云南苦蕎茶傳統與微波沖泡工藝的 響應面優化及比較

李會端,余建中,楊光興,廣國安

(楚雄師范學院化學與生命科學學院,云南楚雄 675000)

我國苦蕎資源豐富,主產地分布于四川、云南、貴州和陜西等高寒山區?？嗍w具有較高的食用和藥用營養價值?？嗍w茶是將苦蕎麥、苦蕎植株全株或不同部分經由篩選、烘焙等工序加工而成的苦蕎次級沖飲品[1]?？嗍w茶中富含蘆丁等黃酮類化合物,具有軟化血管、降血壓,調節內分泌,預防心臟病和提高肌體免疫力等功效[2-3],苦蕎茶作為一類純天然的綠色保健飲品受到了廣泛的關注和推崇。

文獻中報道的黃酮類化合物提取方法有浸提法(回流法)、酶解法、微波提取、超聲提取、超臨界流體萃取法等[4-6,10]。浸提法(回流法)是黃酮化合物傳統提取技術的代表；肖詩明[7]和郭剛軍[8]分別報道了水提和有機溶劑乙醇浸提苦蕎茶中總黃酮；王斯慧等[9]報道了苦蕎麩皮中總黃酮的超聲提取工藝優化過程,并采用了多次提取方法；王敏等[10]報道了纖維素酶輔助乙醇浸提苦蕎中的總黃酮的過程及優化。奕梅等[11]實現了CO2超臨界流體對苦蕎總黃酮的萃取過程,該工藝具有綠色、高效等特點。高頻微波輻射有助于促進苦蕎黃酮類化合物的溶出,田世龍[12]報道了微波輔助乙醇浸提苦蕎總黃酮的工藝。

國內外關于茶品沖泡工藝的研究報道日漸增多,傳統方法一般使用80 ℃左右的熱水甚至沸水沖泡,控制較高的沖泡溫度可以增加黃酮類化合物等有效成分的溶出;通過延長沖泡時間使得有效成分的溶出過程達到平衡;又可采取多次沖泡的方式最大程度的提高有效成分的溶出率[13-17]。然而傳統的沖泡工藝,過高的沖泡溫度降低了茶品的清香和口感,一味的延長沖泡時間又缺乏操作可行性。本文首次提出苦蕎茶微波沖泡工藝與傳統沖泡工藝對比,通過研究以沖泡液中總黃酮得率為響應值的兩種苦蕎茶沖泡工藝的響應面優化過程,對比不同沖泡工藝對沖泡液中總黃酮得率的影響,以期為苦蕎茶飲用和營養價值的開發和利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷冠牌苦蕎茶 產自云南烏蒙山-東川紅土地苦蕎種植基地,昆明五谷王食品有限公司;蘆丁 優級純,日本和光純藥工業株式會社;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃氨水等其他試劑 分析純,天津市化學試劑廠。

Alpha-1502分光光度計 上海譜元儀器有限公司;CP224C電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;HH-S2型電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;SHZ-ⅢA循環水式多用真空泵 河南省豫華儀器有限公司;102型電熱鼓風干燥箱 威瑞科教儀器有限公司;G80F23CN3P-Q5(QO)型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎茶粉末的制備 苦蕎茶→60 ℃恒溫干燥箱干燥處理12 h→粉碎后過40目篩→干粉備用。

1.2.2 苦蕎茶傳統沖泡工藝

1.2.2.1 傳統沖泡流程 準確稱取5.0000 g苦蕎茶粉末,用濾紙包裹后,置于250 mL容量瓶中,取250 mL蒸餾水在光波爐上燒至80 ℃,迅速轉移到錐形瓶中,用保鮮膜封口,置于80 ℃恒溫水浴鍋中浸泡15 min。將濾紙包取出,精確量取并記錄沖泡液體積,得苦蕎茶傳統沖泡液。

1.2.2.2 單因素實驗設計 考察各單因素水平對苦蕎茶傳統沖泡液中總黃酮得率的影響。固定單次沖泡,沖泡溫度80 ℃和沖泡時間15 min,考察1∶100、1.5∶100、2∶100、3∶100、4∶100、8∶100 (g∶mL)茶水比的影響。固定較佳茶水比2∶100 (g∶mL),沖泡溫度80 ℃和沖泡時間15 min,考察1、2、3、4、5、6沖泡次數的影響。固定單次沖泡,茶水比2∶100 (g∶mL)和沖泡時間15 min,考察50、60、70、80、90、100 ℃沖泡溫度的影響。固定單次沖泡,茶水比2∶100 (g∶mL)和沖泡溫度 90 ℃,考察7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0 min沖泡時間的影響。

