 min，采用ECL發光液在凝膠成像儀上成像。為了檢測其他一抗，采用蛋白印記膜再生液37℃ 30 min洗去PVDF膜印記，5%脫脂奶粉封閉37℃ 1 h，TBST洗3遍，每遍10 min。重復上述步驟進行凝膠成像。

2 結果

2.1不同預處理時間和不同劑量的β-胡蘿卜素對IPEC-J2細胞活力影響 將無血清培養液培養24 h后的IPEC-J2細胞中加入濃度分別為0、25、50、100、150、200 μmol/L的β-胡蘿卜素處理1 h后檢測細胞活力。將不同濃度的β-胡蘿卜素處理IPEC-J2細胞3 h和6 h后檢測細胞活力。由圖1可知，β-胡蘿卜素處理3 h組，隨著β-胡蘿卜素濃度的升高，IPEC-J2細胞活力先升高后降低。在β-胡蘿卜素濃度為150 μmol/L時IPEC-J2細胞活力最強，顯著高于其他濃度組(P<0.05)。濃度在200 μmol/L時的IPEC-J2細胞活力最弱，與其他濃度組相比差異有顯著統計學意義(P<0.05)。β-胡蘿卜素處理1 h與6 h組，隨著β-胡蘿卜素濃度的升高，IPEC-J2細胞活力呈減弱趨勢。

圖1 不同預處理時間和不同劑量的β-胡蘿卜素對IPEC-J2細胞活力的影響Fig.1 Effects of different β-carotene pre-treatment time and dose on vitality of IPEC-J2 cells

2.2β-胡蘿卜素對LPS刺激的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白表達水平影響

2.2.1不同劑量β-胡蘿卜素對LPS刺激的IPEC-J2 Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平影響 探索不同劑量β-胡蘿卜素對Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平影響，試驗具體處理如下：(1)LPS組添加LPS(濃度為100 μg/ml)培養3 h；(2)β-胡蘿卜素組添加不同劑量的β-胡蘿卜素(濃度分別為0、25、50、100、150、200 μmol/L)處理3 h；(3)β-胡蘿卜素預處理組先添加不同劑量的β-胡蘿卜素(濃度分別為0、25、50、100、150、200 μmol/L)處理3 h后再添加LPS(濃度為100 μg/ml)培養3 h；(4)空白對照組不做處理。

由圖2可知，與空白對照組相比，LPS組IPEC-J2細胞ZO-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與 LPS組相比，β-胡蘿卜素濃度在100 μmol/L 和150 μmol/L時，β-胡蘿卜素預保護組IPEC-J2細胞ZO-1蛋白表達水平均顯著高于LPS組(P<0.05)。

由圖3可知，LPS組IPEC-J2細胞Occludin蛋白表達水平顯著低于空白對照組(P<0.05)。濃度為150 μmol/L的β-胡蘿卜素預保護組與LPS組相比，IPEC-J2細胞Occludin蛋白表達水平顯著高于LPS組(P<0.05)。

由圖4可知，與空白對照組相比，LPS組IPEC-J2細胞Claudin4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。濃度為150 μmol/L的β-胡蘿卜素預保護組IPEC-J2細胞Claudin4蛋白表達水平顯著高于LPS組(P<0.05)。

圖2 β-胡蘿卜素劑量對ZO-1蛋白表達水平影響Fig.2 Effects of β-carotene dose on expression of ZO-1 proteinNote: *.P<0.05.

