甘草查爾酮A對膠質瘤的增殖抑制及促凋亡作用機制研究

王玖 羅鵬 張磊 鄭新瑞 戴舒惠 楊悅凡 饒維 彭程 李娟 馬文科 費舟

(第四軍醫大學西京醫院神經外科，陜西 西安 710032)

·腦膠質細胞瘤研究·

甘草查爾酮A對膠質瘤的增殖抑制及促凋亡作用機制研究

王玖 羅鵬 張磊 鄭新瑞 戴舒惠 楊悅凡 饒維 彭程 李娟 馬文科 費舟*

(第四軍醫大學西京醫院神經外科，陜西 西安 710032)

目的探討甘草查爾酮A(LCA)對人膠質瘤U87、U251細胞的增殖抑制和促凋亡作用及其機制研究。方法通過四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖抑制作用，并計算出半數抑制濃度(IC50)，按IC50和100 μM不同濃度進行分組。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞術檢測細胞凋亡以及Western Blot從蛋白水平檢測凋亡相關分子的改變情況。結果MTT顯示LCA對人膠質瘤U87、U251細胞具有明顯的增殖抑制作用，呈濃度及時間依賴性，LCA對U87、U251細胞48 h的IC50值分別為61.54 μM和53.02 μM，倒置顯微鏡下觀察細胞密度減少，形態發生明顯改變。流式細胞術結果顯示，LCA可促進膠質瘤U87、U251的細胞凋亡(Plt;0.01)。Western Blot結果顯示，LCA干預后可顯著降低膠質瘤U87、U251細胞內Bcl-2的表達(Plt;0.01)，相反，增加Bax的表達(Plt;0.05)，呈濃度依賴性。結論LCA對膠質瘤U87、U251細胞具有明顯的增殖抑制作用，可能通過內源性凋亡途徑誘導其凋亡。

膠質細胞瘤; 甘草查爾酮A; 增殖抑制; 凋亡

膠質瘤是原發性腦腫瘤中的一種常見類型，包括星形細胞瘤，少突膠質細胞瘤和室管膜瘤。根據世界衛生組織(World Health Organization, WHO)標準，膠質瘤分為4個等級，包括毛細胞性星形細胞瘤(I級)，彌散性星形細胞瘤(II級)，間變性星形細胞瘤(III級)以及多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiform, GBM；IV級)[1]?，F今，在治療膠質瘤方面，手術聯合放、化療仍是標準的治療方案，因為單一手術很難完全切除腫瘤，且復發率高，必須輔以術后放、化療殺傷殘余腫瘤細胞，然而，膠質瘤的化療依然存在許多局限性。因此，急需革新治療理念，研發新型藥物來有效殺傷膠質瘤細胞，降低復發率及死亡率，提高生活質量以及改善預后等。目前，中草藥是研發新藥的主要來源，也是現代醫學中治療疾病的首選之一，研究中草藥抗腫瘤作用的活性成分以及具有副作用小等優勢為治療腫瘤提供了新思路與新方法[2]。甘草是非常有名的傳統中藥材(traditional Chinese medicine, TCM)之一，早在公元前2100年就有記載，其含有多達20種三萜類化合物以及將近300種黃酮類化合物等[3]。甘草根部的主要活性提取物-查爾酮，具有多種藥理學作用[4]，還有抑制細胞增殖，誘導周期停滯及誘發腫瘤細胞凋亡等特性[5]。甘草查爾酮A(licochalcone A, LCA)是查爾酮的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗瘧疾、抗血管生成、抗腫瘤及抑制腫瘤遠處轉移等特性[6]。此研究中，我們探討LCA對人膠質瘤U87、U251細胞的增殖抑制以及闡明其促凋亡的潛在分子機制。

材料與方法

一、主要試劑及抗體

人源性膠質瘤細胞系U87、U251購自于美國標準細胞庫(American type culture collection，ATCC)。LCA藥粉(分子式：C21H22O4，分子量：338.40)購自于Sigma公司(產品貨號為68783)，純度≥96.0%。用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶解配成100 mmol/L儲存液(所含DMSO濃度均lt;1‰，無細胞毒性)，置于-20 ℃凍存。杜伯改良的依格培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)、雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)和胰蛋白酶由Gibco公司提供，新生胎牛血清由杭州四季青公司提供。兔源性Bcl-2、兔源性Bax，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗，均購于CST公司。四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl terrazaium, MTT)、流式檢測試劑盒為Sigma公司產品。

二、細胞培養

膠質瘤U87、U251細胞常規置于于含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM中， 37℃、5%CO2的孵箱中培養，每1～2 d更換一次培養基。當細胞生長密度達到70%～85%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶2或1 ∶3比例傳代，繼續培養。

