共聚焦激光掃描顯微系統光學設計

肖海東 吳永前

文章編號： 1005-5630（2018）06-0065-10

摘要： 為了實現非接觸式、快速高精度的光學檢測，設計了一種共聚焦激光掃描顯微光學系統。在保證設計指標的前提下，簡化了各光組的結構，采用7片球面透鏡并以K9玻璃作為透鏡材料。使用Zemax軟件對光學系統進行了設計和仿真。結果表明：物鏡的數值孔徑為0.49;系統的徑向和軸向光學分辨率分別為0.400 μm和0.772 μm;顯微聚焦系統聚焦彌散斑直徑小于2 μm;照明系統聚焦彌散斑直徑小于10 μm;探測系統的聚焦光斑直徑小于20 μm;根據仿真結果確定了針孔1和針孔2的尺寸均為20 μm，且厚度不超過0.1 mm;各子系統的MTF曲線均接近衍射極限，具有很高的光學傳輸效率。

關鍵詞： 光學設計; Zemax; 激光共聚焦; 顯微物鏡; 照明系統; 探測系統

中圖分類號： O 439; TH 742文獻標志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2018.06.011

引言

與普通光學顯微鏡不同，共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）以激光為照明光源，通過獨特的針孔濾波技術和共軛成像原理，抑制了顯微物鏡焦點之外的物點信息的光信號，進而提高了光學分辨率，同時采用相應的掃描技術，又可以彌補CLSM系統視場小的缺點[1-4]。因此在理想情況下，CLSM能夠實現點對點成像。與普通光學顯微鏡相比，CLSM系統在獲得更高的橫向分辨率的同時，還具有較高的縱向分辨率。利用這種特性，可以實現對樣品的三維結構重建和測量分析，為研究透明物體的內部結構提供了參考[5]。

1基本原理

CLSM的本質是物像共軛，具體表現為：照明光源和探測器所處的位置分別與顯微物鏡焦點位置共軛，CLSM利用這種共軛關系抑制了光束離焦量和系統雜散光對光學分辨率和精度的影響，其基本原理如圖1所示[6]。CLSM利用針孔對光源的空間濾波和整形，形成點光源;點光源能量高度集中，避免了場光源照射時可能產生的衍射和散射光干擾的問題;它通過顯微物鏡聚焦，在焦平面上形成一個聚焦光點;待測樣品處的反射光或者熒光標記物被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿著原光路返回分光鏡，分光鏡將返回的光束反射并通過聚焦成像透鏡經由探測針孔會聚于探測器[3-4，7-8]。在CLSM中，只有在物鏡焦平面上的聚焦光點處的反射光或者熒光才能夠通過探測針孔，而焦平面以外的干擾光和散射光不能通過探測針孔，這就是共聚焦顯微系統具有很高光學分辨率的原因[9]。

CLSM系統主要由照明光源、聚光透鏡、針孔1、準直透鏡、分光鏡、顯微物鏡、聚焦成像透鏡、針孔2、光電探測元件等構成，系統結構如圖2所示。聚光透鏡和準直透鏡配合針孔1用于激光光束的整形和準直;顯微物鏡用于將照明光束聚焦和收集被測樣品的反射光;聚焦成像透鏡用于將反射光會聚在探測針孔處，以便CCD探測器探測光信號;分光鏡用于分光。分光光路采用平行光路，這樣可以在光路中插入分光棱鏡、偏振片等元件而不引入像差，還可以根據需要調整光路長度。按功能CLSM系統可以分為三個子系統：準直透鏡和顯微物鏡組成顯微聚焦系統;光源，聚光透鏡和針孔1組成照明系統;聚焦成像透鏡和顯微物鏡組成探測系統[10]。下面將介紹各子系統的光學設計結果。

