電磁刺激對脊髓神經干細胞增殖與分化作用研究

馮楓 牟翔 袁華 王冰水 劉衛

(第四軍醫大學西京醫院康復理療科，陜西 西安 710032)

·論著·

電磁刺激對脊髓神經干細胞增殖與分化作用研究

馮楓 牟翔*袁華 王冰水 劉衛

(第四軍醫大學西京醫院康復理療科，陜西 西安 710032)

目的探討電磁刺激對大鼠脊髓神經干細胞(NSCs)向功能性神經元增殖分化的作用及可能的機制。方法體外分離培養妊娠第14天(E14 d)的Wistar大鼠脊髓NSCs，無血清培養14 d后，分為對照組和電磁刺激組。電磁刺激組置于脈沖強磁場條件下用促增殖參數(0.1 Hz、4T、8次)進行干預，每次脈沖放電20 ms。對照組不做干預處理。干預后第1天，10%胎牛血清誘導貼壁分化；誘導貼壁后第7天，蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測β-catenin蛋白表達情況；NCSs分化后第14天，免疫熒光染色檢測神經元MAP2表達情況，紅外可視膜片鉗技術記錄神經元自發放電情況。結果干預后，免疫熒光染色顯示電磁刺激組MAP2陽性細胞數45.4%±3.1%，較對照組38.3%±6.0%明顯增多(Plt;0.05)。Western Blot檢測結果顯示干預后第7天，電磁刺激組神經干細胞β-catenin 蛋白量較對照組增高。膜片鉗實驗結果顯示，誘導后第14天，可以記錄到神經元自發放電，是有生理功能的。結論強電磁刺激能夠促進大鼠脊髓神經干細胞增殖分化為功能性神經元。

脊髓; 神經干細胞; 電磁刺激; 細胞分化

神經干細胞(neural stem cells, NSCs)具有分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力，它的發現和研究是神經生物學領域重要進展之一[1]。電磁刺激技術在中樞神經系統疾病診治中的應用受到越來越多的關注[2]。電磁刺激是通過脈沖磁場誘導產生的感應電流促進神經干細胞增殖[3]，目前其促進增殖的機制尚不清楚。位于中樞神經系統內的NSCs具有子代細胞可興奮性和穩定性的雙重電生理特性[4]。本文旨在了解電磁刺激對Wistar大鼠脊髓神經干細胞(NSCs)向功能性神經元增殖分化的作用及可能的機制。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：杜爾貝克改良的含有F-12營養混合物的伊戈爾培養基(DMEM/F12)、B27細胞培養添加劑(Gibco)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)(Sigma)，1%青鏈霉素、胎牛血清(FBS)(Hyclon)，小鼠抗大鼠微管相關蛋白2(MAP2)抗體(Sigma)，羊抗小鼠Alexa Fluor 綠色熒光二抗(Invitrogen)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)制備試劑盒(上海鼎杰)，肌動蛋白(Actin)(SANTA)。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)(mmol/L): NaCl 126，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，NaH2PO40.33，Glucose 10，羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 10，氫氧化鈉(sodium hydroxide, NaOH)調pH至7.4；電極內液(pipette solution)(mmol/L)：KCl 20，天冬氨酸鉀potassium asparate 110，MgCl21，HEPES 5，乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸 (EGTA) 10，三磷酸腺苷二鈉(Na2-ATP) 5，氫氧化鉀(potassium hydroxide, KOH)調pH至7.2；河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)(Sigma)。

2.實驗動物：孕14 d Wistar大鼠，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

二、方法

1.神經干細胞原代培養：取妊娠第14天(embryonic，E14 d)孕鼠行6%水合氯醛0.6 mL/100 g腹腔麻醉處死，于75%乙醇中消毒3 min，無菌條件下取出子宮，置于預冷的無二價陽離子的Hank's平衡鹽緩沖液(D-Hank's)中。解剖顯微鏡下取出胚胎(n=6)，剝離脊髓組織并去除硬脊膜，眼科剪充分剪碎(1 mm3)，1 mL加樣槍反復吹打組織塊約50次，過濾制成細胞懸液，1000 r/min離心5 min，后小心去除上清液，進行無血清培養。

2.實驗分組：將培養的第3代NSCs制成單細胞懸液，隨機分裝在2個1 mL注射器內，A組標記為對照組不行電磁干預，B組為實驗組，置于脈沖強磁場內，給予0.1 Hz、4T，持續20 ms脈沖強磁場干預8次[3]。