三、細胞活力

取對數期U87、U251細胞，經0.25%胰酶消化后，通過細胞計數將濃度調整至2×105個/mL接種于96孔板，每孔體積100 μL，過夜貼壁。將LCA加入DMEM中配制不同濃度的藥物，使其終濃度為20、40、60、80、100、120 μM，每個濃度設6個復孔，空白對照組沒有細胞，對照組為正常細胞但未加LCA處理，其他處理與藥物組相同。37 ℃、5%CO2的孵箱培養24或48 h后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min。酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度(optical density, OD)值。按照公式計算抑制率：抑制率=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。

四、倒置顯微鏡觀察LCA處理U87、U251細胞后的形態改變

取對數期U87、U251細胞傳代培養，貼壁后更換為含有終濃度為IC50及100 μM LCA的DMEM，作用24 h后，在顯微鏡下觀察細胞的變化情況。

五、流式細胞儀檢測細胞凋亡

將U87、U251細胞按密度為2×105個/mL接種于6孔板，培養過夜后，換成含有終濃度為IC50及100 μM LCA的DMEM繼續培養24 h，消化收集細胞置于離心管中，并用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered solution, PBS)洗滌。用配置好的1×結合緩沖液(1×binding buffer)洗滌重懸細胞，將密度調整為1×106～5×106個/mL，取100 μL細胞懸液，加入5 μL膜聯蛋白-V(Annexin-V)標記的異硫氰酸熒光素(fluoresein isothiocyanate, FITC)反應液后室溫避光孵育15～20 min，1×binding buffer 洗滌重懸細胞后再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)反應液，混勻室溫孵育10 min，上機待測。

六、蛋白質免疫印跡檢測(Western Blot)

取對數期U87、U251細胞，分別設DMSO對照組和IC50、100 μM濃度組進行藥物干預，作用24 h后，小心吸凈培養皿中培養液，用4 ℃預冷PBS洗1～2遍，然后加入含有1%蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解細胞，12000 r/min 離心20 min后吸上清提取蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒以570 nm于酶標儀測定蛋白含量，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacry lamidegel electrophoresis, SDS-PAGE)分離，上樣量為20 μg，再轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用Bcl-2一抗(1 ∶1000)、Bax一抗(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶4000)一抗4 ℃孵育過夜。用配置好的含0.1%Tween20的PBS(phosphate-buffered solution tween, PBST)充分洗膜，二抗室溫孵育1 h，再用PBST洗膜后發光顯色，用Gel-pro軟件分析各條帶灰度值與相應β-actin的灰度值的比值作統計分析。

七、統計學方法

結 果

一、LCA對U87、U251細胞的增殖抑制

通過MTT實驗測定LCA的細胞毒性，數據表明，不同濃度LCA(20、40、60、80、100或120 μM)對U87、U251細胞的增殖抑制作用具有顯著的濃度及時間依賴性(圖1)。LCA作用后顯著抑制兩種細胞系的生長，降低生存力。藥物處理48 h后，60、100 μM濃度LCA對U87、U251細胞的活性抑制率分別為66.57%和66.31%及94.23%和95.10%，與正常組相比，存在統計學差異(Plt;0.01)。通過SPSS 19.0分析得出LCA對U87、U251細胞48 h的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)分別為61.54 μM和53.02 μM。

二、倒置顯微鏡觀察細胞形態

顯微鏡下觀察對照組細胞生長狀況良好，輪廓清晰，觸角豐滿，U87細胞呈梭形，U251細胞呈不規則多角形。IC50和100 μM濃度LCA作用U87、U251細胞24 h后，呈現濃度依賴性的形態改變，細胞皺縮，密度減少，呈圓形貼壁生長，輪廓不規則，邊緣圓鈍，胞內可見顆粒樣物質 (圖2)。

三、LCA促進膠質瘤U87、U251細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡，結果表明，IC50和100 μM濃度LCA處理U87、U251細胞24 h后，活細胞百分率減少，凋亡細胞百分率明顯增加，呈濃度依賴性改變。與對照組相比，100 μM濃度組U87和U251細胞凋亡率分別為25.48%±1.65%和25.63%±0.93%，顯著高于對照組的1.87%±0.31%和2.85%±0.25%，差異有統計學意義(Plt;0.01, 圖3)。

四、LCA對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

IC50和100 μM濃度LCA處理U87、U251細胞24 h后，Western Blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達變化。結果提示，隨著LCA藥物濃度的增加，U87和U251細胞Bcl-2蛋白表達量顯著降低，相反，Bax蛋白表達量增加。MTT、流式細胞術和Western結果共同提示，LCA可通過促凋亡效應殺傷膠質瘤細胞，調控Bcl-2和Bax蛋白可能是其潛在分子機制 (圖4)。

圖1 不同濃度LCA作用不同時間對U87、U251細胞的增殖抑制作用(n=3)

Fig 1 Effects of LCA on the inhibition of U87 and U251 cells with different concentrations for 24 h and 48 h (n=3)

A: Effects of LCA on the inhibition of U87 glioma cells with different concentrations for 24 h and 48 h; B: Effects of LCA on the inhibition of U251 glioma cells with different concentrations for 24 h and 48 h

aPlt;0.01,vscontrol group.

