增齡條件下Wnt/β-catenin信號通路在骨髓間充質干細胞中的變化*

劉娜 張賢華 李影 張維 楊坤 顧斌

隨著增齡的變化，人體多種重要器官由于干細胞維持組織平衡能力下降，出現衰老相關疾病表現，與人體大部分組織器官一樣，骨具有發育、增齡、衰老的過程和受損后的再生能力，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨組織代謝或骨改建的重要細胞學基礎[1]。在骨發育、衰老和再生修復中干細胞起到了主導作用，同時干細胞的各項功能受到嚴密的分子調控，這些調控因素不僅是維持骨生理性功能活動的基礎，而且是決定病理狀態產生、發展和轉歸的機制。

經典的Wnt/β-catenin信號在骨骼的發育和代謝方面有重要作用。近年來的研究提示，Wnt信號通路與干細胞的增齡變化有密切關系，有學者發現Wnt/β-catenin信號通路對骨髓間充質干細胞的衰老發揮重要調控作用[2]，也有研究表明Wnt/β-catenin信號通路可以通過促進細胞產生ROS進而誘導間充質干細胞的衰老[3]。除此之外，機體的生理、病理狀態發生改變會改變干細胞所處的微環境，進而影響干細胞內Wnt信號通路的活化水平[4-7]。本研究采用不同年齡大鼠來源骨髓間充質干細胞結合Wnt/β-catenin信號通路來探討增齡因素導致的體內環境改變對間充質干細胞的影響。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，L-DMEM培養基(Gibco BRL)；0.25%胰蛋白酶(Sigma,St Louis,MO,美國)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司)；RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒(Fermentas，美國)；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中國)；Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒(Takara，日本)；衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，Westen及IP裂解液，核蛋白提取液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司，中國)；IL-6、TNF-αELISA檢測試劑盒(R&DSystems，美國)；β-catenin(Abcam，美國)；β-Act in，羊抗兔IgG(中杉金橋，中國)。

1.2 實驗動物 3月齡級18月齡SD大鼠共16只，均為雄性大鼠，每組各8只，平均體重(590±17)g，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供。各月齡實驗動物適應性喂養一周后，兩組實驗動物處死，取雙側股骨，每個樣本取單側股骨-80℃冰箱保存待查，另一側股骨進行細胞培養。

1.3 骨密度測定 采用Discovery Wi(Hologic，美國)雙能X線骨密度儀對實驗動物的股骨樣本進行骨密度測定。首先將骨組織樣本放置在骨密度儀探頭下，應用動物骨密度測定軟件，自動分析出大鼠股骨的骨密度。

1.4 骨髓間充質干細胞的體外培養 骨髓間充質干細胞的體外培養及鑒定遵循本實驗室前期的實驗步驟[6]。3月齡及18月齡SD大鼠各8只，脫頸處死，消毒后取下股骨，無菌去除骨組織周圍肌肉及筋膜等軟組織，暴露骨髓腔。用注射器吸取L-DMEM培養基，反復沖洗骨髓腔，將所得懸液以1500r/min離心5min。重懸細胞，加入培養基(90%L-DMEM和10%胎牛血清)，放入37℃、5%CO2恒溫培養箱培養，48h后半量換液，3d后鋪滿瓶底80%時傳代。采用低密度稀釋法擴增培養獲取BMSCs,取3-4代細胞進行實驗。

1.5 衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal染色) 將純化獲取的P3代BMSCs制成單細胞懸液，以5×104個／mL的密度接種于6孔板中，常規培養至細胞融合達50%。按衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測說明首先將細胞用β-半乳糖苷酶固定劑固定10min，PBS洗滌三次(每次3min)后，隨后用新鮮制備的β-半乳糖苷酶的染色工作液對細胞進行染色，37℃放置12h，隨機選擇10個微觀領域的陽性染色細胞計數。

