應用多重實時熒光PCR檢測 蠟樣芽胞桿菌毒力基因

劉 芳,陳國培,王遠洋,郭正洋,陳 晶,劉鐘棟,蘭全學,*

(1.深圳市計量質量檢測研究院,廣東深圳 518000;2.河南工業大學,河南鄭州 450000)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是一類在周圍環境中廣泛存在,革蘭氏陽性兼性厭氧菌。該菌是一種常見的食源性致病菌,淀粉類,肉類,乳制品均有蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒的報道[1]。該菌可引起嘔吐和腹瀉兩種常見的食物中毒癥狀,嘔吐毒素是一種小的熱和酸穩定循環肽,因此被食用后在胃部不能被消化,在感染數個小時后即可引起嘔吐;腹瀉毒素則是由一組熱不穩定的蛋白質組成,感染了蠟樣芽胞桿菌的食物進入腸道后,細菌增殖代謝產生腸毒素,在8～16 h后引發腹瀉[2-3]。

目前常用的檢測蠟樣芽胞桿菌的方法為傳統生化方法,實驗周期長(>72 h),重復性差,操作繁瑣。免疫學檢測方法利用抗原抗體免疫機理對蠟樣芽胞桿菌進行檢測,容易產生交叉反應,特異性不強,且價格昂貴,存在較大的應用局限性。近年來,由于實時熒光PCR重現性好、特異性強,作為快速準確的核酸分子定量和定性的手段，越來越多的運用于分子生物學領域。利用PCR技術檢測蠟樣芽胞桿菌的文獻不少,例如王振國[4]利用溶血性腸毒素hblA基因作為目的基因,使用PCR方法來鑒定蠟樣芽胞桿菌,結果特異性、靈敏性良好。Wehrle[5]等溶血性腸毒素hbl,非溶血性腸毒素nhe和細胞毒力基因cytK設計引物構建多重PCR體系,對引起腹瀉的蠟樣芽胞桿菌進行了檢測。蔣培余等[6]設計了一個多重實時熒光PCR體系來鑒定蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌。但是,蠟樣芽胞桿菌腸毒素的特異性一直受到質疑,M L Chen等[7]以蠟樣芽胞桿菌的16S rRNA和gyrB為目的基因設計引物使用PCR方法分辨蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌,結果表明部分蘇云金芽胞桿菌同樣含有上述基因,有相同的擴增片段。Bjarne Munk Hansen[8]利用PCR方法對蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的腸毒力基因進行檢測,發現部分蘇云金芽胞桿菌也攜帶腸毒力基因。

表1 菌株列表Table 1 The table of experimental strains

實時熒光PCR由于快速、準確和特異性強等優點,在蠟樣芽胞桿菌檢測方向的應用越來越受到人們的重視,由于蠟樣芽胞桿菌攜帶多個毒力基因,多重實時熒光PCR在其檢測上則顯得更加適用。本文以蠟樣芽胞桿菌的主要毒力基因(嘔吐毒素ces基因,與腸毒素相關的溶血素hblA,hblC,hblD基因,非溶血性腸毒素nheA,nheB,nheC基因,腸毒素entFM基因,細胞毒素bceT基因)設計特異性引物,建立多重實時熒光PCR體系對其進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 實驗菌株見表1;碳水化合物鑒定試劑條API 50CH、腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒API 20E、Premix預混合液RR390A(TAKALA)、引物和探針 均由上海生工生物工程股份有限公司合成;所用培養基 均購自北京陸橋技術股份有限公司;血瓊脂平板 購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定系統 法國梅里埃公司;3-30K冷凍離心機 SIGMA;ND-1000分光光度計 Gene Company Limited;MX3005P實時熒光PCR儀 美國安捷倫公司;D1100金屬干浴器 Labnet Internationnal。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 在30 ℃下用營養肉湯培養24 h,取450 μL菌液,無菌生理鹽水洗滌,12000×g離心2 min,棄上清,重復洗滌離心一次,加入450 μL裂解液(100 mg/L蛋白酶K,10 mmol/L Tris-HCI,15 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,4 g/L SDS pH8.0),重懸細胞,55 ℃孵育3 h。加450 μL平衡酚(酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1),混勻,12000×g離心10 min,轉移上層水相。加入450 μL氯仿∶異戊醇(24∶1),混勻,12000×g離心10 min。轉移上層水相,加入45 μL 3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)和450 μL異丙醇,混勻,置于-20 ℃冰箱30 min后,12000×g離心15 min,棄去上清。以500 μL 70%乙醇洗滌2次,晾干后,加入50 μL TAE,混勻-20 ℃保存備用[9]。

