總峰面積對糖化血紅蛋白結果的影響及其2種方法的比較*

張 偉，湯學彪，胡江紅，付魏萍，汪永強，袁平宗

(四川省內江市第二人民醫院檢驗科 641100)

糖化血紅蛋白儀D-10在分析通路中將分離的血紅蛋白經光感測量計在415 nm處測量，經臨床數據處理軟件(CDM)收集還原得到色譜流出曲線圖(簡稱色譜圖)，其縱坐標為檢測器的響應信號，橫坐標為時間、體積或距離。利用高斯函數(EMG)通過微積分可計算糖化血紅蛋白(HbA1c)對應的峰面積占血紅蛋白總峰面積的百分比。但實際使用中常會出現小于1 M而報信號的情況，其對應的檢測結果可能并不真實，需要提高總峰面積進行復查。大多數實驗室則依據儀器說明采用稀釋模式(即5 μL全血+1.5 mL稀釋液)進行復查，本實驗室常根據血紅蛋白水平采用低速離心或自然沉降后按吸去多余比例的血漿，經再次重新混勻全血而達到提高血紅蛋白(Hb)水平并增加總峰面積的效果，有效避免了預稀釋帶來的基質效應。2種處理方法均有提高總峰面積的作用，但提高多少不盡相同。且不同總峰面積所對應結果的差異也未知?，F通過觀察不同總峰面積下峰異常發生率及對檢測結果的影響，探討2種處理方法能否滿足日常檢測要求及其差異，為提高HbA1c檢測質量及標準化提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將一個試劑包使用期間所有符合要求的患者標本數據納入回顧性分析，包括原管標本和總峰面積小于1 M時2種復查處理方法的標本。采用EDTA-K2抗凝標本，出現凝塊時需病房重新抽取。根據《糖化血紅蛋白實驗室檢測指南》要求，本實驗室每日高低值質控均符合質量指標(≤靶值±0.3% HbA1c)時進行標本檢測。依據儀器操作規程中對結果可接受性的要求，排除有異常血紅蛋白HbC和HbS，以及HbF≥10%的標本，同時排除易生成甲?；t蛋白的腎衰竭患者標本[1]。峰異常是指基線漂移和滯留時間異常，如A1c和A0峰未出現在正確的窗口處或LA1c-1峰面積大于4.0%或LA1c-2峰面積大于3.5%，以及A0峰前大于或等于2個unknown峰，或A0峰后出現variant-window及其他峰等干擾A1c峰計算的情況。

1.2方法 (1)糖化血紅蛋白儀D-10的一個試劑包使用期內，每日保證室內質控符合質量指標要求，且每日標本先全部原管進樣，如果有標本量偏少的原管可在管槽底墊上1～2個專用橡膠墊。由于紅細胞沉降率過快而導致加樣失敗無結果的標本須混勻后重新進樣。出現總峰面積小于1 M的標本時，需按2種處理方法進行復查：一種是將標本充分混勻后按手工稀釋模式(5 μL標本+1.5 mL wash/dilution液)上機重測；一種是原管1 500 r/min離心2 min后，棄去一定量的上層血漿并混勻上機測試，即全血處理模式。吸走的血漿量根據劉世文等[2]研究結果：Hb<50 g/L的標本吸走800 μL血漿，50～65 g/L吸走500 μL，>65 g/L吸走200 μL。如果仍然出現總峰面積小于1 M可繼續1 500 r/min離心2 min后吸走100～200 μL血漿混勻上機，直到總峰面積大于或等于1 M，標本量過少仍然采用墊橡膠墊的方法。而手工稀釋模式則注意wash/dilution液從冰箱取出后需恢復至室溫使用，總峰面積仍小于1 M時可視情況增加標本量重新稀釋上機。根據納入和排除標準，對符合要求的標本數據進行回顧性分析。分析每個數據的色譜圖并記錄總峰面積、HbA1c值及有無峰異常等數據。(2)計算原管進樣標本中總峰面積小于1 M的出現率，比較原管標本中總峰面積小于1 M與大于或等于1 M標本的峰異常率。將前者分為峰異常組和無峰異常組并以與全血處理模式的值偏倚小于或等于0.3% HbA1c為質量指標[1,3]。比較2組總峰面積和指標符合率的差異。(3)分別比較全血處理模式及手工稀釋模式與總峰面積小于1 M標本的峰異常率，并比較2種處理方法間總峰面積和HbA1c值的差異。