3.形態學實驗：干預后第1 天，10%胎牛血清誘導貼壁分化，分化后第7天，在相差顯微鏡下觀察兩組NSCs生長形態；分化后第14天，進行細胞免疫熒光染色鑒定NSCs的子代細胞。

4.蛋白免疫印跡實驗(Western Blot)：電磁刺激干預、并貼壁分化后第7天，分別提取實驗組及對照組細胞胞質蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，內參為Actin。采用 Alpha 圖像軟件處理系統，分析兩組目標條帶的光密度值和灰度值，計算兩組目的/內參的比值，即 β-連環蛋白(β-catenin)的相對表達量。

5.膜片鉗實驗：脈沖強磁場干預后第14天，應用全細胞膜片鉗技術記錄神經元自發放電。所用微電極用兩步法拉制而成，充灌電極內液后電阻在3 MΩ左右。用ACSF以3 mL/min恒速灌流沖洗細胞表面，形成高阻封接(gt;5 GΩ)后，脈沖式抽吸打破細胞膜，形成全細胞記錄，電流鉗模式下進行記錄。實 驗 過 程 由 計 算 機 軟 件pCLAMP9(Axon Instrument)控制，數-模轉換器完成刺激信號的產生、反饋信號的采集以及數據分析。實驗在室溫(20～24 ℃)下進行。

結 果

一、細胞形態觀察和鑒定

神經干細胞培養至第7天，在相差顯微鏡下可見培養瓶中體積較大的神經球懸浮生長，形態呈桑葚狀，胞質透亮，折光性強(圖1)；至第14天，對成熟神經元標記物微管相關蛋白2(MAP2)進行免疫熒光標記，鏡下可見綠色熒光標記的MAP2陽性的神經元，并且電磁刺激組MAP2陽性細胞數量大于對照組(圖2)。

圖1 相差顯微鏡下對照組和電磁刺激組神經球形態 (×40)

Fig 1 Morphology of neurosphere under phase contrast microscope in control and electromagnetic stimulation group (×40)

A: Control group; B: In electromagnetic stimulation group, the size of neurosphere was larger than that of the control group.

Scale bar=50 μm.

圖2 對照組和電磁刺激組微管相關蛋白2免疫熒光染色 (×20)

Fig 2 Microtubule associated protein 2 immunofluorescence staining in control and electromagnetic stimulation group (×20)

A: Control group; B: In electromagnetic stimulation group, the number of MAP2 positive cells was greater than that in the control group.

二、Western Blot結果

在電磁刺激后第7天，Western Blot 檢測實驗組和對照組神經干細胞β-catenin 蛋白的表達(圖3)。實驗組神經干細胞β-catenin蛋白量(β-catenin: 326955, Actin: 332613, 目的/內參: 0.9830)較對照組(β-catenin: 135488, Actin: 318421, 目的/內參: 0.4255)增高約2倍。

圖3 對照組和電磁刺激組神經干細胞β-catenin 蛋白的表達

Fig 3 β-catenin protein expression on neural stem cells in control and electromagnetic stimulation group

A: Control group; B: In electromagnetic stimulation group, the expression of β-catenin protein of NSCs was about 2 times higher than that of the control group.

圖4 神經元具有自發放電，且該動作電位可被TTX阻斷抑制

Fig 4 Neurons differentiated from NSCs could discharge spontaneously and be inhibited by TTX

三、膜片鉗實驗結果

電磁刺激后第14天，應用全細胞膜片鉗技術可記錄到NSCs分化的神經元具有自發放電，動作電位可被快鈉離子通道阻斷劑TTX(0.5 μM)阻斷(圖4)。表明，電磁刺激后，脊髓NSCs分化為成熟的神經元，具有電生理活性。

討 論

近年來研究發現神經干細胞與其他干細胞相比具有其自身獨特的優勢，因此其成為神經領域研究的熱點之一[5]。另外，胚胎源性神經干細胞由于其自身獨特的特點，如與脊髓損傷區的細胞同源、來源豐富和易于培養等，被認為是一種治療脊髓損傷的理想干細胞[6-7]。研究發現移植的神經干細胞在體內能繼續存活，而且存活下來的移植細胞能從移植部位向受損神經區域遷移，并基本保留了神經干細胞自我更新和多向分化的能力，移植細胞在宿主體內分泌特殊的遞質和神經營養因子，改善損傷組織的局部微環境，促進神經元存活和軸突生長，使受損神經得以較快修復或者再生，重新建立起來的突觸聯系在神經細胞之間形成新的神經環路，在結構和功能上替代受損的神經元[8-10]。

