成年SD大鼠胃竇Cajal間質細胞分離、培養及鑒定

張程程，彭 艷，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院針灸生物信息分析重點實驗室，湖南 長沙 410208）

成年SD大鼠胃竇Cajal間質細胞分離、培養及鑒定

張程程，彭 艷*，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院針灸生物信息分析重點實驗室，湖南 長沙 410208）

目的探討成年SD大鼠胃竇起搏細胞Cajal間質細胞（interstitial cells of cajal,ICC）的原代分離、培養及鑒定方法，為深入研究其生理功能提供條件。方法8～9周齡SD成年大鼠，禁食24 h，乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼處死。無菌條件下采用精細解剖方法快速取出胃竇平滑肌組織，將其剪成1～2 mm3小塊后，使用II型膠原酶消化法于37℃培養箱內消化60 min，離心后過200目篩，接種于DMEM/F12完全培養基（含5 ng/mL干細胞因子）中進行培養。用酪氨酸蛋白激酶受體ckit特異性抗體免疫熒光染色鑒定細胞類型。結果培養72 h后，于倒置顯微鏡下觀察，可見細胞貼壁，呈不規則三角形、星形或梭形，有多個突起；隨著培養時間的延長，各突起彼此相互連接形成網絡；此原代培養細胞c-kit抗體免疫熒光染色呈陽性。結論 成功建立了一套由成年SD大鼠胃竇組織采用II型膠原酶消化法原代培養ICC的方法，為ICC的生理功能、病理改變以及胃腸道生理與病理關系的研究奠定了基礎。

胃竇；Cajal間質細胞；細胞培養技術

良好生命活動的維持是以機體通過胃腸道正常消化吸收營養物質為生理基礎。而胃腸道神經元、平滑肌細胞以及Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal，ICC)的協調作用是維持正常的胃腸消化吸收的必要條件[1]。研究證實，ICC是胃腸運動的自發性起搏細胞，主要分布于消化道自主神經末梢和平滑肌細胞之間，具有產生并傳播慢波、介導神經遞質的傳遞以及調節某些胃腸激素的功能[2-4]。因此目前認為ICC在產生和維持正常胃腸生理功能中扮演著非常重要的角色。研究發現，多種胃腸運動障礙性疾病如慢傳輸型便秘、糖尿病胃輕癱、功能性消化不良等均可見ICC的病理改變，包括ICC數量的減少、超微結構及表型等的改變[5-7]。故此探討一種穩定、持續的體外培養ICC的方法無論對基礎研究或是臨床治療胃腸運動障礙相關疾病均有重大的意義。目前，國內外普遍采用幼年動物分離ICC，而且常見于小腸組織，少見從成年大鼠胃竇中分離并培養ICC的研究。本實驗采用Ⅱ型膠原酶消化法，以成年SD大鼠胃竇作為組織來源，成功建立一套體外原代分離、培養ICC的方法，擬為進一步研究ICC的生理功能、病理改變及胃腸道生理與病理關系的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 正常8～9周齡清潔級SD成年大鼠，雌雄不限，體質量220～250 g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。飼養溫度25℃，相對濕度50%～70%，自由攝食、飲水。

1.1.2 主要儀器設備 IX2-ILL100型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；TCL16M型高速冷凍離心機，長沙湘儀貝克儀器儀表公司；CBV-1500A型超凈工作臺，上海瑞仰凈化設備廠；DW-86L26型超低溫冰箱，海爾公司；外科手術器械，上海醫療器械廠。

1.1.3 主要試劑及藥品 DMEM/F12培養基、Ⅱ型膠原酶（100 mg/支）、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（2 mL:10 mg），均購自北京Solarbio公司；磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/LPBS，pH=4，500 mL/瓶）購自武漢博士德生物工程有限公司；D-Hanks緩沖液（500 mL/瓶）購自天津灝洋生物公司；胎牛血清（FBS，100 mL/瓶）、雙抗（青霉素 10 000 U/mL，鏈霉素10 000 U/mL），均購自英國Hyclone公司；大鼠重組干細胞因子（SCF，1 μg/支）購自美國Peprotech公司；PE 標記的兔抗大鼠 CD117（c-kit）熒光抗體（1 mL∶0.2 mg）購自 eBioscience 公司；胰酶抑制劑 （100 mg/支）、 臺盼藍 （5 g/瓶）、 牛血清白蛋白（BSA，5 g/支），均購自 sigma 公司；ATP（2 mL∶20 mg）購自湖北天藥公司等。

