β-catenin過表達的間充質干細胞對改善海水吸入型肺損傷治療效果的研究

王博榮 李鵬程 劉菲 金發光

溺水事故常有發生，據全球統計，每年因海水淹溺導致的死亡總數達到14萬人。當海水進入肺內，肺泡膜上皮屏障遭到破壞，蛋白滲出充滿肺泡腔，引起肺水腫，氣體交換障礙，導致呼吸衰竭，甚至死亡，這是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的生理特性[1]。因此，肺泡上皮細胞的再生和修復是改善肺損傷的關鍵。目前除了保守對癥支持治療，ARDS患者沒有有效的治療策略。然而有研究顯示，間充質干細胞移植為減少ARDS的病死率提供了一種可能途徑[2]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化能力和免疫調節特性，已報道能夠分化成肺泡上皮細胞，促進再生，減輕炎癥，改善病理損傷，甚至減少急性肺損傷(acute lung injury, ALI)模型病死率[2-4]。然而，由于MSCs在ALI肺組織模型的低移植率和低分化率，導致治療效果不佳[5-6]。因此，闡明MSCs在上皮的修復功能，使干細胞在受損肺組織得以定殖，分化成肺泡上皮細胞，改善對ALI模型的治療作用的機制尤為重要[7]。

經典Wnt信號通路，依賴β-catenin的聚集，是細胞增殖、活化，決定細胞命運，及胚胎發育過程中的細胞極性，發展成穩定的成熟組織的基本通路之一[8]。最近的一些研究表明，實際上經典Wnt通路及其下游信號分子對MSCs的自我更新和分化起著至關重要的作用，并且表達一些配體、受體、和Wnt通路的抑制劑[9]。Wnt配體綁定到Frizzled家族蛋白及低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)，可抑制糖原合成酶(GSK-3β)磷酸化和胞質中β-catenin降解，從而使胞內大量β-catenin聚集，進而轉移到核內，調節靶基因表達[10]。因此，β-catenin被認為是經典Wnt通路的一個關鍵信號調節器。

先前的研究顯示，在體外實驗中證實激活經典Wnt/β-catenin通路能夠促進大鼠MSCs分化成Ⅱ型肺泡上皮細胞，不僅具有抗氧化功能，還能夠促進自身向受損肺組織遷移、定殖[11]。然而，Wnt/β-catenin通路在體內如何調節MSCs的增殖、分化，如何對ALI的治療起作用仍然未知。體內環境十分復雜，與體外環境不同，會影響MSCs的定殖與分化。一項近期研究顯示，過表達β-catenin的慢病毒載體穩定轉染的大鼠MSCs，通過激活Wnt /β-catenin信號通路，調節大鼠MSCs遷移、增殖、分化[12]。

目前，少有報道MSCs移植治療海水吸入引起的肺損傷治療效果，幾乎沒有證據表明MSCs移植治療海水吸入型肺損傷(seawater inhalation induced acute lung injury, SWI-ALI)的治療效果可以通過β-catenin過表達改善。本研究的目的是確定MSCs通過β-catenin過表達對受損的肺泡上皮細胞的修復作用和它對SWI-ALI大鼠模型的總體治療效果，從而進一步明確其作用機制。

材料和方法

一、實驗材料

健康雄性SD大鼠，購于第四軍醫大學實驗動物中心，SPF級，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。Ctnnb1基因的過表達慢病毒購于上海吉凱基因化學技術有限公司，L-DMEM培養基購于美國Gibco公司，NIR815細胞標記試劑盒購于美國affymetrix公司。配方海水：根據我國國家海洋局第三海洋研究所提供配方配制，主要成分及含量接近我國東南沿海海水：NaCl 26.518 g/L，MgCl22.447 g/L，MgSO43.305 g/L，CaCl21.141 g/L，NaBr 0.083 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，pH 8.2，比重1.05，滲透壓 1 300 mmol/L。主要儀器設備：超凈工作臺購于中國蘇凈安泰公司，體內光學成像系統購于美國Caliper Life Sciences公司，高速臺式離心機購于美國 Eppendorf公司。

二、研究方法

1. Ctnnb1基因過表達慢病毒包裝和構建： 慢病毒載體EF1α-MCS-3FLAG-CMV-EGFP-T2A-Puromycin(過表達Ctnnb1)在上海吉凱有限公司包裝和構建?？蛰d體EF1a-EGFP作為一個空的對照。

2. 慢病毒轉染MSCs： MSCs(5×104/孔)接種于六孔板，每孔2 ml，過夜培養。轉染前細胞換液，每孔加入1 ml完全L-DMEM培養基含10%血清，加入目的基因病毒(2E+8TU/ml)5 μl，最后加入0.5 ml感染增強液(5 μg/ml)。3 d后通過熒光顯微鏡觀察熒光表達效果，確定轉染效率。將轉染慢病毒載體的MSCs在普通正常DMEM培養基中， 37 ℃、5%的二氧化碳培養箱中孵化。傳代至6～10代細胞用于實驗。