2 結 果

2.1原管進樣峰異常發生率結果比較 納入該研究的原管進樣標本數257例，其中有5例標本因紅細胞沉降率過快導致無結果。經再次充分混勻進樣最終有56例總峰面積小于1 M標本，占21.79%?？偡迕娣e小于1 M的標本有8個出現峰異常，異常率14.29%；總峰面積大于或等于1 M的標本有2例出現峰異常，異常率1.00%，差異有統計學意義(χ2=20.688，P<0.05)。見表1。

表1 原管總峰面積小于1 M和大于或等于1M的峰異常率結果比較

2.2峰異常與總峰面積大小和質量指標符合率的相關性 將總峰面積小于1 M標本分為峰異常組和無峰異常組，峰異常組總峰面積(454 224±174 139)，質量指標符合率(2/8,25.0%)；無峰異常組總峰面積(656 782±161 523)，質量指標符合率為(40/48,83.3%)。兩者總峰面積比較，差異有統計學意義(P<0.05)；質量指標符合率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.32種處理方法對峰異常的影響結果比較 全血處理模式與手工稀釋模式均發現1例峰異常，且為同一標本，異常率均為(1/56,1.79%)，兩者峰異常率低于原管進樣總峰面積小于1 M的標本(P=0.016，P<0.05)。見表2。

2.42種處理方法總峰面積和HbA1c值結果比較 全血處理模式總峰面積(1 331 550±187 418)，HbA1c值(8.2±2.6)%；手工稀釋模式總峰面積(2 094 057±493 850)，HbA1c值(8.3±2.6)%，差異均有統計學意義(P<0.05)。2種處理模式所有標本結果中最大偏倚值為0.2% HbA1c，符合質量指標要求。見圖1。

表2 2種處理方法與峰面積小于1 M標本峰異常率結果比較(n)

圖1 2種處理模式總峰面積和HbA1c值結果比較

3 討 論

HPLC法測定HbA1c是采用的歸一化法，該法特點是所有出峰情況全部匯于色譜圖上計算A1c峰占總峰面積的百分比。D-10糖化血紅蛋白儀要求總峰面積須在1～4 M，偏低和偏高都可能使結果不能被接受。其中總峰面積偏高的情況除去手工稀釋模式不按標準操作外基本不會遇到，而總峰面積偏低是實驗經常遇到的問題。本研究總峰面積小于1 M的比例就高達21.79%，這主要是因為標本量不足及Hb水平偏低和/或紅細胞沉降過快，總之可以歸結為樣品針加入了低Hb導致。D-10糖化血紅蛋白儀一次可進樣10例標本，但無自動混勻功能，如果有紅細胞沉降率過快的標本或置于標本后幾個孔位，極易導致低總峰面積甚至無結果，本研究257例標本出現了5例標本由于紅細胞沉降率過快而無結果，而臨床檢測的大部分低Hb標本是因為患者的低血紅蛋白癥引起。范秀芳等[4]通過研究發現糖尿病患者多有貧血，其中糖尿病腎病患者更易發生貧血且貧血程度較重。賈連玲等[5]將糖尿病合并貧血組與單純糖尿病組進行比較，Hb和HbA1c水平均明顯降低(P<0.01)。歸其原因，不排除紅細胞生存周期縮短而導致HbA1c假性降低，但從實驗本身則疑似樣品針加入低水平Hb引起低總峰面積而致使HbA1c值偏低，正如本研究全血處理模式和手工稀釋模式進行比較，總峰面積和HbA1c值同時偏低(P<0.05)，提示總峰面積的高低會影響HbA1c值的差異，即引起系統誤差。