2.2.2不同β-胡蘿卜素預處理時間對LPS刺激的IPEC-J2 Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平影響 為探究不同β-胡蘿卜素預處理時間對Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平影響，試驗分4組，具體處理如下：(1)LPS組添加LPS(濃度為100 μg/ml)培養3 h；(2)β-胡蘿卜素組添加濃度為150 μmol/L的β-胡蘿卜素分別做1 h、3 h和6 h三個時間段的處理；(3)β-胡蘿卜素預處理組先添加濃度為150 μmol/L的β-胡蘿卜素分別做1 h、3 h和6 h三個時間段的處理后再添加LPS(濃度為100 μg/ml)培養3 h；(4)空白對照組不做處理。

由圖5可知，β-胡蘿卜素預處理3 h時，β-胡蘿卜素預保護組IPEC-J2細胞ZO-1蛋白表達水平高于空白對照組，與LPS組相比顯著升高(P<0.05)。而β-胡蘿卜素預處理1 h和6 h時，β-胡蘿卜素預保護組IPEC-J2細胞ZO-1蛋白表達水平高于LPS組但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 β-胡蘿卜素劑量對Occludin蛋白表達水平影響Fig.3 Effects of β-carotene dose on expression of Occludin proteinNote: *.P<0.05.

圖4 β-胡蘿卜素劑量對Claudin 4蛋白表達水平影響Fig.4 Effects of β-carotene dose on expression of Claudin 4 proteinNote: *.P<0.05.

圖5 β-胡蘿卜素預處理時間對ZO-1蛋白表達水平影響Fig.5 Effects of β-carotene pre-treatment time on expression of ZO-1 proteinNote: *.P<0.05.

圖6 β-胡蘿卜素預處理時間對Occludin蛋白表達水平影響Fig.6 Effects of β-carotene pre-treatment time on expre-ssion of Occludin proteinNote: *.P<0.05.

由圖6可知，β-胡蘿卜素預處理3 h時，β-胡蘿卜素保護組IPEC-J2細胞Occludin蛋白表達水平顯著高于LPS組(P<0.05)，低于空白對照組且差異無統計學意義(P>0.05)。而β-胡蘿卜素預處理1 h和6 h時，β-胡蘿卜素保護組IPEC-J2細胞Occludin蛋白表達水平與LPS組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖7 β-胡蘿卜素預處理時間對Claudin4蛋白表達水平影響Fig.7 Effects of β-carotene pre-treatment time on expression of Claudin4 proteinNote: *.P<0.05.

由圖7可知，β-胡蘿卜素預處理3 h時，β-胡蘿卜素預保護組IPEC-J2細胞Claudin4蛋白表達水平高于空白對照組且差異無統計學意義(P>0.05)，與LPS組相比有統計學意義(P<0.05)。β-胡蘿卜素預處理1 h和6 h時，β-胡蘿卜素預保護組與LPS組相比IPEC-J2細胞Claudin4蛋白表達水平高于LPS組但差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

腸道不但是消化吸收營養物質的重要場所，同時它也是機體重要的免疫器官，是抵抗有害物質和病原微生物的屏障[9]。腸道內環境穩態對于人和動物的健康具有重要意義。腸道黏膜免疫、上皮細胞完整性、腸道菌群和營養物質之間復雜互作均能夠高度調節腸道內環境穩態[10]。腸道黏膜屏障是機體重要的防御機制，腸黏膜屏障完整性對維持腸上皮細胞通透性和機體內環境穩態起關鍵作用。腸黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學屏障四部分構成。完整的腸黏膜屏障可選擇性透過離子和小分子物質，防止病原微生物等大分子通過腸腔進入細胞內，從而維護腸上皮細胞通透性及腸黏膜屏障功能[11-13]。腸上皮細胞間緊密連接是最為重要的腸上皮細胞屏障。

β-胡蘿卜作為維生素A源，具有增強機體對炎癥反應的調節能力。本實驗室前期研究表明，β-胡蘿卜素對炎性反應損傷的IPEC-J2細胞有一定保護作用，并能夠提高IPEC-J2細胞間緊密連接[8]。任勃等[14]研究表明β-胡蘿卜素有益于對慢支的抗炎作用。Lin等[15]研究發現β-胡蘿卜素對于感染性炎性疾病有有一定的預防作用，對病毒感染的抗炎作用也不容忽視。