1.1.4 主要溶液的配制 （1）Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶抑制劑均以PBS緩沖液配制成終濃度為10 mg/mL的工作液，并以0.22 μm真空濾菌器除菌，分裝，-20 ℃凍存備用；（2）牛血清白蛋白（BSA）以PBS緩沖液配制成終濃度為4 mg/mL的工作液；（3）干細胞因子（SCF）以無菌水配制成終濃度為1 ng/μL的工作液；（4）配制5 mLⅡ型膠原酶消化液（ 含Ⅱ型 膠 原 酶 1.2 mg/mL、ATP0.27 mg/mL、BSA 2 mg/mL、胰蛋白酶抑制劑2 mg/mL），將消化液過濾除菌，4℃保存備用；（5）配制20 mL DMEM/F12完全培養基 （含DMEM/F12培養基，2%雙抗，10%FBS，5 ng/mL SCF），4 ℃保存備用；（6）臺盼藍溶液：臺盼藍4.0 g，溶于100 mL超純水，4 ℃保存，使用時用 PBS 稀釋至 0.4%，室溫下保存；（7）鼠尾膠原溶液：用 0.006 mol/L(0.36 g/L)無菌乙酸將膠原蛋白稀釋到 2.5 μg/mL，4 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 ICC細胞分離 大鼠禁食不禁水24 h后采取乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼法處死，完全浸入75%乙醇溶液中1 min；無菌條件下打開腹腔，自賁門、幽門剪切開，取出胃組織，放入盛有0.01 mol/L PBS(含2%雙抗)的無菌平皿里；在解剖顯微鏡下用眼科剪、眼科鑷銳性剝除血管及胃漿膜層，將胃組織沿胃小彎剖開，剪取胃竇部，用4℃的D-Hanks液反復沖洗胃內容物3～4次；解剖顯微鏡下銳性剝除胃竇部黏膜、黏膜下層及漿膜層，再將僅剩肌層的胃竇組織置入4℃的D-Hanks液中，漂洗兩次，用眼科剪將組織剪碎至大小約為1～2 mm3。將組織塊移至離心管內，加入3～4倍于組織體積的Ⅱ型膠原酶消化液，放入培養箱內37℃消化60 min，期間每隔15分鐘輕輕吹打10次，加入等體積的DMEM/F12完全培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM/F12 重懸，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，DMEM/F12重懸，反復輕輕吹打3～5 min，過200目篩網。并以0.4% 臺盼藍染色鑒定細胞狀態并計數，倒置顯微鏡下觀察，死細胞被染成藍色，活細胞未被染色，調整細胞濃度為1×105/cm2。

1.2.2 ICC細胞培養 用DMEM/F12完全培養基將細胞接種至6孔培養板（預先放置包被鼠尾膠原蛋白的爬片）中，然后放入培養箱內，37℃，5%CO2條件下培養。72 h后換為不含有青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養基。此后每3天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每次觀察不超過 30 min，觀察的同時進行攝像。

1.2.3 ICC免疫熒光染色 為確定培養的細胞是否為ICC，采用國際通用的c-kit免疫熒光抗體對所培養的細胞進行免疫熒光染色鑒定。染色主要步驟：去除培養板內培養基，用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min；4%多聚甲醛液室溫下固定 20 min，0.01 mol/L PBS漂洗 3次,每次5 min；用5%的山羊血清室溫下封閉30 min；加入PE標記的兔抗大鼠c-kit單克隆抗體（用 0.01 mol/L PBS 稀釋 1∶100）3 mL，37 ℃條件下靜置30 min后放入4℃冰箱過夜；次日取出后再于37℃條件下靜置 30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；在熒光顯微鏡下觀察細胞并攝像。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下所見ICC形態學變化

在倒置顯微鏡下觀察，培養72 h后，細胞穩定貼壁，細胞邊界清晰，細胞透亮度可，呈梭形、三角形或星形，細胞核大，細胞質較少，可見部分細胞有2～3個明顯短突起，但突起之間未見明顯連接，而且ICC特有的網絡狀結構不太明顯（圖1A）。培養1周時細胞的形態未見明顯變化，可能與成年大鼠細胞呈高分化狀態有關，生長緩慢（圖1B）。隨著培養時間延長至約2周時可見細胞形態愈來愈清晰，突起也逐漸由粗短變為細長，并相互連接形成明顯的網絡狀結構，具備ICC的形態特點（圖1C）。到第4周以后，細胞逐漸呈凋亡狀態，細胞核皺縮，透亮度降低，網絡結構稀疏（圖1D）。

