DEC1基因shRNA慢病毒表達載體的構建及其穩轉膠質瘤細胞系的建立

魏學輝 李曉明 張耀 茹懿 王秦豪 李霞* 林偉*

(第四軍醫大學: 1西京醫院神經外科; 2基礎部生物化學與分子生物學教研室，陜西 西安 710032)

·腦膠質細胞瘤研究·

DEC1基因shRNA慢病毒表達載體的構建及其穩轉膠質瘤細胞系的建立

魏學輝1李曉明1張耀1茹懿2王秦豪2李霞2*林偉1*

(第四軍醫大學:1西京醫院神經外科;2基礎部生物化學與分子生物學教研室，陜西 西安 710032)

目的構建人分化型胚胎軟骨發育基因1 (DEC1)的短發卡RNA (shRNA)慢病毒表達載體并建立穩定敲減DEC1表達的人腦膠質瘤細胞株T98G。方法根據GenBank中DEC1基因cDNA序列設計合成兩條特異性shRNA序列，同時設計1條非特異性序列作為陰性對照，分別克隆到Psi-LVRU6MP質粒載體內，經酶切電泳、DNA測序鑒定后包裝成慢病毒顆粒。再以3組慢病毒感染膠質瘤細胞系T98G，用嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察mCherry的表達，Western Blot檢測各組DEC1蛋白的表達水平。結果DEC1基因 shRNA慢病毒表達載體經酶切、測序鑒定證實克隆正確。熒光顯微鏡檢測顯示各組細胞均已被慢病毒高效感染。Western Blot結果顯示，兩干擾組細胞各自DEC1蛋白表達水平明顯低于未處理組和陰性對照組，分別占未處理組的39.47%±0.69%和41.17%±0.89% (Plt;0.05)，但兩干擾組之間無顯著性差異(Pgt;0.05)；陰性對照組與未處理組相比亦無明顯差異(Pgt;0.05)。結論成功構建DEC1基因shRNA慢病毒表達載體，感染膠質瘤T98G細胞系獲得成功。兩干擾組慢病毒均能明顯敲減目的基因DEC1的表達，為進一步研究DEC1在膠質瘤細胞系T98G中的生物學功能和作用機制提供了實驗基礎。

分化型胚胎軟骨發育基因1; 短發卡RNA; 慢病毒表達載體; 膠質瘤

人分化型胚胎軟骨發育基因1 (differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1, DEC1) 是由Shen等[1]1997年首次從人類胚胎軟骨組織分離得到，是堿性螺旋-環-螺旋 (basic helix-loop-helix, bHLH) 轉錄因子家族成員[2-3]。DEC1參與軟骨形成[4]、免疫反應[5]、生物節律[6]、脂肪形成[7]等重要生理過程。且研究表明，DEC1作為癌基因，在結腸癌、肺癌、腎癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中顯著高表達，與部分腫瘤的惡性級別呈正相關[8-9]。特定腫瘤組織中DEC1的表達可被多種有害刺激所誘導，還與腫瘤的缺氧狀態密切相關[10]。這些發現提示DEC1與腫瘤惡性表型密切相關，且在腫瘤發生、發展中發揮著重要作用。DEC1在膠質瘤中的作用尚未報道。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由小干擾RNA (small interfeing RNA, siRNA)誘發的特定基因沉默，是細胞固有的對抗外源性核酸的一種自我保護現象，在生物體內普遍存在。RNAi主要發生在基因轉錄后mRNA的修飾或翻譯水平上，具有特異性、高效性和長久性的特點[11]?；诖说腞NAi技術因在基因功能研究以及腫瘤等疾病的基因治療中具有潛在應用價值而受到人們的關注。本研究設計構建了針對人DEC1基因的特異性短發卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核慢病毒表達載體，用此載體質粒先轉染293T細胞獲得病毒上清后，再感染人膠質瘤細胞T98G，鑒定并篩選穩定的細胞株，為下一步研究敲減DEC1表達后對膠質瘤細胞生物學行為及對化療藥替莫唑胺敏感性的影響等研究提供實驗基礎。

材料與方法

一、材料

1.細胞系、菌種、質粒：人腦膠質母細胞瘤T98G細胞源自美國模式培養物收集中心(American type culture collection, ATCC)，并由第四軍醫大學西京醫院神經外科研究所保存。大腸桿菌DH5α感受態細胞由第四軍醫大學基礎部生物化學與分子生物學教研室提供。慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G，psi-LVRU6MP質粒 (含嘌呤霉素抗性基因、氨芐霉素抗性基因) shRNA 載體(圖1)購自GeneCopoeia公司。