圖2 不同濃度LCA作用24 h對U87、U251細胞的形態改變(×200)

Fig 2 The effect of LCA on morphology of U87 and U251 cells for 24 h (×200 )

A: U251 control group under inverted microscopy; B: U87 control group under inverted microscopy; C: U251 cells showed typical morphological change after treatment with LCA IC50 for 24 h; D: U87 cells showed typical morphological change after treatment with LCA IC50 for 24 h; E: U251 cells showed typical morphological change after treatment with LCA 100 μM for 24 h (×200); F: U87 cells showed typical morphological change after treatment with LCA 100 μM for 24 h.

圖3 LCA誘導膠質瘤U87、U251的細胞凋亡(n=3)

Fig 3 Detection of cellular apoptosis in U87 and U251 cells after treatment with LCA (n=3)

A: Cellular apoptosis in different groups were detected by flow cytometry; B：Quantity of cellular apoptosis detected by flow cytometry

aPlt;0.01,vsU87-Con;bPlt;0.01,vsU251-Con.

圖4 LCA對膠質瘤U87、U251細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Fig 4 Effect of LCA on expression of Bcl-2 and Bax in U87 and U251 cells

A: Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot after treatment of LCA in U251 cells; B: Quantity of Bcl-2 and Bax detected by Western Blot in U251 cells; C: Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot after treatment of LCA in U87 cells; D: Quantity of Bcl-2 and Bax detected by Western Blot in U87 cells

aPlt;0.01,vsBcl-2-Con;bPlt;0.01,vsBax-Con;cPlt;0.05,vsBax-Con.

討 論

膠質瘤是致死率較高的類型之一，其來源于神經膠質前體細胞，在組織及分子結構中異質性高，占所有原發性腦腫瘤的27%以及占所有原發性惡性腦腫瘤的80%。治療方面，人工合成化療藥存在許多局限性，比如，經典的系統給藥途徑很難在CNS以及腫瘤位點達到有效治療濃度；顯著的骨髓抑制等副作用。盡管手術及放、化療等均有較大改進，但膠質瘤治療的有效率仍不盡如人意。

目前，中草藥為研究熱點，因為中草藥中含有龐大的天然化學基團，可作用于腫瘤發生、發展的任一階段；與人工化療藥相比毒副作用小，療效肯定。甘草是中國傳統中藥材，其中，LCA是甘草的主要活性提取成分，可通過不同機制殺傷多種腫瘤細胞，例如膀胱癌、胃癌、肝癌等。本研究采用LCA干預膠質瘤U87、U251細胞，探討LCA是否具有增殖抑制、促凋亡等作用以及研究可能存在的潛在分子機制。

將濃度為100 μM的LCA處理U87、U251細胞48 h后抑制率分別為94.23%和95.10%，呈濃度及時間依賴性，表明LCA對膠質瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用。Zeng等[7]的研究闡明在人口腔鱗癌SCC-25細胞系中，LCA的IC50值約300 μM，明顯高于本實驗中的IC50值，說明針對不同腫瘤細胞，LCA的IC50值不同。例如，Xiao等[8]的研究表明在胃癌MKN-28、AGS、MKN-45細胞系中，LCA的IC50值為40 μM；另外，在人膀胱癌T24細胞系中，LCA的IC50值為60 μM[9]。因此，以上結論說明細胞對藥物的敏感性決定該藥物的IC50值。

通過MTT、細胞形態學及流式細胞術等實驗初步證明LCA可顯著抑制膠質瘤U87、U251的細胞增殖并促進其凋亡，呈現濃度及時間依賴性。有研究表明，LCA可激活線粒體依賴的內源性細胞凋亡，下調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達量，顯著上調促凋亡蛋白Bax和BAD的蛋白表達量，而且，Bcl-2和Bax在內源性凋亡通路中起重要作用，因為Bcl-2和Bax的平衡決定細胞存活或凋亡[10]。因此本實驗通過檢測Bcl-2和Bax的表達變化，進一步闡明LCA促凋亡作用的分子機制，Western Blot結果表明，隨著LCA藥物濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量降低，相反，促凋亡蛋白Bax表達量逐漸增加，說明LCA通過調控Bcl-2和Bax等促使膠質瘤U87、U251細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用。

初步研究證實LCA對U87、U251細胞具有明顯的增殖抑制和促凋亡作用，該機制可能與激活線粒體依賴的內源性細胞凋亡通路相關，但針對藥物作用靶點以及通路相關機制等還需更深入的研究，為臨床應用奠定堅實基礎。

1LOUIS D N, OHGAKI H, WIESTLER O D, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system [J]. Acta Neuropathologica, 2007, 114(2): 97-109.