圖1 ICC體外培養不同時期倒置顯微鏡下細胞形態（×400）

2.2 熒光顯微鏡下所見ICC形態學變化

c-kit陽性是目前確認細胞是否為ICC的重要指標。選擇培養至2周的細胞使用免疫熒光法對其進行鑒定。在熒光顯微鏡下可見細胞胞體呈紅色熒光染色即c-kit陽性。據免疫表型分析可證實培養所得c-kit陽性細胞為ICC，而不是平滑肌細胞（見圖2）。并且根據細胞形態，可排除肥大細胞可能。

圖2 Cajal間質細胞的免疫熒光染色（×400）

3 討論

根據ICC的形態以及其在胃腸道的分布位置將其分為肌間、肌內、深肌叢及黏膜下四種類型，其中肌間ICC和粘膜下ICC主要參與胃腸起搏活動[8]。ICC不僅可自發性去極化，產生慢波，是胃腸道的起搏細胞，ICC尚在胃腸神經和胃腸平滑肌之間扮演著中間媒介角色，胃腸生理功能的正常運行同時受迷走神經、內臟神經和腸神經系統的共同支配，其中腸神經系統起主導作用[9]，而腸神經末梢神經元通過與ICC形成的突觸連接將信號傳遞給 ICC，后者通過與平滑肌細胞形成的縫隙連接將信號傳遞給平滑肌細胞，故此胃腸神經－ICC－平滑肌細胞網絡引起并調節胃平滑肌節律性的相位收縮活動，在胃運動的調節中發揮至關重要的作用。研究發現，ICC的病理改變如其數量的減少、形態結構的異常等可導致臨床上多種胃腸動力障礙性疾病[10-12]。

為了研究胃腸動力障礙性疾病的發病機制，探討ICC細胞功能及起搏特性，建立一種體外分離、培養ICC的方法便顯得具有重要意義。而以成年大鼠為模型，則更貼近于臨床。培養ICC的方法主要包括組織塊培養法和酶解法。而組織塊培養法適用于細胞增殖活躍的幼年動物[13]，成年大鼠細胞已呈高度分化狀態，故不適用。成年大鼠胃竇ICC與平滑肌細胞、結蹄組織及膠原纖維等連接緊密，分離難度很大，劉勇等[14]應用Ⅱ型膠原酶消化法分離成年Wistar大鼠胃竇ICC，獲得成功，本實驗以其為參考，并采用成年SD大鼠胃竇為組織來源，根據文獻[15-16]，采用Ⅱ型膠原酶消化法培養成年SD大鼠胃竇Cajal間質細胞，為今后基礎研究提供了一種體外原代分離、培養胃竇ICC的方法。

胃腸道內幾乎所有ICC都特異性表達酪氨酸激酶受體(c-kit)，其配體為干細胞因子（stem cell factor,SCF）。SCF、c-kit特異性結合，形成二聚體，活化酪氨酸激酶，啟動了一系列酸化過程，調節細胞的生長、發育和分化[17]。近年來c-kit免疫組化染色法成功應用于ICC的研究當中，成為ICC細胞表型的一種特異性標志物，本實驗體外分離培養所得的Cajal間質細胞經藻紅蛋白免疫熒光表型分析，在熒光顯微鏡下觀察可見細胞胞體呈紅色熒光染色即c-kit陽性。c-kit廣泛表達于多種組織細胞，如各種造血細胞、生殖細胞、肝細胞、腫瘤細胞等，但在胃腸道，只有ICC和肥大細胞特異性表達c-kit，而且肥大細胞主要分布于胃黏膜、黏膜下層，在準備平滑肌組織過程中絕大部分已被去除，可忽略不計，且肥大細胞形狀為圓形，可與ICC鑒別。因此培養所得c-kit陽性細胞為ICC。根據其細胞形態和免疫學特性，表明ICC在體外原代分離培養成功。

