香菇多糖積累規律與特性比較

胡 靜,雷遠征,譚曉妍,秦子芳,但冬梅,寧慧娟,葉彥雄,孫君社,張秀清,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.湖北裕國菇業股份有限公司,湖北隨州 441300;3.農業部規劃設計研究院,北京 100125)

香菇(Lentinusedodes),屬真菌界,擔子菌綱,傘菌目,側耳科,香菇屬[1],又名香覃、花菇、香菌[2],是一種藥食兩用真菌[3],具有重要的醫學價值和經濟價值。香菇多糖是香菇中主要的活性成分,具有抗腫瘤[4-5]、抗癌[6-7]、抗氧化[8-9]、提高人體免疫力[10]等多重功效,常作為香菇品質評價的重要指標。

目前香菇多采用袋料或段木進行大規模栽培種植[11]。在適宜的管理條件下,香菇一般會出現4～5茬菇,但是由于基質中營養成分流失、生長環境的變化等原因,常常導致不同茬期香菇品質之間出現較大差異,限制了香菇的規范生產及市場發展。張小爽[12]等人分析同一產地不同茬期香菇的營養成分差異,包括水分、灰分、脂肪、蛋白質、氨基酸組成等,得到第三茬香菇總糖含量最高,為不同茬期香菇營養成分評價提供了一定的理論基礎。李雪丹[13]等人分析了不同茬期滑子菇中多糖、氨基酸及礦物質等含量的差異,得到第一、二茬滑子菇的營養價值較好。但是在目前的研究中僅分析了不同茬期香菇多糖含量的差異,而對多糖性質方面的分析較少。

本文以不同茬期香菇多糖為考察對象,采用熱水浸提法提取香菇多糖,通過苯酚硫酸法及凝膠滲透色譜法[14]對香菇多糖的含量和分子量進行了測定分析,并研究了香菇多糖的抗氧化活性,以期為不同茬期香菇品質研究及后續加工利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-3茬香菇樣品 湖北裕國菇業有限公司;葡萄糖標準品 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;2,2-二苯基-1-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) Sigma公司;總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;葡聚糖標準品 中國食品藥品檢定研究院;濃硫酸、苯酚、三氯化鐵、氯仿、鄰苯三酚、抗壞血酸、水楊酸等 均為分析純試劑。

TG16-WS高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;TM-1901型雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RE52CS旋轉蒸發儀 上海亞絨生化儀器廠;TYS-100高速多功能粉碎機 浙江省永康市紅太陽機電有限公司;BS200S電子天平 北京賽多利斯天平公司;DHG-9240A鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;KQ3200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫公司;DZKW-C型恒溫水浴鍋 北京中科星宇商貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇多糖的制備及測定

1.2.1.1 標準曲線的繪制 準確稱取10.0 mg烘干至恒重的葡萄糖標準品,用蒸餾水定容至100 mL,配成0.1 mg/mL的標準液。吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于玻璃管中,加蒸餾水補至體積為1.0 mL,繼續加入5%的苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL,靜置10 min后渦旋混勻,待反應液冷卻至室溫后,于波長490 nm條件下測定其吸光度值,同時做空白對照。以葡萄糖含量(μg)為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.1.2 香菇多糖的制備及含量測定 稱取0.5 g粉碎過20目篩的香菇樣品,置于50 mL離心管中,加5 mL去離子水及20 mL無水乙醇,渦旋混合均勻,100 W超聲提取30 min。提取結束后,4000 r/min離心10 min,棄去上清液,不溶物用10 mL 80%乙醇洗滌、4000 r/min離心10 min。用50 mL去離子水將不溶物轉移入圓底燒瓶,100 ℃水浴回流提取2 h,提取結束后冷卻、抽濾定容至100 mL,加入4倍體積無水乙醇,4 ℃保存過夜,于4000 r/min離心10 min,取沉淀60 ℃烘干即為香菇多糖樣品。取一定量香菇多糖樣品加水復溶,按標準曲線繪制方法測定多糖含量[15]。

式中:C為根據標準曲線算出的樣品溶液中多糖濃度(mg/mL),V為樣品溶液體積(mL),W為樣品質量(mg)。

1.2.2 多糖分子量的測定 采用凝膠滲透色譜法(Gel Permeation Chromatography,GPC)測定香菇多糖分子量。色譜條件為:Agilent PL aquageL-OH MIXED-M色譜柱,示差折光檢測器,流動相為0.1 mol/L的硝酸鈉溶液,流速1.0 mL/min。將不同分子量的葡聚糖標準品(Mw分別為180 Da、9、30、300、2000 kDa)及香菇多糖樣品分別進行測定,以保留時間(x)為橫坐標,標準品的相對分子質量對數(y)為縱坐標繪制標準曲線,根據標準曲線計算多糖樣品的分子量。