1.6 細胞因子酶聯免疫吸附測定(ELISA檢測)將P3代BMSCs按1×105個/mL的密度接種到24孔板中，每孔800ul，每組設3個復孔。待細胞貼壁后，棄原培養液，PBS沖洗1遍，換新鮮的L-DMEM(10%FBS)進行常規培養，72h后收集各個培養孔內的培養液，離心后取上清液進行ELISA檢測。按照TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒說明建立標準曲線后每孔加入待測樣品100μl，洗板，每孔加入一抗工作液50μl反應板充分混勻后置于37℃60min，洗板，加入酶標抗體工作液100μl反應板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反應10min，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。

1.7 Western blotting檢測BMSCs中的蛋白表達 將P4代3月齡及18月齡BMSCs以2×105個/mL的密度接種于直徑9cm的培養皿中，培養72h細胞密度達70%，在預冷的PBS中清洗3遍，采用細胞裂解液試劑盒分別提取各組標本中的總蛋白，另外根據實際說明應用細胞核蛋白、細胞漿蛋白抽提試劑盒分離提取BMSCs細胞核蛋白。采用BCA法測定蛋白樣本濃度，沸水煮5min，12000r/min離心1min，制備蛋白樣品，－20℃保存。配置8%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS電泳液，依據蛋白定量結果進行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min，待溴酚藍進入分離膠后調整電壓至 120V，電泳 60min。在轉移電泳槽(200mA，2h)中將凝膠中的蛋白轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜，用 TBST配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液封閉2h，PVDF膜封閉β-catenin(1∶800)，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF膜，用TBST洗膜，每次5min，共計3次。按說明書加入1∶1000工作濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共計3次。漂洗膜后加入電化學發光底物發光顯色試劑盒顯色，采用蛋白凝膠成像系統照相觀察。

1.8 實時定量PCR 檢測BMSCs基因表達將2組P4代BMSCs以1×105個/mL的密度接種至T25培養瓶，待細胞貼壁后PBS沖洗兩遍，隨后換液進行常規培養，72h后用Trizol裂解并提取總RNA，測定RNA濃度，分別逆轉錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應管中進行擴增，反應體系均為20μl。引物序列：TERT：Forw ard 5’-CTAGCATCCTGCTGCTACGC-3’，Reverse 5’-AGGGGACAGGGTTAGTCCAA-3’； LEF-1：Forward 5’-TCAGGCAAGCCTACCCATCTTC-3’，Reverse5’-GGGTGCTCCTGTTTGACCTGA-3’；TCF-4：Forward 5’-TCCCAGTACTACC CATATTCCAGCA-3’，Reverse 5’-AGTCCCTG TTGTAGTCGGCAGTG-3’；β-Actin：Forward 5’-GGGTCCTCTGTGAACTTGCTC-3’，Reverse 5’-TGTAATCCTGTGGCTTGTCCTC-3’。反應條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環。采用實時熒光定量PCR儀監測記錄數據，結果根據標準曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復性和擴增效率。本實驗重復3次。

1.9 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；進行多組間比較時，P值進行Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 大鼠股骨密度測定結果 雙能X線檢測結果顯示隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低。我們所檢測的3月齡雄性大鼠股骨密度為0.394±0.0491g/cm2,18月齡雄性大鼠股骨密度為0.2540±0.0437g/cm2，其顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖1)。

圖1 大鼠股骨密度檢測(*P＜0.05)

2.2 SA-β-Gal染色檢測BMSCs增齡性變化將3月齡及18月齡大鼠BMSCs均勻接種，常規培養待細胞密度達到80%后進行SA-β-Gal染色。鏡下觀察細胞形態為長梭形，胞突略短，胞漿飽滿，細胞狀態良好。此外，2組均可見BMSCs成功染色，淺藍色為陽性，3月齡組少數細胞染色陽性，18月齡組細胞染色陽性數目較多(圖2A)。隨后我們將染色后細胞進行顯微鏡下計數，統計染色陽性細胞百分比，經10個視野的綜合統計分析可見18月齡BMSCs SA-β-Gal染色陽性率高達37.902%，顯著高于3月齡組BMSCs(P＜0.05，圖2B)。為了進一步驗證BMSCs的衰老程度，我們從基因水平檢測了TERT的表達，結果顯示18月齡BMSCs表達量顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖2C)。