2.主要試劑：限制性核酸內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、NheⅠ、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)及PCR試劑盒、聚凝胺(polybrene)為日本TaKaRa公司產品；質粒提取試劑盒及凝膠回收純化試劑盒為U-gene 公司產品；Lipofectamine 2000、puromycin及Trizol均為美國Invitrogen公司產品；兔抗人DEC1多克隆抗體為Abcam公司產品。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單抗及 Western blot試劑盒為美國Sigma公司產品。

二、方法

1.人DEC1基因特異性shRNA片段的設計及合成：根據 GenBank中DEC1基因的 cDNA序列(NM_003670.1)和干擾載體的設計要求，利用生物信息學及莖環結構的特點，選擇2段靶序列，并在其上游引物引入BamHⅠ酶切位點，下游引物引入EcoRⅠ酶切位點，設計序列為DEC1-shRNA-1和DEC1-shRNA-2，同時設計1條經Blast檢索與現有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列為 陰性對照序列Negative-shRNA，最終合成3對含莖環結構的正義與反義寡核苷酸鏈ssDNA (單鏈DNA)。DEC1-shRNA-1的正義鏈：5'-GATCCG-GGCGCAATTAAGCAAGAGTCC-TCAAGAG-GGACTCTTGCTTAATTGCGCC-TTTTTTGGAATT-3';反義鏈:5'-AATTCCAAAAAA-GGCGCAATTAAGCAA GAGTCC-CTCTTGA-GGACTCTTGCTTAATTGCGCC-CGGATC-3'。DEC1-shRNA-2的正義鏈：5'-GATCCG-GCAAGATTGTTGCATTGTGTA-TCAAGAG-TACACAATGCAACAATCTTGC-TTTTTTGGAATT-3';反義鏈:5'-AATTCCAAAAAA-GCAAGATTGTTGCATTGTGTA-CTCTTGA-TACACAATGCAACAATCTTGC-CGGATC-3'。陰性對照序列Negative-shRNA的正義鏈：5'-GATCCG-GCTTCGCGCCGTAGTCTTA-TCAAGAG-TAAGACTACGGCGCGAAGC-TTTTTTGGAATT-3';反義鏈:5'-AATTCCAAAAAA-GCTTCGCGCCGTAGTCTTA-CTCTTGA-TAAGACTACGGCGCGAAGC-CGGATC-3'，序列由上海生工生物工程公司合成。

2.psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA重組質粒載體構建：將上述3對單鏈寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切線性化psi-LVRU6MP質粒載體。利用T4 DNA連接酶連接線性psi-LVRU6MP質粒載體和退火形成的雙鏈DNA序列。連接產物經大腸桿菌感受態細胞DH5α轉化提取質粒后，以限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NheⅠ行雙酶切，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定正確的質粒命名為：psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-1和psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-2，psi-LVRU6MP-Negative。將鑒定證實后的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序鑒定。

3.慢病毒顆粒的包裝：分別將包裝質粒psPAX2(7.5 μg)、pMD2.G(2.5 μg)以及上述重組質粒載體中的一種(10 μg)混合于1200 μL無血清DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)液中，室溫下溫育5 min。同時將Lipofectamine 2000(40 μL)混合于1000 μL無血清DMEM液中，室溫下溫育5 min。將上述室溫下稀釋的質?；旌弦悍謩e與Lipofectamine 2000稀釋液混合，室溫下溫育20 min后加入已接種293T細胞的培養皿中，調整體積至10 mL，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。6 h后換含10%胎牛血清的新DMEM培養基繼續培養。轉染48 h后，收集細胞上清液，-80 ℃保存。分別命名為DEC1-shRNA-1病毒，DEC1-shRNA-2病毒和陰性對照Negative-shRNA 病毒。

圖1 psi-LVRU6MP載體的結構

Fig 1 Map of the psi-LVRU6MP vector

圖2 重組質粒載體的酶切電泳鑒定

Fig 2 The identification of recombinant plasmid vector by enzyme digestion and electrophoresis

A: psi-LVRU6MP-Negative plasmid vector; B: psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-1 plasmid vector; C: psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-2 plasmid vector.

M: DL10000 Marker.