表2 引物和熒光探針核苷酸序列Table 2 The primers and probes

合成ces基因質粒作為PCR體系擴增的陽性模板。

1.2.2 引物和探針設計 從NCBI中獲取相應毒力基因的序列,進行同源性比較,選取保守序列,設計相應的引物探針。引物和探針序列以及體系中的濃度見表2。

1.2.3 反應體系的建立 反應體系:2×Premix預混合液(包含dNTPS,Mg2+,Taq酶,緩沖液)10 μL,cDNA 2 μL,引物探針濃度見表2,無菌去離子水補至20 μL。

擴增條件:95 ℃,3 min;95 ℃ 5 s;60 ℃ 40 s,進行40個循環[10]。每次實驗均使用空白對照。

以ATCC 10876、ATCC 11778、ATCC 14579、ATCC 7064提取的DNA以及ces基因質粒作為實驗用DNA模板進行多重實時熒光PCR體系的建立。

1.2.4 特異性 以蠟樣芽胞桿菌(ATCC 14579)的DNA作為陽性對照模板DNA,無菌去離子水作為空白對照模板DNA,分別對副溶血性弧菌,大腸埃希氏菌,志賀氏菌等細菌純培養后提取的DNA(DNA提取方法同1.2.1)進行嘔吐毒素ces基因,溶血性腸毒素hblA,hblC,hblD基因,非溶血性腸毒素nheA,nheB,nheC基因,腸毒素entFM以及bceT基因的多重實時熒光PCR反應的檢測[11]。

1.2.5 靈敏性 使用營養肉湯振蕩培養蠟樣芽胞桿菌(ATCC 14579)24h,用無菌生理鹽水制備10-1～10-88個梯度的菌液,分別使用1.2.1的方法提取DNA,同時對每個梯度菌液用MYP平板涂布計數。以蠟樣芽胞桿菌ATCC 14579的各梯度的DNA作為標準菌株模板,無菌去離子水作為空白對照,對多重體系的靈敏性進行測試[12]。

1.3 數據處理

基因的PCR擴增圖譜均由實時熒光PCR儀MX3005P產生,后由Photoshop 7.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 多重實時熒光PCR體系的建立

利用熒光PCR體系對蠟樣芽胞桿菌標準菌株毒力基因的擴增圖譜如圖1～圖3,每個體系的基因擴增曲線有著較明顯的熒光增加量的區別,三個基因擴增結果較為容易區分。

圖1 標準菌株的三重hblA,hblC,hblD基因的 熒光PCR體系擴增圖譜Fig.1 Amplification plot of the triple PCR system for hblA,hblC and hblD genes to the standard strains

Guinebretiere MH[13]實驗中蠟樣芽胞桿菌ATCC14579攜帶hblA,hblC,hblD基因。Hansen BM[8]研究結果顯示ATCC10876攜帶hblA,hblC,hblD基因和nheA,nheB,nheC基因;ATCC11778攜帶nheA,nheB,nheC基因,但不攜帶hblA,hblC,hblD基因;ATCC7064攜帶hblA,hblC,hblD基因和bceT基因。Seav-Ly Tran[14]研究顯示ATCC14579攜帶ent-FM基因。本文應用多重體系對蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、ces基因的檢出率為0%,hblA,hblC,hblD基因檢出率均為38.5%,nheA,nheB,nheC基因分別為46.2%、61.5%、38.5%,entFM和bceT基因分別為76.9%和61.5%。蘇云金芽胞桿菌(CICC20695)攜帶nheB,nheC,entFM,bceT基因;枯草芽胞桿菌(CICC10721和ATCC9372)攜帶entFM,bceT基因;巨大芽胞桿菌(CICC23035)、枯草芽胞桿菌(CICC10275)、蕈狀芽胞桿菌(CICC21473)均未攜帶毒力基因。結果表明,ces基因的分布稀少;這些毒力基因在蠟樣芽胞桿菌不同菌株之間的分布不盡相同;相關毒力基因并不是蠟樣芽胞桿菌特有的,在芽胞桿菌屬中也有可能存在。

表3 芽胞桿菌屬細菌毒力基因分布情況Table 3 Distribution of toxin genes in Bacillus

圖2 標準菌株的三重nheA,nheB,nheC基因的 熒光PCR體系擴增圖譜Fig.2 Amplification plot of the triple PCR system for nheA,nheB and nheC genes to the standard strains

圖3 標準菌株的三重ces,entFM和bceT 基因的熒光PCR體系擴增圖譜Fig.3 Amplification plot of the triple PCR system for ces,entFM and,bceT genes to the standard strains