2TAN W, LU J, HUANG M, et al. Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs [J]. Chin Med, 2011, 6(1): 27.

3WANG L, YANG R, YUAN B, et al. The antiviral and antimicrobial activities of licorice, a widely-used Chinese herb [J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2015, 5(4): 310-315.

4ESPINOZA-HICKS J C, CAMACHO-DAVILA A A, FLORES-HOLGUIN N R, et al. Experimental and quantum chemical studies of a novel synthetic prenylated chalcone [J]. Chem Cent J, 2013, 7(1): 17.

5HSEU Y C, LEE M S, WU C R, et al. The chalcone flavokawain B induces G2/M cell-cycle arrest and apoptosis in human oral carcinoma HSC-3 cells through the intracellular ROS generation and downregulation of the Akt/p38 MAPK signaling pathway [J]. J Agric Food Chem, 2012, 60(9): 2385-2397.

6PARK M, KIM S, CHO I, et al. Licochalcone-A induces intrinsic and extrinsic apoptosis via ERK1/2 and p38 phosphorylation-mediated TRAIL expression in head and neck squamous carcinoma FaDu cells [J]. Food and Chem Toxic, 2015, 77(8): 34-43.

7ZENG G, SHEN H, YANG Y, et al. Licochalcone A as a potent antitumor agent suppresses growth of human oral cancer SCC-25 cells in vitro via caspase-3 dependent pathways [J]. Tumor Bio, 2014, 35(7): 6549-6555.

8XIAO X Y, HAO M, YANG X Y, et al. Licochalcone A inhibits growth of gastric cancer cells by arresting cell cycle progression and inducing apoptosis [J]. Cancer Lett, 2011, 302(1): 69-75.

9YUAN X, LI D, ZHAO H, et al. Licochalcone A-induced human bladder cancer T24 cells apoptosis triggered by mitochondria dysfunction and endoplasmic reticulum stress [J]. Biomed Res Intern, 2013: 474472.

10FISCHER B, COELHO D, DUFOUR P, et al. Caspase 8-mediated cleavage of the pro-apoptotic BCL-2 family member BID in p53-dependent apoptosis [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 306(2): 516-522.

LicochalconeAinhibitsproliferationandinducescellapoptosisinhumanglioblastomacelllines

WANGJiu,LUOPeng,ZHANGLei,ZHENGXinrui,DAIShuhui,YANGYuefan,RAOWei,PENGCheng,LIJuan,MAWenke,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe goal of this study is to investigate the cytotoxic effects of licochalcone A on the human glioblastoma cell proliferation and apoptosis and to identify the underlying molecular mechanism.MethodsThe growth-inhibiting effect of licochalcone A(LCA) in the human glioblastoma cells were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and calculated the half maximal inhibitory concentration (IC50), according to different concentrations grouping IC50 or 100 μM. The cell morphological changes were observed under inverted microscope, the cell apoptosis was examined by the flow cytometry and the protein levels of apoptosis-related molecules were detected by Western Blot.ResultsThe results of MTT revealed that LCA could significantly inhibit U87 and U251 glioma cells proliferation in a dose- and time-dependent manner. The inhibitory concentrations of LCA for U87 and U251 glioma cells at 48 h were 61.54 μm and 53.02 μm, respectively. The density and morphology of the U87 and U251 glioma cells were remarkably changed under inverted microscope. Results of flow cytometry showed that LCA could induce apoptosis in U87 and U251 glioma cells (Plt;0.01). Furthermore, LCA significantly reduced the level of B-cell lymphoma-2(Bcl-2) (Plt;0.01), while increased the levels of Bcl2-Associated X(Bax) (Plt;0.05) in a dose-dependent manner.ConclusionLCA could significantly inhibit the cell proliferation of the human glioblastoma cells, subsequently triggering the mitochondrial apoptotic pathway.

Glioma; Licochalcone A; Inhibiting proliferation; Apoptosis

1671-2897(2017)16-025-05

R 739

A

國家自然科學基金重點項目資助項目(81430043)；“十二五”國家科技支撐計劃基金資助項目(2012BAI11B02)

王玖，碩士研究生，E-mail: doctoralixwj@126.com

*通訊作者： 費舟，教授、主任醫師，博士生導師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2016-08-20；

2016-10-24)