圖3 重組質粒載體psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA測序鑒定(下劃線為DEC1基因特異性shRNA序列)

Fig 3 The identification of the recombinant plasmid vector psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA by DNA sequencing (shRNA sequence targeting DEC1 gene were underlined)

A: psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-1 plasmid vector; B: psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-2 plasmid vector.

圖4 熒光顯微鏡觀察各組慢病毒感染的T98G細胞mcherry的表達(×40; 上：熒光視野;下：明場視野)

Fig 4 Fluorescence microscopy was used to observe the expression of mCherry in T98G cells infected with shRNA lentivirus (×40; Up: Fluorescence field; Down: Bright field of vision)

A: Fluorescence field of vision of untreated group; B: Flourescence field of vision of negative group; C: Flourescence field of vision of shRNA-1 group; D: Flourescence field of vision of shRNA-2 group; E: Bright field of vision of untreated group; F: Bright field of vision of negative group; G: Bright field of vision of shRNA-1 group; H: Bright field of vision of shRNA-2 group.

4.穩定轉染T98G膠質瘤細胞系的建立：將上述三種病毒液各1 mL分別加入含有T98G細胞的6孔板中，再各加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液，另每孔加入聚凝胺(polybrene)，使其終濃度為8 μg/mL，以促進感染。同時設立T98G的未處理對照組。感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(mCherry)的表達情況，初步評估各病毒液的感染效率。用含puromycin(0.8 μg/mL)的DMEM完全培養基持續篩選4 w，待不再有細胞死亡后，維持0.8 μg/mL的puromycin壓力篩選，等待干擾效果鑒定。

5.Western Blot檢測T98G穩轉膠質瘤細胞DEC1蛋白的表達：收集6 cm培養皿中T98G未處理組、DEC1-shRNA-1組、DEC1-shRNA-2組、陰性對照組Negative-shRNA細胞，用RIPA裂解細胞，提取蛋白后行蛋白定量。蛋白提取液中加入1/4體積的5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)凝膠上樣緩沖液，沸水中煮5 min，按照蛋白定量結果加樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min后，轉膜2 h，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane, NC)上。5%脫脂奶室溫封閉NC膜1 h，加入一抗DEC1多克隆抗體(1 ∶5000)或GAPDH單克隆抗體(1 ∶3000)4 ℃封閉過夜。TBST緩沖液(tris buffered saline tween, TBST)洗滌3次，每次10 min，分別加入AP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(均為1 ∶5000)室溫孵育1 h，TBST洗滌后AP顯色。

結 果

一、psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA的構建和鑒定

將合成的三對寡核苷酸鏈經退火后形成三條雙鏈DNA片段，將上述片段從BamHⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點克隆到質粒載體psi-LVRU6MP中，新的質粒命名：psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA1、psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA-2和psi-LVRU6MP-Negative。用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NheⅠ對上述3個質粒載體進行雙酶切，得到3463 bp和4894 bp 兩條片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳，初步證明克隆正確(圖2)。將陽性克隆送DNA測序證實干擾載體中特異性干擾序列完全正確(圖3)。

二、慢病毒感染T98G膠質瘤細胞熒光顯微鏡下觀察

本實驗選用的干擾質粒載體psi-LVRU6MP含有報告基因mCherry，其表達的mCherry蛋白能在熒光顯微鏡下顯現肉眼可見的紅色熒光。慢病毒感染的T98G膠質瘤細胞系，其DEC1-shRNA-1組和DEC1-shRNA- 2組以及Negative-shRNA陰性對照組細胞在倒置熒光顯微鏡下均可見明顯的紅色熒光，而未感染的T98G細胞組未見到紅色熒光，表明這3種病毒均能高效感染膠質瘤細胞T98G (圖4)。

三、Western Blot檢測T98G各組細胞DEC1蛋白的表達量

Western Blot 結果(重復3次)顯示：DEC1-shRNA-1和DEC1-shRNA-2組T98G細胞的DEC1表達量明顯低于未處理組和陰性對照組Negative-shRNA。DEC1-shRNA-1組是未處理組的39.47%±0.69%(t=87.27,P=0.0001)，DEC1-shRNA-2組是未處理組的41.17%±0.89%(t=66.29,P=0.0002)，而DEC1-shRNA-1組和DEC1-shRNA-2組之間無顯著性差異(t=3.09,P=0.09)；陰性對照組與未處理組相比亦無明顯差異(t=2.47,P=0.13)(圖5)，說明DEC1基因表達的敲減效果明顯，敲減DEC1基因表達的T98G膠質瘤穩轉細胞系建立成功。

圖5 Western Blot 檢測DEC1蛋白在T98G各組細胞中的表達

Fig 5 Detection of DEC1 protein expression in T98G cells of each group by Western Blot

A: DEC1 protein expression in each group of T98G cells by Western Blot; B: Statistical analysis of DEC1 protein expression in T98G cells of each group of (n=3)

aPlt;0.05,vsuntreated group.