注:“+”表示PCR擴增結果為陽性,“-”表示PCR擴增結果為陰性。蕈狀芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌進行毒力基因的檢測(表3),三個多重實時熒光PCR體系對蠟樣芽胞桿菌的毒力基因攜帶情況與文獻相符。

2.2 多重實時熒光PCR體系的特異性分析

對多重體系的特異性進行驗證,擴增結果如圖4～圖6。從圖中可以看出,除了陽性對照(ATCC14579)的擴增結果為陽性,非芽胞桿菌屬細菌擴增結果均為陰性,上述體系對于對應的基因在本次研究的各種菌中具有較好的特異性。

圖4 三重hblA,hblC,hblD基因的 熒光PCR體系特異性實驗Fig.4 Specificity test of the triple PCR system for hblA,hblC and hblD genes

圖5 三重nheA,nheB,nheC基因的 熒光PCR體系特異性實驗Fig.5 Specificity test of the triple PCR system for nheA,nheB and nheC genes

圖6 三重ces,entFM和bceT基因的 熒光PCR體系特異性實驗Fig.6 Specificity test of the triple PCR system for entFM,bceT and ces genes

2.3 多重實時熒光PCR體系的靈敏性分析

經MYP涂布培養,蠟樣芽胞桿菌(ATCC14579)原液的濃度為6.3×106CFU/mL。利用不同稀釋倍數的菌液提取的DNA進行多重實時熒光PCR測試。選擇多重體系中的hblD、nheB、bceT三個基因的擴增曲線進行靈敏性測試。在圖7～圖9中,6.3×106～6.3×101CFU/mL的不同濃度菌液提取的DNA均有擴增,多重體系對蠟樣芽胞桿菌的最低檢出限為6.3×101CFU/mL。

圖7 hblD基因的靈敏性實驗Fig.7 Sensitivity test of hblD gene

圖8 nheB基因的靈敏性實驗Fig.8 Sensitivity test of nheB gene

圖9 bceT基因靈敏性實驗Fig.9 Sensitivity test of bceT gene注:1～6分別代表以濃度為6.3×106,6.3×105,6.3×104,6.3×103,6.3×102,6.3×101 CFU/mL旳 菌液所提取的DNA模板多重PCR擴增結果。

3 討論與結論

針對蠟樣芽胞桿菌的毒力基因ces,hblA,hblC,hblD,nheA,nheB,nheC,entFM以及bceT基因設計引物和探針,本文利用TaqMan探針法建立了多個多重實時熒光PCR體系。從圖1可以看出,每個體系的幾種基因的擴增曲線有著較明顯的熒光增加量的區別,三個基因擴增結果較為容易區分。另外,多重PCR體系的結果與各個毒力基因對應的單重體系的結果相吻合,也驗證了其準確性。圖2中除了陽性對照外,其他菌擴增結果均為陰性,說明多重PCR體系在屬的水平上具有良好的特異性。利用梯度稀釋后提取的DNA進行多重PCR實驗,結果表明三個多重體系都在6.3×101CFU/mL水平上有擴增,其最低檢出限為6.3×101CFU/mL,與李志勇等[15]的6.1×101CFU/mL的靈敏度基本一致。

利用多重PCR體系對蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌等13株芽胞桿菌進行實驗,其基因攜帶情況如表3。其中四株標準菌株ATCC 10876[8],ATCC 11778[8],ATCC 14579[13-14],ATCC 7064[8]的基因攜帶情況與文獻中的相符。實驗結果表明,毒力基因hblA,hblC,hblD在每個菌中的攜帶情況高度一致,nheA,nheB,nheC基因在ATCC 7064,CICC 23828,CICC 10041分布并不一致,在其他菌中的攜帶情況一致,閆韶飛等[16]稱hblA,hblC,hblD三個基因全為陽性時菌株才具有毒性,nheA,nheB,nheC都為陽性時毒性最強,本文hblA,hblC,hblD三個基因均為陽性者如ATCC 10876、ATCC 14579、ATCC 7064、CICC 21261等具有毒性,nheA,nheB,nheC基因都為陽性的ATCC 10876、ATCC 11778、ATCC 14579、CICC 21261具有強毒性;entFM存在于所有蠟樣芽胞桿菌中,這與entFM基因在蠟樣芽胞桿菌普遍存在的說法相符[17]。蘇云金芽胞桿菌也含有相關的腸毒力基因nheB、nheC、entFM、bceT,說明腸毒力基因在芽胞桿菌屬中特別是蘇云金芽胞桿菌也有可能攜帶[18]。實驗菌株中沒有ces基因陽性菌株,驗證了ces基因在蠟樣芽胞桿菌或者芽胞桿菌屬中分布較少的說法。