圖2 3月齡及18月齡BMSCs SA-β-gal染色結果及TERT mRNA的相對表達量

2.3 增齡因素對BMSCs炎癥因子分泌量的影響 將3月齡及18月齡大鼠P3代BMSCs種到24孔板中，細胞貼壁72小時候提取細胞上清液進行ELISA檢測。在提取的細胞外基質中均檢測到了炎癥因子TNF-α及IL-6。檢測結果顯示18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α(P＜0.05，圖3A)及IL-6(P＜0.05，圖3B)均顯著高于3月齡BMSCs的炎癥細胞因子分泌量。

圖3 3月齡及18月齡大鼠BMSCs培養液中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌量

2.4 增齡因素對大鼠BMSCs Wnt/β-catenin信號通路的影響 由于Wnt信號通路骨發育及骨再生中發揮重要作用，在上述實驗的基礎上我們對經典Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白及基因進行檢測。首先我們分離提取3月齡及18月齡BMSCs的全細胞蛋白并進一步分離提取了細胞核蛋白。分別將3月齡及18月齡BMSCs的全細胞蛋白及細胞核蛋白進行Western Blot檢測，檢測結果顯示18月齡BMSCs無論全細胞蛋白還是細胞核蛋白的表達量均高于3月齡BMSCs組(圖4A)。Real Time PCR檢測結果顯示Wnt通路關鍵基因LEF-1及TCF-4在18月齡大鼠BMSCs中的表達顯著高于3月齡BMSCs組(P＜0.05，圖4B)。

圖4 3月齡及18月齡大鼠BMSCs常規培養72h后β-catenin蛋白的表達量及LEF-1、TCF-4 mRNA的相對表達量

3.討論

干細胞在機體中處于一種平衡狀態，但是隨年齡的增長，干細胞的功能受到一定影響，其平衡遭到破壞。機體增齡過程中，間充質干細胞的自我調節機制發生改變，從而使其某些生物學性狀不再穩定，主要表現為自身抵抗力的降低及其對外界環境刺激的反應能力的降低。骨髓間充質干細胞在骨骼發育和重建過程中發揮著重要作用，前期有文獻報道隨著小鼠年齡的增加BMSCs的增殖能力及成骨分化能力均受顯著抑制[8]。另有研究表明骨髓間充質干細胞的增殖能力隨著年齡增長或分裂次數的增加而下降，來自老年供體的間充質干細胞的增殖能力和抗凋亡能力均低于年輕供體來源的細胞[9]。

由于前期研究證實長期體外培養后間充質干細胞可能在基因表達、增殖和分化能力等方面發生變化甚至發生惡性轉化[10]，因此，本研究采用的是收集不同年齡階段大鼠的股骨骨髓進行骨髓間充質干細胞的分離培養，在此基礎上進行增齡因素對大鼠BMSCs的影響及可能的機制。首先我們通過對實驗動物的檢測發現隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低，在此基礎上我們再進一步進行干細胞衰老情況的鑒定。SA-β-Gal是被廣泛認可的經典細胞衰老標記物之一[11]，因此我們應用衰老相關β半乳糖苷酶染色試劑盒對兩組BMSCs的SA-β-Gal的表達水平進行檢測，染色結果顯示兩組BMSCs均有藍色沉淀形成，但是18月齡組BMSCs藍色沉淀的數量、面積等顯著高于3月齡組，這也與前期的報道一致[11]。端粒相對長度和端粒酶活性也是細胞增齡和衰老的重要指標，端粒酶是一種逆轉錄酶，由RNA和蛋白質組成，是以自身RNA為模板，合成端粒重復序列，加到新合成DNA鏈末端。因此，細胞每有絲分裂一次，就丟失一段端粒序列，當端粒長度縮短至一定程度，細胞停止分裂導致衰老與死亡。端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)起源于反轉錄轉座子，在其他輔助酶作用下利用RNA合成DNA，TERT是端粒酶起作用的關鍵結構和主要調控亞單位，可通過逆轉錄端粒酶R NA模板序列，合成端粒DNA重復序列并添加到染色體末端，從而延長端粒長度[12]。本課題應用 qRT-PCR對兩組BMSCs的端粒酶mRNA表達水平進行相關檢測。結果顯示18月齡BMSCs TERT表達量顯著低于3月齡BMSCs組。