脈沖強磁場與超高壓和極低溫一樣，屬于極端的物理實驗條件，已有文獻報導， 脈沖強磁場(0.1 Hz 、4T、8次)是促神經干細胞增殖最佳參數，增殖效應在干預后第七天最顯著，且增殖的神經干細胞仍具有向神經元和膠質細胞分化的能力[3]，該參數下脈沖強磁場可能是通過 Wnt/β-catenin通路發揮作用。

有關神經干細胞增殖分化的調節機制，Wnt 信號通路被認為在胚胎神經系統生長發育過程中起關鍵作用。Wnt 是一條十分保守的信號傳導通路，從低等生物體到高等生物都具有高度同源性，Wnt/β-catenin 途徑是該通路的經典分支，在神經系統的發育中起重要作用[11-12]。β-catenin又叫連環蛋白，是Wnt/β-catenin途徑中的多功能蛋白，當Wnt通路處于關閉狀態時，胞漿內的降解蛋白復合體卻是活化狀態，結合β-catenin并使之磷酸化，被磷酸化的β-catenin降解，無法進入細胞核與轉錄因子作用，不能啟動核內靶基因。Wnt通路被激活時，胞質內調節β-catenin的降解復合體解離而失活，β-catenin去磷酸化，與核內的轉錄因子結合并相互作用，激活下游靶基因，啟動基因的轉錄及表達。因此，在Wnt通路激活時，胞質內調控細胞增殖的關鍵分子β-catenin的表達水平是增高的[13-15]。本次實驗顯示脈沖強磁場作用于神經干細胞后，細胞β-catenin表達上調，而β-catenin表達增高又是Wnt信號激活的標志，所以，脈沖強磁場促神經干細胞增殖的機制可能是通過Wnt/β-catenin途徑介導的。

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Electromagneticstimulationonproliferationanddifferentiationofspinalcordneuralstemcells

FENGFeng,MUXiang,YUANHua,WANGBingshui,LIUWei

DepartmentofPhysiotherapy,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe study aims to investigate the effects of electromagnetic stimulation on proliferation and differentiation of rat spinal cord neural stem cells (NSCs) and the possible mechanisms.MethodsNSCs were isolated from the spinal cord of embryonic 14 d (E14 d) Wistar rats, and cultured in serum-free medium for two weeks. Then they were divided into the experiment and control groups. NSCs of experimental group were exposed in 0.1 Hz, 4T high-intensity pulsed electromagnetic field for 8 times, each 20 ms pulse discharge, and NSCs of control group were given sham stimulation. On the first day after intervention, 10% fetal bovine serum was used to induce adherence and differentiation; protein immunoblotting (Western Blot) was used to detect β-catenin protein expression one week after adherence, and NCSs could differentiate into MAP2 positive neurons by immunofluorescence staining two weeks later. Neuronal spontaneous discharge case was recorded by infrared visual patch clamp after two weeks.ResultsAfter the intervention, immunofluorescence staining revealed that the MAP2 positive cells of electromagnetic stimulation group was 45.4% ± 3.1%, which was significantly increased compared with 38.3%±6.0% of the control group (Plt;0.05). Western Blot showed that 7 days after the intervention the β-catenin protein level in electromagnetic stimulation group was higher than that of the control group. Spontaneous neuronal discharge which was recorded by patch clamp at 14th day after induction showed its physiological function.ConclusionHigh-intensity pulsed electromagnetic stimulation can promote the rat spinal cord neural stem cells to proliferate and differentiate into functional neurons.

Spinal cord; Neural stem cells; Electromagnetic stimulation; Cell proliferation

1671-2897(2017)16-035-04

R 34.1

A

國家國際合作基金資助項目(2013DFA32610)；陜西省國際科技合作與交流計劃資助項目(2015KW-035)

馮楓，主治醫師，E-mail: 6762270 @qq.com

*通訊作者： 牟翔，教授、主任醫師，E-mail: pro.mu@fmmu.edu.cn

2016-09-23；

2016-12-15)