四川腌菜中氨基甲酸乙酯的安全性分析

夏于林 程鐵轅 張 瑩

（四川出入境檢驗檢疫局宜賓辦事處 四川宜賓 644000）

1 前言

氨基甲酸乙酯簡稱EC，是發酵食品和酒精飲料生產過程中的伴隨產物，可自然產生于發酵食品、烘焙食品和飲料酒中，屬于2A類致癌物[1，2]。鑒于其致癌性，EC是當前食品安全領域的一個研究熱點，研究對象集中于發酵食品特別是葡萄酒[3]、日本清酒[4]、中國白酒[5]和黃酒[6]等酒類產品。四川腌菜是川菜的重要原料，四川四大腌菜是指涪陵榨菜、四川芽菜、四川冬菜及腌大頭菜。四大腌菜中，榨菜是世界三大名腌菜之一，其余3種則被熊四智（2003）列入川料輔料八珍，并認為是四川的“珍奇、珍稀、珍貴、珍寶”[7]。廣義而言，凡是利用微生物發酵作用制取所得的食品均可稱為發酵食品，按此定義，四川腌菜亦屬于發酵食品。

綜合前人研究成果，肖泳和鄧放明[8]對于EC的檢測方法有一個很好的總結，現階段對發酵食品中氨基甲酸乙酯的分析檢測主要有以下幾種方法：傅立葉變換紅外光譜法（FTIR）[9]、氣相色譜法（GC）[10]、氣相色譜質譜聯用法（GC/MS）[11]、高效液相色譜-熒光法（HPLC/FLD）[12]、氣相色譜串聯質譜法（GC/MS/MS）[13]、液相色譜串聯質譜法（HPLC/MS/MS）[14]。 采用LC/MS/MS法檢測發酵食品中氨基甲酸乙酯多有報道[15]，根據本實驗室現有條件及前期的技術積累，本項目采用LC/MS/MS法對四川省內不同產地腌菜產品中的氨基甲酸乙酯含量進行分析研究，采用GC/MS法對氨基甲酸乙酯產生的前體物質乙醇進行掃描檢測，以期對四川腌菜在EC方面的安全性進行深入了解。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗材料

購買四川省內不同產地及工藝的腌菜 （包括芽菜、冬菜等），同種樣品購買數量為3個，并將同種3個樣品混勻后使用。對于長段型樣品，先將其剪成短條再粉碎后使用，對于碎米型樣品，直接將其粉碎后使用，以使不同樣品經處理后達到一致。具體樣品產地及類型見表1。

表1 實驗材料

2.1.2 試劑及耗材

氨基甲酸乙酯標準品：購自國家標準物質信息中心；18 MΩcm 超純水；0.45 μm 水相濾膜；1 次性注射器。

2.1.3 儀器

LC/MS/MS儀：美國安捷倫6410；GC/MS/MS儀：日本島津GCMS-TQ8040；超聲清洗儀：中國昆山舒美KQ-500TDV；超純水儀：美國密理博Milli-Q A10。

2.2 方法

2.2.1 樣品處理

（1）LC/MS/MS 測定：取 10 支玻璃試管（5 mm×150 mm），按照1～9進行編號，9號樣品進行加標。準確稱取已粉碎樣品5.000 g（精確至0.001 g）于玻璃試管中，定量加入10 mL超純水，超聲提取30 min后，將提取液經0.45 μm濾膜過濾待測。

（2）GC/MS掃描：準確稱取經過處理的樣品2.000 g（精確至0.001 g）于10 mL進樣瓶中，按照1～9進行編號，50℃水浴4 h，頂空進樣，采用GC/MS進行掃描檢測，進樣量為2 mL。

2.2.2 標準溶液配制

（1）氨基甲酸乙酯標樣母液（1.0 mg/mL）：準確稱取0.0500 g（精確到0.0001 g）氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇定容至50 mL。

（2）氨基甲酸乙酯中間液（5.0 μg/mL）：準確吸取濃度為1.0 mg/mL的母液0.5 mL，用甲醇定容至100 mL。

2.2.3 標準工作曲線

分別準確吸取 5.0 μg/mL 中間液體 0.0 μL、10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL 于 1.0 mL 進樣小瓶中，用去離子水定容至1.0 mL，得到濃度為0.0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL的標準工作曲線溶液。