2光學系統的設計

2.1設計指標

CLSM照明光源采用激光，因為激光兼具方向性和單色性的優勢。激光以平行光的形式進入光學系統，CLSM光學系統的設計指標如下：

（1） CLSM系統徑向光學分辨率不低于0.5 μm，軸向光學分辨率不低于0.8 μm。

（2） 照明激光波長為450 nm，激光器輸出光束光斑直徑為4 mm。

（3） 根據照明系統的設計和仿真結果確定針孔1的尺寸;根據探測系統的設計和仿真結果確定針孔2的尺寸。

（4） 在滿足CLSM系統分辨率的基礎上，確保顯微物鏡的工作距離不小于1.5 mm。

（5） 為了使所設計的光學系統符合實際加工制造的條件，應盡可能簡化系統結構，并采用K9玻璃作為光學系統的主要材料。

（6）為了便于后續設計，顯微物鏡的入瞳可以取整為D=6 mm?？紤]到系統工作距離不少于1.5 mm，去除相應的機械結構占用和設計余量，顯微物鏡工作距離應取2 mm。

根據數值孔徑、放大率、工作距離等參數在《光學設計手冊》中選定一組由四個單透鏡組成的初始結構。在初始結構的基礎上進行修改以滿足數值孔徑、放大率、工作距離等參數的設計要求，材料選用K9玻璃，優化時只需要校正顯微物鏡的軸上點球差。波長選擇450 nm，入射光瞳為6 mm，利用Zemax對修改后的顯微物鏡的初始結構進行仿真和優化，最終得到優化后的顯微物鏡結構參數，如表1所示，此外，根據Zemax的仿真結果列出了優化后的顯微物鏡的主要參數，如表2所示。

2.2.2準直透鏡的設計

準直透鏡的作用是將針孔1整形和濾波后形成的點光源準直為平行光束入射到顯微物鏡，同時使平行光束盡可能充滿顯微物鏡的入瞳。顯微物鏡入瞳為6 mm，所以準直透鏡的出射光束直徑為6 mm。采用單透鏡，玻璃材料為K9，工作波長為450 nm，在Zemax的afocal focus模式下對初始結構進行像差自動校正與平衡。優化后最終得到準直透鏡的結構參數，如表3所示，2D結構圖如圖6所示，由此可知準直透鏡出射光束在透鏡后表面20 mm處的光束半徑為3 mm，滿足顯微物鏡入瞳要求。

準直透鏡的點列圖如圖7所示，出射光束發散角為0.092 mrad，準直效果很好。準直透鏡的MTF曲線如圖8所示，曲線接近衍射極限，透鏡的光學傳輸效率很高。

2.2.3顯微聚焦系統總體設計

準直透鏡和顯微物鏡組成顯微聚焦系統，對顯微聚焦系統進行優化時，只需要校正軸上點球差。為了保證顯微物鏡的數值孔徑、焦距等特性參數不變，將準直透鏡曲率半徑和厚度設為變量，顯微物鏡相關參數不變，進行自動優化。此外，還需在默認評價函數的基礎上添加REAY操作數控制準直透鏡的出射光束半徑保持為3 mm，以保證光束能夠滿足顯微物鏡入瞳的要求。優化后顯微聚焦系統的結構參數如表4所示，2D結構圖如圖9所示。

由表4可知，優化后顯微物鏡的結構參數沒有變化，因此其數值孔徑、焦距等特性參數保持不變。顯微聚焦系統的點列圖和MTF曲線分別如圖10和圖11所示。由此可知：系統焦點彌散斑直徑小于2 μm，RMS半徑為0.355 μm，光斑集中在艾里斑范圍內;MTF曲線接近衍射極限，因此顯微聚焦系統具有極高的傳輸效率和分辨率。綜合上述評價，顯微聚焦系統的優化結果十分理想。

2.3照明系統的設計

照明系統由聚光透鏡和針孔1組成，其作用是將照明激光整形和濾波成為近似點光源，對可能進入系統的雜散光起到抑制作用。聚光透鏡采用單透鏡，玻璃材料為K9，工作波長為450 nm。根據提出的設計指標可知，激光器輸出光束光斑直徑為4 mm，因此聚光透鏡入瞳為4 mm。

優化后的照明系統結構參數如表5所示，2D圖如圖12所示。針孔1位于聚光透鏡的焦點位置。照明系統的聚焦光斑同樣也是聚光透鏡的聚焦光斑，其點列圖如圖13所示，可知光斑直徑小于10 μm，RMS半徑為1.806 μm，較好地模擬了光斑很小的點光源。此外，根據圖14所示的照明系統離焦點列圖可知，在離焦50 μm處的離焦彌散斑直徑小于20 μm。根據以上仿真結果，為了使針孔1滿足對照明激光空間濾波和整形的要求，其直徑可以取為20 μm，厚度不超過0.1 mm。