討 論

DEC1基因在不同的哺乳動物中有不同的命名。Shen[1]在人類軟骨細胞分化的原代培養中誘導的人類基因命名為DEC1，Boudjelal[2]在小鼠胚胎癌性細胞誘導表達的同源基因命名為Stral3，Rossner在大鼠分化的神經元中發現DEC1 的同源基因命名為SHARP-2[3]。DEC1基因位于人類染色體3p25.3-26 上，大約5.7 Kb，包含5個外顯子和4個內含子，DEC1啟動子區域包括多個GC盒而非TATA盒，在轉錄因子數據庫中發現其5'端區域有多個轉錄因子結合位點，其中包括cAMP應答元件及多個 E-box[12]。DEC1蛋白由412個氨基酸組成，可被血清饑餓、缺氧、全反維甲酸等細胞外刺激誘導表達，參與細胞分化和凋亡、 周期調節等。研究發現DEC1在很多腫瘤如白血病、結腸癌、肺腺癌、腎癌等組織中存在高表達，可調控腫瘤生長、凋亡相關因子[13]的表達，因而參與腫瘤的發生發展。

由于神經細胞的不可分裂特性，使基因導入系統的選擇受到了限制，傳統的逆轉錄病毒不能感染非分裂細胞，而腺病毒不能整合入宿主細胞基因組，因此都存在一定的缺陷，而慢病毒載體可以有效解決以上問題。慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，病毒能在體內、外高效感染分裂細胞和非分裂細胞并整合入基因組，故由慢病毒載體介導而導入的目的基因可以在神經細胞[14-15]中得到長期而穩定的表達。這些優勢是其它病毒介導的外源基因傳遞系統所無可比擬的。因此，慢病毒載體目前被認為是神經系統比較適合的載體系統。本實驗成功構建了慢病毒干擾質粒載體psi-LVRU6MP-DEC1-shRNA，與輔助質粒共轉染293T細胞獲得病毒上清，感染T98G膠質瘤細胞系后，DEC1-shRNA-1組和DEC1-shRNA-2組以及Negative-shRNA陰性對照組細胞在倒置熒光顯微鏡下均可見明顯的紅色熒光，表明該慢病毒系統能高效感染神經膠質瘤細胞。Western Blot結果顯示DEC1-shRNA-1組和DEC1-shRNA-2組細胞中DEC1表達水平較對照組明顯降低，說明穩定敲減DEC1的T98G細胞系建立成功。

1SHEN M, KAWAMOTO T, YAN W, et al. Molecular characterization of the novel basic helix-loop-helix protein DEC1 expressed in differentiated human embryo chondrocytes [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 236(2): 294-298.

2BOUDJELAL M, TANEJA R, MATSUBARA S, et al. Overexpression of Stra13, a novel retinoic acid-inducible gene of the basic helix-loop-helix family, inhibits mesodermal and promotes neuronal differentiation of P19 cells [J]. Genes Dev, 1997, 11(16): 2052-2065.

3ROSSNER M J, DORR J, GASS P, et al. SHARPs: mammalian enhancer-of-split- and hairy-related proteins coupled to neuronal stimulation [J]. Mol Cell Neurosci, 1997, 10(3-4): 460-475.

4JINHUA H, ZHAO M, WEI S, et al. Down regulation of differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1 is related to the decrease of osteogenic capacity [J]. Curr Drug Targets, 2014, 15(4): 432-441.

5MIYAZAKI K, MIYAZAKI M, GUO Y, et al. The role of the basic helix-loop-helix transcription factor Dec1 in the regulatory T cells [J]. J Immunol, 2010, 185(12): 7330-7339.

6NAKASHIMA A, KAWAMOTO T, HONDA K K, et al. DEC1 modulates the circadian phase of clock gene expression [J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(12): 4080-4092.