1.2.3 抗氧化能力分析 配制多糖溶液濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL,分別測定其Fe3+還原力、DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力、總抗氧化能力(T-AOC)。

1.2.3.1 Fe3+還原力的測定 分別取各濃度多糖溶液200 μL,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖液500 μL、1%鐵氰化鉀溶液500 μL,混合均勻,50 ℃放置20 min,冷卻至室溫,加入10%三氯乙酸溶液500 μL,4000 r/min離心10 min,取上清液600 μL,依次加入蒸餾水600 μL和0.1%三氯化鐵120 μL,混勻,靜置10 min,以蒸餾水作為對照,在700 nm處測定吸光度值[16]。

還原力ΔA=A1-A0

式中:A1為樣品組的吸光值;A0為蒸餾水組的吸光值。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測定 分別取各濃度多糖溶液600 μL與等體積的0. 2 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液均勻混合,暗處理30 min后,以蒸餾水為對照,測定其517 nm處吸光值[17]。

式中:A0為600 μL蒸餾水與等體積DPPH反應后的吸光值;A1為600 μL DPPH與等體積蒸餾水反應后的吸光值;A2為600 μL多糖提取液與等體積無水乙醇反應后的吸光值。

1.2.3.3 羥基自由基清除率測定 在離心管中依次加入2 mg/mL硫酸亞鐵溶液105 μL,1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液350 μL,各濃度多糖溶液350 μL、1%的過氧化氫350 μL,混和均勻,37 ℃保溫1 h,于526 nm處測定其吸光度值[18]。

式中:B1為樣品組吸光值;B2為無水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光值;B0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.2.3.4 總抗氧化能力(T-AOC)測定 使用T-AOC試劑盒,向離心管中依次加入試劑一溶液0.5 mL、各濃度多糖溶液0.5 mL、試劑二溶液1.0 mL、試劑三溶液0.25 mL,渦旋混勻,37 ℃水浴30 min,隨后加入試劑四溶液0.05 mL,放置10 min,于波長520 nm處測定各管吸光度值,同時用蒸餾水做空白實驗。

式中:C0為對照組的吸光度;C1為樣品組的吸光度;C2為反應液總量,mL;C3為取樣量,mL。

1.3 數據處理

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件對結果進行作圖和統計分析。每組實驗至少重復3次(n≥3)。

2 結果與分析

2.1 不同茬期香菇多糖含量分析

根據得到的葡萄糖標準曲線方程y=0.0075x-0.0017(R2=0.9995),計算不同茬期香菇樣品中多糖含量。由圖1可知,不同茬期香菇多糖含量均在3.0% 以上,其中第一茬香菇多糖含量最高,為5.46%。多糖含量由高到低依次為:第一茬>第二茬>第三茬,且通過統計分析可得,第一茬香菇多糖含量與第二茬、第三茬樣品之間存在顯著差異(p<0.05)。路芳[19]等人測定了6種不同地區香菇多糖的含量,結果表明吉林黃松甸所產香菇的多糖含量最高,為2.01%,較低于本文香菇樣品中多糖含量。

圖1 不同茬期香菇多糖含量分析Fig.1 The content of lentinan for different batches 注:不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

2.2 不同茬期香菇多糖分子量分析

根據得到的標準曲線y=-1.114x+12.79(R2=0.9990),計算不同茬期香菇多糖的分子量。由表1可知,不同茬期香菇多糖為非均一成分,多糖分子量之間存在明顯差異。在組分1中,多糖分子量大小依次為第一茬>第二茬>第三茬,其中第一茬香菇多糖分子量為1018 kDa;在組分2中,多糖分子量隨著茬期呈現逐漸增高的趨勢,第三茬香菇多糖分子量最大,為22.7 kDa。耿安靜[20]等人以香菇子實體為原料,測得不同濃度乙醇提取得到的香菇多糖分子量分別為22.67、18.69、6.01 kDa,與本文所得到的香菇多糖組分2中分子量相近。王麗芹[21]采用液體發酵技術培養香菇菌絲體,并測定了發酵液中胞外多糖的分子量,為35.8 kDa。徐曉飛[22]等人測定了6種不同產地香菇多糖的分子量,得到多糖主要組分分子量均在1000 kDa左右,其中東北吉林產地香菇多糖分子量最高,為1653 kDa,與本文所得到的組分1分子量結果基本一致。