1.2.2.3 響應面實驗設計 結合單因素實驗結果,固定單次沖泡,選取茶水比、沖泡溫度和沖泡時間三因素,每個因素設計三個水平,采用-1,0,+1編碼,以沖泡液中總黃酮得率(Y)為響應值,建立Box-Benhnken 響應面分析模型,如表1所示。

表1 響應面分析的因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.3 苦蕎茶微波沖泡工藝

1.2.3.1 微波沖泡流程 準確稱取4.0000 g的苦蕎茶粉末于250 mL錐形瓶中,加入200 mL蒸餾水,保鮮膜封口,調節微波爐功率300 W,微波90 s。取出冷卻至室溫,抽濾,準確量取并記錄沖泡液體積,得苦蕎茶微波沖泡液。

1.2.3.2 單因素實驗設計 考察各單因素水平對苦蕎茶微波沖泡液中總黃酮得率的影響。固定微波功率300 W和微波時間90 s,考察1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、6∶100、8∶100 (g∶mL)茶水比的影響。按照上述最佳茶水比,固定微波功率300 W,考察80、100、120、140、160、180 s微波時間的影響。按照上述最佳茶水比和微波時間,考察100、200、300、400、500 W微波功率影響。

1.2.3.3 響應面實驗設計 根據單因素實驗結果,固定單次沖泡,選取茶水比、微波時間和微波功率三個因子的水平并以-1,0,1編碼,以微波沖泡液中總黃酮得率(Y)，使用Design-Expert 8.06軟件，進行Box-Benhnken實驗設計，實驗設計各因子編碼水平如表2所示。

表2 響應面分析的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 沖泡液總黃酮得率的計算

1.2.4.1 標準曲線的制作 精確稱取蘆丁標準品0.0250 g,加入70%乙醇定容到100.00 mL,得0.25 mg·mL-1的蘆丁標準溶液,搖勻備用。采用分光光度法制作標準曲線,吸量管精確吸取蘆丁標準溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL于25 mL的比色管中,依次加入NaNO2-AI(NO3)3-NaOH顯色,用70%乙醇定容,靜置15 min后,使用最大吸收波長495 nm掃描吸光度。以吸光度為縱坐標,蘆丁標準液濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.4.2 總黃酮得率的計算 準確移取19.00 mL苦蕎茶沖泡液于25 mL比色管中,依次加入NaNO2-AI(NO3)3-NaOH溶液共6 mL,搖勻、靜置15 min。使用最大吸收波長495 nm測試吸光度。代入回歸方程,按照下面公式計算沖泡液中總黃酮得率。

式中，X:測試液黃酮濃度(mg·mL-1);V:苦蕎茶沖泡液的定容體積(mL);M:稱取苦蕎茶質量(g)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線見圖1,擬合線性方程Y=10.586X-0.0018,線性相關系數為R2=0.9993。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin solution

2.2 苦蕎茶傳統沖泡工藝研究

2.2.1 單因素實驗結果

2.2.1.1 茶水比對總黃酮得率的影響 如圖2所示,隨著茶水比的增加,苦蕎茶沖泡液中總黃酮得率先升高后降低,當茶水比為2.00∶100 (g∶mL)時,沖泡液中總黃酮得率達到最高值0.026%。繼續增加茶水比,總黃酮的得率開始降低,且茶水過濃還會導致茶水苦味增加口感變差。

圖2 茶水比對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.2 Result of tea weater ratio on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.2 沖泡次數對總黃酮得率的影響 如圖3所示,隨著沖泡次數增加,沖泡液中總黃酮得率雖然呈現降低趨勢,但第六次沖泡液中總黃酮的得率仍相當于第一次沖泡液中總黃酮得率的55%,且多次沖泡后苦蕎茶沖泡液的色態和口感良好,上述結果表明,苦蕎茶飲品可進行多次沖泡。

圖3 沖泡次數對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.3 Result of brewing frequency on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.3 沖泡溫度對總黃酮得率的影響 如圖4所示,隨著沖泡溫度增加,黃酮類化合物的溶出速率增大,沖泡液中總黃酮得率呈上升趨勢,沖泡溫度在90 ℃以上時,沖泡液中黃酮得率略有降低。最佳沖泡溫度為90 ℃,此時沖泡液中總黃酮得率為0.025%。

