腸炎沙門菌環介導等溫擴增快速檢測方法的建立

張海艷 周贊虎 胡元慶 劉 斌

（1.漳州衛生職業學院 福建漳州 363000；2.漳州出入境檢驗檢疫局；3.閩南師范大學生物科學與技術學院；4.西北農林科技大學）

1 前言

沙門菌是一種常見的食源性致病菌，據統計在世界上很多地方的細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列首位。國家衛生計生委辦公廳關于2015年全國食物中毒事件情況的通報[1]中顯示：我國2015年的食品安全事件中，生物性食物中毒事件的中毒人數最多，占全年食物中毒總人數的53.7%；主要致病因子為沙門菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌等，其中沙門菌位列第一位。

沙門菌屬于革蘭陰性腸道桿菌，已發現近2 000多種血清型，其中與人體疾病有關的主要血清型有腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌等。而根據Mellory[2]統計研究顯示，日、美等發達國家發生的食物中毒事件中，40%～80%由禽沙門菌引起，其中主要病原為腸炎沙門菌。

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等[3]建立的一種新的核酸擴增方法，該方法具有特異、高效、快速等優點，可在恒溫條件下60 min內擴增目的DNA，特別適用于大量樣品的快速檢測和篩選。本研究旨在建立一種快速、準確檢測食品中腸炎沙門菌的方法并進行實際應用，以滿足食品安全對致病菌的快速檢測要求。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

腸炎沙門菌 （Salmonella Enteritidis CMCC 50335）、腸炎沙門菌 （Salmonella Enteritidis ATCC 13076）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF56）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF73）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF75）、阿博尼沙門菌（Salmonella Abony NCTC 6017）、甲型副傷寒沙門菌（Salmonella Paratyphi A CMCC 50093）、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella Paratyphi B CMCC 50094）、丙型副傷寒沙門菌 （Salmonella Paratyphi C CMCC 50017）、浦那沙門菌（Salmonella Poona NCTC 4840）、鼠傷寒沙門菌 （Salmonella Typhimurium ATCC 14028）、塔拉哈西沙門菌 （Salmonella Tallahassee ATCC 12002）、維洛爾沙門菌 （Salmonella Vellore ATCC 15611）、鴨沙門菌（Salmonella Anatum ATCC 9270）、亞利桑那沙門菌 （Salmonella arizonae ATCC 13314）、 嬰兒沙門菌 （Salmonella Infant ATCC 51741）、豬霍亂沙門菌 （Salmonella Choleraesuis ATCC 10708）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、弗氏擰檬酸桿菌 （Citrobacter freundii ATCC 8090）、 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaekk ATCC 13047）、阪崎腸桿菌 （Enterobacter sakazakii ATCC 50205）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 11246）、大腸桿菌 （Escherichia coli ATCC 25922）、單核細胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 10890）、單核細胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 15313）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris ATCC 33425）、蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus CMCCCB76330）、痢疾志賀菌 （Shigella dysenteriae CMCC 51335）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC6538）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846）、 霍亂弧菌 （Vibrio cholerae ATCC 25871）共32個菌株：均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；

Bst DNA聚合酶大片段：NEB公司；甜菜堿：Sigma公司；dNTPs、SYBR Green I 染料：上海生工；其他試劑均為分析純級。

2.1.2 儀器設備

TGRADIENT 96梯度PCR儀：德國Biometra公司；FIREREADER凝膠成像儀：英國UVItec公司；XMTD-204水浴鍋：江蘇省金壇市江南儀器廠。

2.2 方法

2.2.1 DNA模板制備

取單菌落于100 μL無菌水，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12 000 g離心2 min，上清液即為模板DNA，-20℃保存備用。

2.2.2 引物設計與合成

將基因庫里腸炎沙門菌基因組中的基因序列，利用NCBI BLAST上的軟件，與其他血清型的沙門菌的基因組和非沙門菌的基因組進行比較，選擇出只有腸炎沙門菌才有的基因序列，獲得腸炎沙門菌特異基因SEN1393。該基因序列只存在于腸炎沙門菌中，而沙門菌的其他血清型以及非沙門菌的菌株基因組中均未發現此基因。根據SEN1393基因設計腸炎沙門菌LAMP引物（表1），引物由上海生工生物工程技術公司合成。

表1LAMP引物

2.2.3 LAMP反應體系初建

根據文獻[4]，LAMP 基本反應體系為 25 μL，外引物：內引物：環引物為1∶8∶8，F3和B3各0.2 μmol/L，FIP 和 BIP 各 1.6 μmol/L，LF 和 LB 各 1.6 μmol/L，dNTP Mixture 1.6 mmol/L，ThermoPol緩沖液 1×，甜菜堿 0.8 mol/L，MgSO48 mmol/L，DNA 模板2 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 0.5 μL， 加雙蒸水至 25 μL。反應混合物先在95℃ 加熱5 min使DNA解鏈，然后在63℃孵育60 min，最后在85℃、10 min終止反應。

2.2.4 LAMP反應體系優化

反應體系（25 μL）分別進行反應溫度和引物濃度比例優化，每組反應進行3個重復。反應溫度分別設為 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；引物濃度設置引物配比（外引物：內引物：環引物）分別為 1 ∶1 ∶1、1 ∶2 ∶2、1 ∶2 ∶4、1 ∶4 ∶2、1 ∶4 ∶4、1 ∶8 ∶2、1∶8∶4、1∶8∶8等 8組濃度比。