2.2.4 儀器條件

首先對LC/MS/MS儀器和GC/MS儀器進行調諧，以達到最佳檢測狀態，再分別對液相及質譜部分各參數進行條件優化，最終優化條件見表2（LC/MS/MS儀器參數 ）、表3（GC/MS儀器參數）。具體參數可根據實際情況調整優化。

表2LC/MS/MS儀器參數

表3 GC/MS掃描乙醇儀器參數

2.2.5 數據處理

在進行儀器條件最優化及儀器調諧后，依次對試劑空白、標準系列、樣液進行測定，根據樣液中氨基甲酸乙酯定量離子響應值高低，繪制出回歸曲線，樣液值以回歸曲線進行定量計算，所得值即為樣液中氨基甲酸乙酯含量。同時向每個樣品中加入氨基甲酸乙酯標準溶液，其在樣品中的最終濃度為100 ng/mL，測定回收率。

3 結果與分析

3.1 LC/MS/MS結果

3.1.1 樣品中氨基甲酸乙酯含量

圖1為氨基甲酸乙酯標準曲線，圖2為定量離子圖。圖1中，R2=0.9997，表明數據擬合效果很好；圖2中，標準物質峰型很好，無拖尾、無前沿等情況。分析結果表明：9種樣品中均未檢出氨基甲酸乙酯成分。

圖1 LC/MS/MS法氨基甲酸乙酯標準曲線

圖2 LC/MS/MS法定量離子圖

3.1.2 回收率

圖3為加標樣品定量離子流圖，表4為 LC/MS/MS方法回收率實驗結果。結果顯示加標回收率為89.31%～112.5%。

表4 LC/MS/MS方法回收率實驗

3.1.3 精密度、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）LC/MS/MS法實驗分析結果見圖4。

精密度：在同一實驗條件下，對氨基甲酸乙酯標樣（最終濃度為100 μg/L）進行7次測定，測得其相對標準偏差RSD為3.7%。

LOD：以定量離子響應3倍信噪比得出LOD為15 μg/kg。

LOQ：以定量離子響應10倍信噪比得出LOQ為 40 μg/kg。

3.2 GC/MS結果

圖5為GC/MS法樣品中乙醇分析結果，發現腌菜樣品中確實含有發酵產生的乙醇。

圖5 GC/MS法實驗scan分析結果

4 討論

根據現有研究成果，氨基甲酸乙酯在食品發酵和貯藏過程中的形成機理不盡相同，綜合來看，主要有以下幾條途徑：由焦碳酸二乙酯和氨反應形成氨基甲酸乙酯[16]；由氰化物和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯[17]；由氨甲酰磷酸和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯[17]；由尿素和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯[16]；由瓜氨酸和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯[18]。上述9種四川腌菜中不含有氨基甲酸乙酯，主要與四川腌菜的原料及發酵工藝有關。在腌菜發酵過程中，既存在有益微生物的發酵作用也存在有害微生物的發酵作用，其中，有益微生物的發酵作用有乳酸發酵、醋酸發酵、酒精發酵等，有害生物的發酵作用有丁酸發酵等。

采用GC/MS法對腌菜中的乙醇進行掃描分析后發現樣品中確實含有乙醇，表明乙醇是四川腌菜發酵過程中的一種產物。通過上文中對氨基甲酸乙酯生成途徑的分析可以看出，除了由焦碳酸二乙酯和氨反應生成氨基甲酸乙酯這一途徑外，其他途徑均是由不同前體物質與乙醇反應生成。因腌菜樣品中檢測到含有乙醇，四川腌菜中未生成氨基甲酸乙酯的原因應該是與缺少另一種前體物質或者是具有該前體物質但未達到乙醇與該前體物質反應生成氨基甲酸乙酯的條件有關，也表明了現有工藝條件下四川腌菜在氨基甲酸乙酯方面是安全的。在下一步的研究中，可以深入探究作為發酵食品的四川腌菜未生成氨基甲酸乙酯的機理，以期能夠為抑制某些發酵食品生成氨基甲酸乙酯提供一些對比研究。

5 結論

本研究結果顯示四川腌菜樣品中不含有氨基甲酸乙酯，這與腌菜的原料及發酵工藝有關，結果證實了四川腌菜在氨基甲酸乙酯方面的安全性。

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