照明系統的MTF曲線如圖15所示，曲線接近衍射極限，光學傳輸效率很高，優化結果理想。

2.4探測系統的設計

2.4.1聚焦成像透鏡的設計

顯微物鏡成像在像方無限遠處，根據共焦原理，要將物鏡焦平面處的被測樣品反射回來的光束聚焦在探測器上，需要有一個聚焦成像透鏡。為了充分收集顯微物鏡反射回來的光束，聚焦成像透鏡的入瞳直徑不能小于顯微物鏡的入瞳直徑，所以聚焦成像透鏡的入瞳取為6 mm，波長為450 nm?？紤]簡化CLSM系統的結構，采用單透鏡作為初始結構，優化后得到聚焦成像透鏡的結構參數，如表6所示，聚焦成像透鏡的結構圖如圖16所示，點列圖如圖17所示，MTF曲線如圖18所示。

由此可知：聚焦成像透鏡的入瞳直徑為6 mm，滿足顯微物鏡的入瞳要求;聚焦光斑直徑小于20 μm，RMS半徑為2.038 μm;光斑集中在艾里斑范圍內，能量集中度很高;MTF曲線接近衍射極限，光學傳輸效率很高，說明透鏡的優化結果比較理想。

2.4.2探測系統總體設計

將反向顯微物鏡、聚焦成像透鏡和分光鏡組合即組成探測系統。對探測系統進行優化時，只需要校正軸上點球差。為了避免顯微物鏡和聚焦成像透鏡的主要性能參數在優化過程中發生不符合預期的變化，只需要將聚焦成像透鏡的工作距離設為變量。優化后的探測系統結構如圖19所示，探測系統點列圖如圖20所示。

由圖20可知，聚焦光路的彌散斑直徑小于20 μm，RMS半徑為6.364 μm。探測系統的離焦光斑點列圖如圖21所示，在離焦50 μm處的離焦彌散斑直徑小于20 μm。與確定針孔1尺寸的過程類似，為了使針孔2實現對探測激光的有效空間濾波，其尺寸應取為直徑20 μm，厚度不超過0.1 mm。

由于探測系統的作用是將顯微物鏡收集的反射光聚焦在探測針孔上，聚焦能量越集中，光強就越容易達到探測器響應的閾值，引起探測器的響應。因此光能量的傳輸效率可以作為評價探測系統設計結果的重要指標。下面將從MTF曲線和OPD函數出發，進一步評價探測系統的設計結果。

探測系統的MTF曲線如圖22所示，可以看到曲線接近衍射極限，這說明探測系統的光學傳輸效率很高，成像質量很好，設計結果理想。

3結論

本文設計了一種CLSM光學系統，采用結構簡單的球面透鏡實現了顯微聚焦系統、照明系統和探測系統的設計。其中，顯微物鏡的聚焦彌散斑直徑小于1 μm，數值孔徑為0.49，工作距離大于2 mm，同時系統徑向和軸向光學分辨率分別為0.400 μm和0.772 μm，均達到設計要求。顯微聚焦系統的聚焦彌散斑直徑小于2 μm，照明系統聚焦彌散斑直徑小于10 μm，探測系統的聚焦彌散斑直徑小于20 μm。根據照明系統和探測系統的離焦點列圖確定了針孔1和針孔2的尺寸。此外，各子系統的光學傳遞函數曲線均接近衍射極限，表明光學系統的設計和優化結果比較理想，光學傳輸效率很高。綜上，該光學系統結構簡單緊湊、徑向和軸向分辨率較高，可以滿足醫學、材料、生物和光學檢測等領域對激光共聚焦顯微系統的需求。

此外，本文設計的系統仍有可以改進的地方，如系統的物鏡數值孔徑較小，可以采用非球面鏡提高物鏡的數值孔徑，同時還可以簡化物鏡的結構，減少鏡片數量，從而進一步提高CLSM的光學分辨率和檢測效率。

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（編輯：劉鐵英）