前期研究表明隨著年齡的增長，機體功能在逐漸發生變化，當增齡性變化達到衰老程度時，天然免疫被激活并產生促炎介質，炎癥因子的水平會呈現不同程度的升高[13]。近期研究證實衰老與炎癥是相互作用的，衰老過程常伴隨炎癥穩態失衡，而炎癥又可導致衰老的發生發展[14]。我們通過將3月齡及18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α及IL-6進行對比，結果證實隨著年齡的增長BMSCs所分泌的細胞因子的水平顯著增高，這些結果與前期研究結果一致，表明增齡性變化會引起機體免疫水平的改變，使其炎癥因子表達增高進而使機體各器官產生衰老相關表型。在增齡性骨代謝過程中骨質及骨量都會隨著年齡的增加而減少，炎癥因子水平的升高會直接影響骨髓腔的微環境，TNF-α及IL-6水平的長期持續增高可以導致干細胞成骨分化能力的降低，并抑制干細胞的骨再生潛能。闡明增齡性骨代謝異常的作用機制并探尋增強增齡性BMSCs成骨分化能力是近期研究的熱點。

Wnt家族蛋白是體內一類重要的調節蛋白，參與機體生長發育、干細胞自我更新及腫瘤發展過程，同時在維持骨穩態中也起到重要作用。有文獻報道Wnt3a+/-雄性小鼠骨質含量較正常下降[15]。另有研究表明Wnt經典信號通路抑制成骨作用的原因是成骨細胞的轉錄因子的表達水平降低以及抑制在成骨過程中發揮重要作用的c-JNK以及P38MAPK，Wnt經典信號通路的高表達能夠抑制hMSC形成新生骨[16]。在骨髓微環境中，β-catenin需要長期的表達來維護原始造血細胞的能力[17]。本研究中我們分別提取了3月齡及18月齡大鼠BMSCs的全細胞蛋白及細胞核蛋白，我們的實驗結果表明，隨著年齡的增加細胞核內的β-catenin聚積量顯著增高，全細胞蛋白中的β-catenin表達水平也呈上升趨勢，這提示Wnt經典信號通路的激活是增齡性骨代謝異常的重要因素。另外，經典Wnt通路通過轉錄因子TCF/LEF和FOXO與β-catenin特異性關聯從而影響老化過程。這些轉錄因子的胞內水平以及它們在核內的定位與細胞老化密切相關。細胞內不同的wnt通路水平調控著老化過程。當β-catenin與TCF/LEF結合時，可以減緩老化；當β-catenin與FOXO結合時，可以加速細胞衰老[18]。此外，已經進入到細胞核內的β-catenin與 TCF/LEF結合后可啟動 Runx2、c-myc、cyclinD等靶基因，促使細胞進入S期，進而促進成骨細胞的分化、發育與成熟。本研究的qRT-PCR結果顯示，18月齡組BMSCs隨著細胞核內β-catenin聚積量增高Wnt經典信號通路被激活，細胞核內的轉錄因子LEF-1、TCF-4的表達水平顯著增高，這兩種轉錄因子的增高會影響BMSCs的增殖能力。

本研究通過對比研究不同年齡階段BMSCs的炎癥細胞因子分泌水平及Wnt經典信號通路關鍵基因及蛋白的變化，探索增齡因素影響下BMSCs生物學行為異常的發生機制。在機體的增齡至衰老過程中其表觀遺傳的變化，如干細胞數量的變化、自我更新及增殖能力的變化、多項分化潛能的變化對其有一定的影響，在這個過程中干細胞所處的微環境變化發揮同樣重要的作用。本研究發現隨著年齡的增長機體的炎癥因子表達水平會有所增高，這也是干細胞功能變化的重要干擾因素，此外還發現Wnt/β-catenin信號通路在此過程中發生明顯變化，基于此后期我們將系統研究增齡導致干細胞功能變化的作用機制，為提高增齡條件下干細胞增殖及成骨分化能力提供理論依據。