隨著對食品中蠟樣芽胞桿菌的越來越重視,對其毒力基因的研究也在加深。本文設計的多重PCR體系涵蓋了嘔吐毒素ces基因,溶血性腸毒素hblA,hblC,hblD基因,非溶血性腸毒素nheA,nheB,nheC基因,腸毒素entFM以及bceT基因等蠟樣芽胞桿菌的毒力基因。實驗結果表明上述體系的特異性良好,靈敏度可以達到63 CFU/mL。因此,TaqMan探針法可更快速,準確,簡便對相關基因進行擴增檢測,對蠟樣芽胞桿菌的毒力基因更深入的研究提供依據和便利。

[1]周幗萍,梁天光,丁淑娟. 1986-2007年中國 299起蠟樣芽胞桿菌食物中毒案例分析[J].中國食品衛生雜志,2009,21(5):450-454.

[2]PE Granum.Bacilluscereus[J]. Michael P Doyle,1997,17(12):343-353.

[3]NotermansS,CA Batt. A risk assessment approach for foodborneBacilluscereus and its toxins[J]. Symposium,1998,84(27):51S-61S.

[4]王振國,劉金華,肖成蕊.利用PCR技術檢測致病性臘樣芽胞桿菌的研究[J]. 生物技術,2005,15(5):45-47.

[5]Wehrle E,Moravek M,Dietrich R,et al. Comparison of multiplex PCR,enzyme immunoassay and cell culture methodsfor the detection of enterotoxinogenicBacilluscereus[J]. Journal of Microbiological Methods,2009,78(3):265-270.

[6]蔣培余,于新芬,潘勁草. 多重實時熒光PCR檢測金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌[J]. 現代預防醫學,2009,36(11):2104-2107.

[7]M L,Chen H Y,Tsen. Discrimination ofBacilluscereusandBacillusthuringiensiswith 16S r RNA and gyr B gene based PCR primers and sequencing of their annealing sites[J]. Journal of Applied Microbiology,2002,92:912-919.

[8]Hansen BM,Hendriksen NB. Detection of EnterotoxicBacilluscereus andBacillusthuringiensisStrains by PCR Analysis[J]. Applied and Environmental Microbiology,2001,67(1):185-189.

[9]曹國清. 酚/氯仿抽提法提取綿羊凝血塊中基因組DNA[J]. 安徽農業科學,2009,37(34):1677-16772.

[10]沈圣,余娟. TaqManTM實時熒光PCR快速檢測蠟樣芽胞桿菌的初步研究[J].中國衛生檢驗雜志,2003,16(12):1434-1436.

[11]VesaMantynen,Kristina Lindstrom. A Rapid PCR-Based DNA Test for EnterotoxicBacilluscereus[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(5):1634-1639.

[12]王振國,劉金華,徐寶梁.應用實時熒光 PCR檢測致病性蠟樣芽胞桿菌[J]. 生物技術通訊,2006,17(1):040-042.

[13]Guinebretiere MH,Broussolle V,Nguyen-The C.Enterotoxigenic Profiles of Food-Poisoning and Food-BorneBacilluscereusStrains[J]. Journal of Clinical Microbiology,2002,40(8):3053-3056.

[14]SL Tran,E Guillemet,M Gohar et al.Cwp FM(Ent FM)is aBacilluscereuspotential cell wall peptidase implicated in adhesion,biofilm formation,and virulence[J]. Journal of bacteriology,2010,192(1):2638-2642.

[15]劉志勇,趙雪濤,陸敏. Real-time PCR 測定食品中蠟樣芽胞桿菌的數量[J]. 中國衛生檢驗雜志,2012,22(8):1858-1863.

[16]閆韶飛,閆旭,甘辛.我國市售嬰兒配方乳粉中蠟樣芽胞桿菌污染及其毒力基因調查[J]. 中國食品衛生雜志,2015,27(3):286-290.

[17]I Nooratiny,AM Sahilah. Detection of enterotoxin targetedentFMandhblAgenes by inoculatingBacilluscereus(Strain BC1)into ready-to-eat food(RTF)and drink samples using polymerase chain reaction(PCR)[J]. International Food Research Journal,2013,20(4):1895-1899.

[18]黃必旺，黃志鵬,關雄.蘇云金芽胞桿菌腸毒素的研究進展[J]. 中國農學通報,2008,24(3):292-295.