7SHEN L, CUI A, XUE Y, et al. Hepatic differentiated embryo-chondrocyte-expressed gene 1 (Dec1) inhibits sterol regulatory element-binding protein-1c (Srebp-1c) expression and alleviates fatty liver phenotype [J]. J Biol Chem, 2014, 289(34): 23332-23342.

8ZHENG Y, JIA Y, WANG Y, et al. The hypoxia-regulated transcription factor DEC1 (Stra13, SHARP-2) and its expression in gastric cancer [J]. OMICS, 2009, 13(4): 301-306.

9SHI X H, ZHENG Y, SUN Q, et al.DEC1 nuclear expression: a marker of differentiation grade in hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(15): 2037-2043.

10ZHENG Y, SHI X, WANG M, et al. The increased expression of DEC1 gene is related to HIF-1alpha protein in gastric cancer cell lines [J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(4): 4229-4236.

11DAVIDSON B L, BOUDREAU R L. RNA interference: a tool for querying nervous system function and an emerging therapy [J]. Neuron, 2007, 53(6): 781-788.

12TERAMOTO M, NAKAMASU K, NOSHIRO M, et al. Gene structure and chrom- osomal Location of a Human bHLH Transcriptional Factor DECIxStral3xSHARP-2/BHLHB2 [J]. J Biochem, 2001, 129(3): 391-396.

13LI Y, ZHANG H, XIE M, et al. Abundant expression of Dec1/stra13/sharp2 in colon carcinoma: its antagonizing role in serum deprivation-induced apoptosis and selective inhibition of procaspase activation [J]. Biochem J, 2002, 367(Pt 2): 413-422.

14CAO S, WU C, YANG Y, et al. Lentiviral vector-mediated stable expression of sTNFR-Fc in human macrophage and neuronal cells as a potential therapy for neuro AIDS [J]. J Neuroinflammation, 2011, 8(5): 48-54.

15李曉明, 林偉, 章翔, 等. 基于GatewayTM系統Dec1慢病毒表達載體的構建 [J]. 中華神經外科疾病研究雜志, 2013, 12(2): 126-129.

ConstructionofshRNAlentiviralexpressionvectorofDEC1geneandestablishmentofitsstabletransfectiongliomacellline

WEIXuehui1,LIXiaoming1,ZHANGYao1,RUYi2,WANGQinhao2,LIXia2,LINWei1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicine,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1(DEC1)-short hairpin RNA (shRNA) lentiviral expression vector and stably knock down DEC1 in human glioma cell line T98G were constructed.MethodsAccording to the cDNA sequence of the DEC1 gene provided by the GenBank, two specific shRNA sequences were designed and synthesized. A non-specific sequence was designed as negative control. They were cloned into the Psi-LVRU6MP plasmid vector. After the recombinant vectors were identified by enzyme digestion and DNA sequencing, they were packaged to obtain the lentiviral particles. Then T98G glioma cell line was infected with the three groups of lentivirus. After screening with puromycin, the expression of mCherry was observed under the fluorescence microscope, and the expression level of DEC1 protein in each group was detected by Western Blot.ResultsshRNA lentiviral expression vector targeting DEC1 gene was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Fluorescence microscopy showed that each group of cells had been efficiently infected by shRNA lentivirus. Western Blot results showed that DEC1 protein levels in the two DEC1-shRNA groups were significantly down-regulated compared with the untreated group and the negative control group, accounting for 39.47%±0.69% and 41.17%±0.89% of the untreated group, respectively (Plt;0.05). But there were no significant differences either between two DEC1-shRNA groups or between the negative control and the untreated group (Pgt;0.05).ConclusionThe DEC1-shRNA lentiviral expression vector was successfully constructed and stably infected into human glioma T98G cell line. Both groups of DEC1-shRNA lentivirus could markedly suppressed the expression of target gene DEC1. The results provide the experimental basis for further study of DEC1 function and mechanism in the human glioma cell line T98G.

DEC1 gene; Short hairpin RNA; Lentiviral expression vector; Glioma

1671-2897(2017)16-015-05

R 739.41

A

國家自然科學基金資助項目(81572469)

魏學輝，碩士研究生，E-mail: wxh296@sohu.com

*通訊作者： 林偉，副教授、副主任醫師，E-mail: linwei@fmmu.edu.cn；李霞，副教授，E-mail: lixia@fmmu.edu.cn

2016-08-18；

2016-10-30)