筆者經過反復實驗，認為在實驗中應注意以下方面：（1）樹立嚴格的無菌觀念：提前將試劑分裝，并過濾除菌，于合適溫度下儲存備用，實驗前24 h，大鼠禁食不禁水，為避免大鼠饑不擇食，需清除籠內墊料，使胃組織處于相對潔凈狀態。乙醚吸入麻醉后，將大鼠全部浸入75%乙醇溶液中1 min，不宜時間過長，以免大鼠吸入乙醇，影響實驗；（2）因成年大鼠細胞呈高分化狀態，培養難度大，在ICC的分離接種以及鏡下觀察時應盡量縮短時間，有利于細胞的存活；（3）相比于劉勇只選用Ⅱ型膠原酶進行酶解[14]，本實驗在酶解液中加入胰蛋白酶抑制劑、BSA、ATP，并控制好酶濃度及消化時間，以求將細胞損害降到最??；（4）制作細胞爬片很重要，決定其貼壁成功與否，應提前用無菌2.5 μg/mL鼠尾膠原包被玻片，于培養箱中烘干待用；（5）培養72 h后ICC細胞貼壁，培養基顏色改變，提示可進行換液，這與文獻相符[2]。故認為使用Ⅱ型膠原酶消化法培養ICC時可在72 h后進行換液操作，這樣既可避免因頻繁移動培養皿而引起貼壁不牢，還可減少污染的機會，換液既能保證細胞有合適的生長環境，也能去除未貼壁的細胞，避免其對培養環境及細胞生長產生影響；（6）考慮抗生素會減緩細胞生長，故72 h后換為不含抗生素的DMEM/F12培養基；（7）盡量減少機械損傷：筆者使用眼科鑷銳性刮除黏膜及黏膜下層，避免了對胃竇組織過度的牽拉或擠壓，減少了對組織內ICC的破壞和損傷；（8）吹打細胞時動作應輕柔，宜選用口徑較大的吸管緩慢吹打；（9）SCF是ICC生長發育所必需的，參照國外相關文獻[18-19]，本實驗在培養基中加入5 ng/mL的SCF，此濃度下ICC細胞可穩定地發育。

綜上所述，在借鑒前人研究的基礎上，使用Ⅱ型膠原酶消化法成功建立了一套由成年SD大鼠胃竇原代培養ICC的方法，為研究ICC的生物學特性及其與胃腸道動力障礙性疾病的關系提供了細胞模型。

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（本文編輯 楊 瑛）

Isolation,Culture and Identification of Interstitial Cells of Cajal in Gastric Antrum of Adult Rats

ZHANG Chengcheng,PENG Yan*,CHEN Haijiao,YANG Jianwen,LIU Weiwei,LIU Li
（Key Acu-Moxibustion Laboratory of Biological Information Analysis,Institute of Acupuncture,Moxibustion and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveIn order to provide the conditions for further study of its physiological function,the method of isolation,culture and identification of interstitial cells of Cajal (ICC)in the gastric antrum of adult SD rats was investigated.MethodsSD rats at 8-9 weeks,were anesthetized with ether and killed by cervical dislocation.The specimens were cut into 1-2mm3 small pieces,digested with collagenase type II in a 37℃incubator for 60 min,centrifuged and passed through a 200-mesh sieve.The tissues were inoculated in DMEM/F12 complete medium (containing 5 ng/mL stem cell factor).Cell type was identified by immunofluorescence staining using tyrosine protein kinase receptor c-kit specific antibody.ResultsAfter culture for 72 h,the cells adhered to the wall under the inverted microscope,which were irregular triangular,star-shaped,or spindle-shaped,with multiple protrusions.With the prolongation of culture period,the protrusions were connected to each other to form a network.The cells were positive for immunofluorescence staining of c-kit antibody.ConclusionThis study established a method for primary culture of ICC from type II collagenase digestion of gastric antral smooth muscle in adult SD rats.It laid a foundation for the study of the relationship between ICC and gastrointestinal tract in physiological function and pathologic changes.

gastric antrum;interstitial cells of Cajal;cell culture techniques

R965.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.014

2016-11-24

國家自然科學基金項目（81403487）；湖南省教育廳青年基金（14B128）。

張程程,女,在讀博士研究生,研究方向:針灸治病機制的研究。

*彭 艷,女,博士,副教授,E-mail:penyatcm@126.com。

本文引用：張程程，彭 艷，陳海交，楊建文，劉薇薇，劉 麗.成年SD大鼠胃竇Cajal間質細胞分離、培養及鑒定[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1226-1230.