本研究總峰面積小于1 M峰異常率顯著增大，從而出現峰異常組質量指標符合率顯著低于無峰異常組，這可能是峰異常引起隨機誤差增大所致。而峰異常主要表現為無峰或出現負峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況，其均會影響色譜分析結果，可能與方法學有關[6]。因為Hb中某些微量成分或其他雜質可能表現為雜峰或未知峰，當總峰面積滿足一定的大小時其影響較小，但總峰面積偏低時其影響效果會被隨之放大。其次，A1c峰往往與前HbA1c(西弗氏堿) 或氨基乙?；腍b峰有一部分交錯重疊，通過微積分將類高斯對稱峰加以修正并計算結果，當總峰面積偏低后其分辨率也可能相對降低而導致分析和計算誤差。馮仁豐[7]解釋異常Hb對HbA1c的干擾原理，總峰面積作分母，包括所有峰，出現異常峰后分母的數字被放大，導致最后計算得到HbA1c值縮小。另外本實驗獲得的峰異常組總峰面積和指標符合率均顯著低于無峰異常組(P<0.05)，同時表1和表2顯示峰異常率增加與總峰面積偏低有關，以及峰異常會引起檢測結果的不準確。

劉世文等[2]對Hb偏低的處理是將血液濃縮即通過離心→棄掉部分上層血漿→混勻檢測效果明顯，本研究根據其經驗實行不同Hb水平范圍吸取不同量的血漿，充分混勻并及時加樣防止紅細胞沉降率過快的影響，同時禁止過分濃縮以防止高水平Hb進入色譜柱縮短其使用壽命。而另一種處理方法則是常規稀釋模式，<1 M則采用標本加量的方法。本研究表明這2種處理方法雖然總峰面積都滿足1～4 M要求，但手工稀釋模式總峰面積明顯大于全血處理模式(P<0.05)，且前者HbA1c結果大于后者0.1% HbA1c存在系統誤差，該系統誤差對應的均值為8.2% HbA1c；由于HbA1c水平越低該誤差會越不明顯，所以對糖尿病診斷界值(≥6.5% HbA1c)而言，2種處理方法的系統誤差會降低。而高水平HbA1c標本往往只作為糖尿病治療效果的監測，該誤差也無關緊要?？傊?，該誤差符合小于或等于0.3% HbA1c的質量指標要求，2種處理方法都可采用。但同時這個系統誤差的問題也應該值得重視，如進行儀器間比對或不同標本間結果比較時都應當采取同一種處理方法。

[1]糖化血紅蛋白測定專家共識委員會．糖化血紅蛋白測定專家共識[J]．中華糖尿病雜志，2014，6(12)：853-858．

[2]劉世文，崔海麗，侯云修.高效液相色譜法檢測HbA1c未檢出結果的原因分析[J].國際檢驗醫學雜志，2012，20(9)：2528-2530.

[3]SACKS D B,ARNOLD M,BAKRIS G L,et al.Position statement executive summary:guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus[J].Diabetes Care,2011,34(6):1419-1423.

[4]范秀芳，王嘉佳，刁建輝，等.糖尿病腎病與非糖尿病腎病貧血的對照研究[J].中國當代醫藥,2015,19(24):35-37.

[5]賈連玲,王欣茹,鄧龍華,等.糖尿病合并貧血患者糖化血紅蛋白檢測的臨床意義[J].西北國防醫學雜志,2017,20(1):51-53.

[6]龔時瓊.高效液相色譜分析中異常峰的分析與處理[J].實驗技術與管理，2010，15(6)：37-38.

[7]馮仁豐.糖化血紅蛋白標準化和檢測準確度現狀(續)[J].檢驗醫學，2016，28(6)：437-441.