[1]Polymeri A,Giannobile WV,Kaigler D.Bone Marrow Stromal Stem Cells in Tissue Engineering and Regenerative Medicine[J].Horm Metab Res,2016,48(11):700-713

[2]Gu Z,Tan W,Feng G,et al.Wnt/β-catenin signaling mediatesthesenescenceof bonemarrow-mesenchymal stem cells from systemic lupuserythematosuspatients through thep53/p21 pathw ay[J].Mol Cell Biochem,2014,387(1-2):27-37

[3] Zhang DY,Pan Y,Zhang C,et al.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through promoting the ROSproduction[J].Mol Cell Biochem,2013,374(1-2):13-20

[4] Li X,Liu N,Wang Y,et al.Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein-1 cooperatesw ith glycogen synthasekinase-3βto regulateosteogenesis of bone-marrow mesenchymal stem cells in type 2 diabetes[J].Mol Cell Endocrinol,2017,440:93-105

[5] Liu W,Qi M,Konermann A,et al.The p53/miR-17/Smurf1 pathw ay mediates skeletal deformities in an age-related model via inhibiting the function of mesenchymal stem cells[J].Aging(Albany NY),2015,7(3):205-218

[6] 劉 娜,李 華,張 洋,等.炎癥微環境作用下非經典Wnt/Ca2+信號通路對牙周膜干細胞成骨分化的影響[J].中華老年口腔醫學雜志,2015,13(5):257-262

[7] Zhang B,Liu N,Shi H,et al.High glucose microenvironments inhibit the proliferation and migration of bone mesenchymal stem cells by activating GSK3β[J].J Bone Miner Metab,2016,34(2):140-150

[8]Liao L,Shi B,Chang H,et al.Heparin improves BMSC cell therapy:Anticoagulant treatment by heparin improves the safety and therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cell cytotherapy[J].Theranostics,2017,7(1):106-116

[9]Li C,Wei G,Gu Q,et al.Donor Ageand Cell Passage Affect Osteogenic Ability of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells[J].Cell Biochem Biophys,2015,72(2):543-549

[10]Vassilev A,DePamphilis ML.Links betw een DNA Replication,Stem Cellsand Cancer[J].Genes,2017,8(2)pii:E45

[11]Debacq-Chainiaux F,Erusalimsky JD,Campisi J,et al.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-betagal)activity,a biomarker of senescent cells in cultureand in vivo[J].Nat Protoc,2009,4:1798-1806

[12]Wang F,Pan X,Kalmbach K,et al.Robust measurement of telomere length in single cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110:e1906-1912

[13]Revuelta M,Matheu A.Autophagy in stem cell aging[J].Aging Cell,2017,16(5):912-915

[14]Mendelsohn AR,Larrick JW.Inflammation,Stem Cells,and the Aging Hypothalamus[J].Rejuvenation Res,2017,20(4):346-349

[15]Moschouris P,Retzepi M,Petrie A,et al.Effect of Wnt3a delivery on early healing events during guided boneregeneration[J].Clin Oral Implants Res,2017,28(3):283-290

[16]Liu G,Vijayakumar S,Grumolato L,et al.Canonical Wnts function as potent regulators of osteogenesis by human mesenchymal stem cells[J].JCell Biol,2009,185(1):67-75

[17]Nemeth MJ,Mak KK,Yang Y,et al.beta-Catenin expression in the bone marrow microenvironment is required for long-term maintenance of primitive hematopoietic cells[J].Stem Cells,2009,27(5):1109-1119

[18]Marchand A,Atassi F,Gaaya A,et al.The Wnt/betacatenin pathw ay is activated during advanced arterial aging in humans[J].Aging Cell,2011,10(2):220-232