眾多上皮細胞緊密連接蛋白分子構成上皮細胞緊密連接，其中Occludin、Claudins、ZO-1蛋白尤為重要。Occludin與上皮細胞緊密連接的形成密切相關，是最為重要的結構蛋白。Claudins是構成緊密連接線的主要成分。ZO-1在形成穩定的連接系統中扮演重要角色[16-18]。腸上皮細胞通透性及屏障功能的破壞會導致病原微生物進入機體造成局部甚至全身性炎癥反應，嚴重可導致多器官功能障礙而引起死亡。

本試驗通過在IPEC-J2細胞培養過程中加入β-胡蘿卜素預保護后用LPS刺激細胞發生炎癥反應，導致腸上皮細胞緊密連接受損，細胞通透性增加，以此建立體外腸黏膜屏障損傷模型。通過Western blot方法檢測IPEC-J2細胞Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平，發現LPS組Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平顯著低于空白對照組，而β-胡蘿卜素預保護組Occludin、Claudin4、ZO-1蛋白表達均明顯高于LPS組。此外，一定劑量的β-胡蘿卜素能夠提高β-胡蘿卜素組中IPEC-J2細胞Claudin4和ZO-1蛋白的表達水平。說明LPS刺激可能導致腸上皮細胞屏障功能異常，造成腸上皮細胞緊密連接缺失、減少，而一定劑量的β-胡蘿卜素能夠提高空腸上皮細胞Claudin4、ZO-1蛋白表達水平，并對LPS誘發的空腸上皮細胞炎癥反應中Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白具有一定的保護作用。據此，我們推測，提高緊密連接蛋白表達水平可能是β-胡蘿卜素對空腸上皮細胞的抗炎作用的途徑之一。

綜上所述，β-胡蘿卜素能夠促進空腸上皮細胞Claudin4和ZO-1緊密連接蛋白表達，能夠提高LPS誘發的空腸上皮細胞炎癥反應中Occludin、Claudin4、ZO-1緊密連接蛋白表達水平。提高緊密連接蛋白表達水平可能是它對空腸上皮細胞的抗炎作用的途徑之一。

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[收稿2017-02-28]

(編輯 許四平 劉格格)

Effectsofβ-caroteneonexpressionofcelltightjunctionproteinofIPEC-J2withLPS-stimulated

LIRuo-Nan,HONGPan,LANGWu-Ying,ZHENGXin.

CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China

Objective:To investigate the mechanism of β-carotene anti-inflammatory on intestinal epithelial cells.MethodsThe piglet jejunum epithelium(IPEC-J2)cell line was used as an cell model.The cells were divided into 4 groups[control group,β-carotene group,β-carotene pre-protective group and Lipopoly-saccharide(LPS)group].The control group was not treated,β-carotene group and β-carotene pre-protective group were pretreated with β-carotene.Lipopoly-saccharide(LPS)and β-carotene pre-protective groups were stimulated with LPS.The cell viability was detected by MTT.Western blot was performed to detect the expression of Occludin,Claudin4 and ZO-1 tight junction proteins.ResultsThe expression of IPEC-J2 cell tight junction protein in LPS group were significantly lower than that of the control group(P<0.05).The expression of tight junction protein in β-carotene pre-protective group was significantly higher than that in LPS group(P<0.05).ConclusionIncreasing the expression of tight junction proteins may be one of the ways that anti-inflammatory effect of β-carotene in jejunum epithelial cells.

β-carotene;IPEC-J2 cell;LPS;Tight junction protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.003

①本文為國家自然基金項目資助項目(31672511)。

S828

A

1000-484X(2017)11-1611-05

李若楠(1992年-)，女，在讀博士，主要從事細胞分子生物與免疫研究，E-mail：312612284@qq.com。

及指導教師：鄭 鑫(1965年-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事動物營養與免疫調控及動物細胞生物學研究，E-mail：zhengxinjilin@126.com。