表1 不同茬期香菇多糖分子量Table 1 Molecular weight of lentinanfor for different batchs

2.3 不同茬期香菇多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1 Fe3+還原力分析 Fe3+還原力是表征天然產物存在抗氧化活性的重要指標。樣品的抗氧化能力與其把Fe3+還原為Fe2+的能力呈正相關,還原能力越強則樣品的抗氧化能力越強[23]。圖2表示不同茬期香菇多糖Fe3+還原力。由圖可知,第三茬香菇多糖Fe3+還原力高于第一茬和第二茬香菇多糖。同時隨著香菇多糖濃度的增加,其對Fe3+還原力都逐漸增強,說明不同茬期香菇多糖對Fe3+還原力與其濃度呈正相關關系。但總體來說,不同茬期香菇多糖對Fe3+的還原力差別不大,3.0 mg/mL時還原力均在0.3左右。

圖2 不同茬期香菇多糖Fe3+還原力分析Fig.2 Fe3+ reduction of lentinan for different batches

2.3.2 DPPH自由基清除能力分析 DPPH自由基是少數相對穩定的自由基之一,已被廣泛用于評價多糖等抗氧化劑的自由基清除能力[24]。不同茬期香菇多糖對DPPH自由基的清除能力如圖3所示。由圖可知,香菇多糖對DPPH自由基具有良好的清除能力,并與濃度呈正相關。但不同茬期香菇多糖的清除能力存在差異,由高到低依次為第一茬>第二茬>第三茬。多糖濃度為3.0 mg/mL時,第一茬香菇多糖的清除率顯著高于二、三茬,表明第一茬香菇多糖具有更好的轉移電子或氫原子的能力。

圖3 不同茬期香菇多糖DPPH自由基清除率分析Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of lentinan for different batches

2.3.3 OH自由基清除能力分析 OH自由基是公認的自然界中最活潑的自由基，它可以輕易地穿過細胞膜并與細胞內幾乎所有的生物大分子(碳水化合物、脂質、蛋白質、DNA)反應,造成細胞損傷從而導致衰老、癌癥或其他疾病[25]。由圖4可知,濃度為3.0 mg/mL時,第二、三茬香菇多糖具有極高的OH自由基清除能力,達到95.8%和90.2%。而第一茬香菇多糖清除率最低,3.0 mg/mL時僅為49.7%。因此,從清除羥基自由基能力方面講,第二茬香菇更具有食用價值。另外,鄒林武[26]等人發現香菇多糖在2.5 mg/mL時可以清除80%以上的羥基自由基,表明香菇多糖在清除羥基自由基方面的應用價值。

圖4 不同茬期香菇多糖羥基自由基清除率分析Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity of lentinan for different batches

2.3.4 總抗氧化能力分析 總抗氧化能力表征了一個體系中活性大分子的總體抗氧化水平。由圖5可知,隨著多糖濃度的增加,三個茬期香菇多糖總抗氧化能力都逐漸增強,但不同茬期間總抗氧化能力存在明顯差異,其中第三茬香菇多糖總抗氧化能力最高,濃度為3.0 mg/mL時,為1.15 U/mL。但總體來講,三個茬期香菇多糖在3.0 mg/mL時總抗氧化能力差別不大。

圖5 不同茬期香菇多糖總抗氧化活性分析Fig.5 Total antioxidant capacity of lentinan for different batches

3 結論

不同茬期香菇多糖的含量、分子量以及抗氧化能力方面均存在明顯差異。多糖含量方面,由高到低依次為第一茬>第二茬>第三茬,最高達5.46%;分子量方面,三個茬期香菇多糖均含有兩種多糖組分,且組分一呈現隨茬期增加分子量遞減的趨勢,組分二呈現分子量遞增趨勢。多糖分子量的變化對其抗氧化活性有一定影響。分析Fe3+還原力、DPPH清除率、羥基自由基清除率和總抗氧化能力四個體外抗氧化指標發現,第一茬香菇多糖具有較高的DPPH清除能力,第二茬香菇多糖具有極高的羥基自由基清除能力。雖然第三茬香菇多糖在Fe3+還原力和總抗氧化能力方面存在一定優勢,但與其他兩組差別不大。因此,認為第一茬和第二茬香菇具有更高的抗氧化作用。本研究為不同茬期香菇、香菇多糖品質評價及應用提供了一定的理論基礎。

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