2.2.5 特異性實驗

用5株不同的腸炎沙門菌菌株、12株常見的非腸炎沙門菌菌株和15株食品中常見的污染菌菌株進行特異性驗證；提取以上各種菌株基因組DNA，用2.2.4節優化后的方法進行檢測，驗證該方法檢測腸炎沙門菌的特異性。

2.2.6 敏感性實驗

將提取的腸炎沙門菌ATCC13076菌株的DNA模板稀釋10個梯度，進行檢測；DNA濃度依次為9.4 ng/μL、940 pg/μL、94 pg/μL、9.4 pg/μL、940 fg/μL、94 fg/μL、9.4 fg/μL、0.94 fg/μL、0.094 fg/μL、0.0094 fg/μL和無菌ddH2O，依據2.2.4優化后的方法進行檢測，確定該方法的檢出限。

2.2.7 食品樣品檢測

將購買的液體牛乳樣品分為15份，每份樣品249 mL。過夜培養的腸炎沙門菌CMCC50335進行10倍梯度稀釋，每個梯度取1mL，分別按照106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL以及100 CFU/mL接入牛乳樣品中，每個梯度重復1次。并且將 1 mL無菌水接入1份牛乳樣品中作為對照。在室溫下培養12 h后，每個樣品取1 mL提取DNA，并按2.2.4優化后的方法進行LAMP擴增。

3 結果

3.1 擴增體系及參數優化

按照引物對不同濃度配比進行擴增，結果（圖1）顯示，引物配比（外引物：內引物：環引物）為1∶8∶4時，擴增結果最好。

按照不同反應溫度進行擴增，結果（圖2）顯示，此范圍內溫度對擴增的影響較小，擴增結果差異不明顯，因此選擇LAMP常用溫度60℃作為反應溫度。

圖1 引物濃度對LAMP的影響

圖2 反應溫度對LAMP的影響

最終確定的檢測體系為：LAMP反應體系（25 μL）：2×反應緩沖液 12.5 μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶 1 μL，10 μmol/L 外引物（F、B3）各 0.25 μL，10 μmol/L 內引物（FIP、BIP）各 2.0 μL，環引物 10 μmol/L（LF、LB）各 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 1 μL。 60℃ 60 min。

3.2 特異性

以建立的LAMP體系進行特異性檢測，共檢測17株沙門菌和15株非沙門菌，結果見表2，只有腸炎沙門菌可以檢測出陽性擴增。

表2 實驗用菌株

（續表 2）

3.3 靈敏度

敏感性實驗結果見圖3，引物的檢測靈敏度為94 fg/μL。

3.4 樣品檢測

圖3 靈敏度檢測結果

4 討論與結論

腸炎沙門菌作為細菌性食物中毒主要致病菌受到人們的廣泛關注，但目前對于腸炎沙門菌的檢測標準[4]仍停留在傳統的分離培養和后續的生理生化鑒定上，該方法不但操作繁瑣，血清學檢測也容易出現偏差，而且檢測周期很長，不能滿足現代社會對食品安全快速檢測要求；不少研究[5-7]采用PCR技術對

圖4 牛乳樣品檢測

以建立的LAMP體系檢測15份外購液體牛乳樣品，結果見圖4，除了接菌量為100CFU/mL濃度的樣品和對照樣品沒有擴增外，其余樣品均檢測出陽性結果。腸炎沙門菌進行快速檢測研究，但其檢測過程需要PCR儀等貴重儀器，且對操作人員技術水平要求較高，這樣造成PCR技術難以在基層推廣。而LAMP技術具有操作簡便，反應速度快，設備要求低等優點，目前已在很多食源致病菌檢測[8-15]中運用。

目前國內用LAMP技術檢測腸炎沙門菌的報道較少，袁發滸[16]根據Agron[17]報道的lygD基因為特異性靶基因，設計優化了一套LAMP引物來鑒定腸炎沙門菌，在鼠傷寒沙門菌和霍亂傷寒沙門菌等10種不同的干擾菌中特異性地檢出腸炎沙門菌；細菌培養液檢出限為23.3 CFU/mL。但lygD基因在腸炎沙門菌的研究很少，國內未見其他研究者研究。本研究采用比較基因組學和生物信息學技術，獲得腸炎沙門菌的特異基因SEN1393，由此基因為檢測靶基因，建立的LAMP檢測體系具有高特異性和靈敏度，能夠快速識別腸炎沙門菌，而且操作簡單便捷，彌補了傳統方法的不足。

本研究采用煮沸法提取模板DNA，并用其進行LAMP擴增，結果均能檢測出目的菌，在保證方法特異性的前提下能達到方便、快速的目的。用該方法對食品中常見的致病菌做特異性檢驗，均未出現假陽性結果，顯示了良好的特異性。

5 結論

本研究建立的腸炎沙門菌LAMP檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、方便、快捷、成本低等特點，適用于食品中腸炎沙門菌的快速檢測。

[1]國家衛生和計劃生育委員會.國家衛生計生委辦公廳關于2015年全國食物中毒事件情況的通報 [A].國衛辦應急發〔2016〕5 號文，2016-04-01.

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