圖4 沖泡溫度對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.4 Result of brewing temperature on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.4 沖泡時間對總黃酮得率的影響 如圖5所示,沖泡液中總黃酮得率隨沖泡時間延長而增大,沖泡時間30 min后總黃酮得率趨于恒定。且隨著沖泡時間的延長,苦蕎茶沖泡液出現少量沉淀物且口感苦味增加,因此固定最佳沖泡時間30 min,此時沖泡液中總黃酮得率為0.0353%。

圖5 沖泡時間對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.5 Result of brewing time on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.2 響應面優化苦蕎茶傳統沖泡工藝

2.2.2.1 多元響應模型的建立 云南苦蕎茶傳統沖泡工藝的響應面分析實驗方案如表3所示,結果顯示,沖泡液中總黃酮得率介于0.019%～0.036%之間。當沖泡茶水比2.00∶100 g·mL-1,沖泡溫度和時間分別為100 ℃和45 min時,苦蕎茶沖泡液中總黃酮得率對應最大值0.036%。擬合實驗數據,獲得以沖泡液中總黃酮得率為響應值的多元回歸模型為:

Y1(%)=+0.034+1.737E-004A+1.077E-003B+5.596E-003C+9.500E-004AB+5.225E-004AC-2.400E-004BC-7.535E-003A2-4.558E-003B2-1.530E-003C2

表4 響應面分析多元回歸模型的ANOVA分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)for response surface quadratic model

注:***p<0.001極其顯著;**p<0.01非常顯著;*p<0.05顯著。

表3 響應面分析方案及結果Table 3 RSM design and experimental results of total flavonoid yield

2.2.2.2 多元響應模型的方差(ANOVA)分析 上述多元Quadratic響應模型的方差分析結果如表4所示。p值大小反映多元模型及各響應因子對響應值的顯著性水平。模型的p值0.0112,模型失擬項2.955E-05極低,預示模型及各響應因子的顯著性影響。相關系數(0.9457)表明94.57%的實驗數據可用該數學模型解釋,實驗誤差較小;變異系數(9.159%)說明多元模型有一定的重現性,信噪比為7.5863,遠遠高于4.000;相關系數和調整系數較為接近,預示著該多元二次回歸模型在一定程度上可以預測最佳工藝條件,擬合響應值的理論最大值。多元模型各項的顯著性水平差異分析結果顯示,B2對響應值影響顯著,C和A2對響應值影響非常顯著。

圖6的3D響應面圖和等高線圖可形象描述各響應因子的交互影響,進一步佐證三個交互項對響應值影響并不顯著。F值預示各響應因子對苦蕎茶沖泡液中總黃酮得率的影響次序為C>B>A。

圖6 各響應因子對響應值的交互作用Fig.6 The interactive effects of each independent variables注:a：茶水比和沖泡溫度；b：茶水比 和沖泡時間；c：沖泡溫度和時間。

2.2.3 驗證實驗 求解多元回歸方程,苦蕎茶沖泡條件為茶水比2.10∶100 (g∶mL)、沖泡溫度98.44 ℃、沖泡時間44.00 min時,理論擬合沖泡液黃酮得率最大為0.0357%。為方便實際操作驗證實驗條件修正為茶水比2.00∶100 (g∶mL)、沖泡溫度100 ℃、沖泡時間45 min,重復沖泡三次,驗證實驗所得苦蕎茶沖泡液黃酮得率為0.0350%±0.003%,與多元響應模型預測值0.0357%的絕對誤差為-0.0007%,吻合的較好,佐證了該多元響應模型可有效地優化苦蕎茶總黃酮的傳統沖泡工藝。

2.3 苦蕎茶微波沖泡工藝研究

2.3.1 單因素實驗及結果

2.3.1.1 茶水比對總黃酮得率的影響 如圖7所示,隨著茶水比增加沖泡液中總黃酮得率先增大后減小,反應底物濃度增加促進黃酮類化合物的溶出,當沖泡茶水比為2.00∶100 (g∶mL),沖泡液中總黃酮得率達到最大值0.241%。進一步增加茶水比不僅降低了口感,底物團聚反而阻礙了黃酮類化合物的溶出。

圖7 茶水比對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.7 Result of tea weater ratio on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.1.2 微波時間對總黃酮得率的影響 如圖8所示,隨著微波時間的延長,沖泡液總黃酮濃度呈上升趨勢,當微波時間為160 s,沖泡液中總黃酮得率達到最大值0.415%;再次延長微波時間,總黃酮得率開始緩慢降低,可能原是長時間微波作用導致黃酮分解,還會使沖泡液溫度驟升甚至發生噴濺。

圖8 微波時間對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.8 Result of microwave time on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.1.3 微波功率對總黃酮得率的影響 如圖9所示,隨著微波功率增加,作用在底物上的微波強度增大且沖泡液溫度升高,都將導致沖泡液中總黃酮得率增加;然而微波功率太大,將制約微波時間,否則沖泡液將爆沸,且微波功率太大還會導致黃酮變性分解。實驗中控制最佳微波功率400 W,沖泡液中總黃酮得率0.437%。

圖9 微波功率對沖泡液中總黃酮得率的影響Fig.9 Result of microwave power on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.2 苦蕎茶微波沖泡工藝的響應面優化

2.3.2.1 多元響應模型的建立 云南苦蕎茶微波沖泡工藝的響應面分析方案如表5所示,響應面分析結果顯示,微波沖泡液中總黃酮得率介于0.220%～0.391%之間。當沖泡茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波時間180 s、微波功率500 W時,實驗測得微波沖泡液中總黃酮得率達到最大值0.391%。擬合實驗數據,獲得以微波沖泡液中總黃酮得率為響應值的多元響應模型為:

Y2(%)=+0.39-0.049A+6.750E-003B+0.014C-2.250E-003AB+2.250E-003AC-7.500E-004BC-0.092A2-9.625E-003B2-5.625E-003C2

表5 響應面分析方案及結果Table 5 RSM design and experimental results of total flavonoid yield

2.3.2.2 多元響應模型的方差(ANOVA)分析 苦蕎茶微波泡液總黃酮得率與沖泡茶水比、微波時間和微波功率三個響應因子之間符合Quadratic多元響應模型,模型的p值<0.0001,失擬項1.000E-04極低,預示著該模型及各項的顯著性。較小的變異系數(1.36)預示著響應模型重現性較好,置信度越高。0.9981的相關系數,說明該數學模型可用于解釋幾乎全部的實驗數據,相關系數和調整系數小數點后第3位上的差別,較高的信噪比45.598,說明該模型對響應值一定程度上具有精確的預測作用。

表6 響應面分析多元回歸模型的ANOVA分析Table 6 Analysis of variance(ANOVA)table for response surface quadratic model

圖10 各響應因子對響應值的交互作用,Fig.10 The interactive effects of each independent variable注:a：茶水比和微波時間;b：茶水比 和微波功率;c：微波時間和功率。

注:***p<0.001極其顯著;**p<0.01 非常顯著;*p<0.05 顯著。 顯著性水平差異分析結果顯示,B和B2對響應值影響非常顯著;A、C和A2對響應值影響極其顯著。三個交互項對響應值的影響可通過圖10的3D響應面圖和等高線圖形象描述,佐證三個響應因子對響應值的交互作用并不顯著。F值預示各響應因子對苦蕎茶沖泡液中總黃酮得率的影響次序為A>C>B。

2.3.3 驗證實驗 求解多元回歸方程,苦蕎茶微波沖泡的最佳條件為茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波時間170.42 s、微波功率402.55 W,此條件下,理論擬合微波沖泡液黃酮得率最大值為0.393%。為便于操作驗證實驗微波沖泡條件修正為茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波時間170 s、微波功率400 W,在此條件下重復沖泡三次,微波沖泡液黃酮得率的實驗值為0.387%±0.003%,和多元模型理論擬合值0.393%的絕對誤差為-0.006%,吻合的非常好,佐證了多元模型可優化苦蕎微波沖泡工藝。

3 結論

本論文在單因素實驗基礎上,研究了傳統和微波兩種苦蕎茶沖泡工藝的響應面優化過程,建立了多元響應數學模型,分析模型確定最佳沖泡工藝,擬合方程獲得沖泡液中總黃酮得率最大理論值。驗證實驗結果顯示,傳統沖泡最佳條件為茶水比2.00∶100 (g∶mL)、沖泡溫度100 ℃、沖泡時間45 min,實驗測得沖泡液總黃酮得率平均值為0.0350%±0.003%;與理論預測值0.0357%有-0.0007%的誤差。微波沖泡最佳條件為茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波時間170 s、微波功率400 W,實驗測得沖泡液總黃酮得率平均值為0.387%±0.003%;與響應模型預測值0.393%有-0.006%的誤差。

傳統和微波兩種苦蕎茶沖泡工藝中,沖泡液中總黃酮得率的實驗測定值和理論擬合值吻合良好,進一步佐證多元響應模型的顯著性和對響應值的精準預測作用。對比傳統和微波兩種沖泡工藝的實驗結果:微波沖泡液中總黃酮得率相對于前者提高了將近十倍,微波沖泡極大的縮短了沖泡時間,提高了沖泡效率。

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