3. 構建海水吸入型肺損傷大鼠模型： SD大鼠稱重，腹腔內注入戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，大鼠保持仰臥位，頭位高于水平30°。大鼠共36只，被隨機分為四組，每組(n=9)?？瞻讓φ战M：未經任何處理健康大鼠：SWI-ALI模型組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入30 μl PBS；MSCs治療組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入MSCs(500 000個細胞于30μl PBS里)；MSCs-Ctnnb1治療組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入 MSCs-Ctnnb1(500 000個細胞于30 μl PBS里)。老鼠被置于含氧量正常房間中直到完全恢復清醒。4 h后大鼠被腹主動脈離斷處死。采集標本送檢。

4. 蘇木精和伊紅染色： 采集右肺上葉標本置入多聚甲醛溶液24 h，轉入75%乙醇溶液待送檢。取回蠟塊包埋組織，矢狀切片厚5 μm，切面蘇木精和伊紅染色。染色切片可以看到水腫、肺泡間質炎癥和出血、肺不張、壞死、透明膜形成。每只動物隨機選取9個切片高倍視野觀察每張幻燈片。

5. MSCs標記和追蹤： NIR815染料標記細胞，NIR815染料的細胞(5×105)直接氣道注入海水處理過的MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組大鼠模型。每組三個肺組織標本分別在處理后12 h，48 h體外肺部成像，使用光學成像系統(激發光=786 nm，發射光=814 nm，曝光時間4 000 ms)。自體熒光光譜模式使用軟件包大師2.4。肺部熒光強度是衡量器官目的區域與正?；骄盘柣谄毓鈺r間和目的區域的面積比(按比例縮小的計數/秒)。

結 果

一、MSCs慢病毒載體有效轉染

MSCs分別轉染空白對照EF1a-eGFP和目的基因EF1a-MCS-3FLAG-CMV- EGFP-T2A-Puromycin(過表達Ctnnb1)培養10代。本研究中，eGFP細胞陽性率反映了MSCs目的基因的轉染效率。第10代MSCs-Ctnnb1和MSCs-GFP的轉染效率通過熒光顯微鏡可檢測出，分析顯示轉染效率大于90%，見圖1。結果表明，慢病毒介導的轉染是有效的和穩定的。

圖1 同視野光學顯微鏡觀察(上層)和熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(下層)對比圖(×200)

二、實驗動物組織病理學檢測

從海水吸入型肺損傷鼠模型的肺組織觀察到肺泡壁增厚，肺泡間質炎性細胞浸潤，出血，肺泡滲出和水腫。然而在干細胞干預后4 h MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組比SWI-ALI模型組組織病理學特征明顯緩解。MSCs-Ctnnb1治療組比MSCs治療組病理改善效果更好，見圖2。

圖2 肺組織病理學檢測：海水吸入后4 h各組鼠模型肺組織病理學HE染色顯微鏡下形態(×200)

三、MSCs在肺組織內的保留

MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組大鼠干細胞干預造模后12 h和48 h進行肺組織體外近紅外光譜成像追蹤。彩色熒光圖像信號表明，MSCs-Ctnnb1治療組比MSCs治療組干細胞干預造模后12 h、48 h檢測熒光信號更強。每個組的信號在12 h后逐漸減弱，48 h后信號明顯減少，但仍能被檢測出，見圖3。

討 論

MSCs可以遷移和定殖到受損肺組織是ALI/ARDS的一個潛在治療策略。MSCs在受損肺組織相對低的移植率和分化率限制了對ARDS的有利治療作用[13-14]。在目前的研究中，將β-catenin基因穩定轉染MSCs，經典Wnt通路是細胞和組織發育、分化及其它生理功能的一個根本調控通路[8]。經典Wnt通路的激活主要取決于β-catenin的聚集。經典Wnt配體綁定卷曲(Fz)共受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP-5，6)，從而抑制糖原合成酶GSK-3β磷酸化及β-catenin降解，β-catenin大量積累進而轉移入核內調控基因表達[10]。因此，β-catenin被認為是經典Wnt通路的關鍵信號調節器。在研究中，利用慢病毒載體介導干細胞轉染獲得長期穩定的β-catenin基因過表達MSCs株。獲得的MSCs株傳10代測感染效率仍高達90%，并通過PCR和Western blot驗證了其感染效率是穩定的。有研究表明β-catenin過表達使MSCs核內β-catenin累積，被認為可促進Wnt/β-catenin通路的激活[7]。但β-catenin過表達激活Wnt/β-catenin通路的具體機制是什么，尚不清楚，還需進一步探索及研究。

在體外實驗中證實激活經典Wnt/β-catenin通路能夠促進大鼠MSCs分化成Ⅱ型肺泡上皮細胞，不僅具有抗氧化功能，還能夠促進自身向受損肺組織遷移、定殖[11]。這表明經典Wnt通路可提高MSCs對肺損傷的治療作用。在目前的研究中，通過MSCs穩定轉染β-catenin基因，證實了Wnt/β-catenin通路對AWI-ALI大鼠模型的這種積極作用。

MSCs可能具有在受損炎癥點聚集，發揮抗炎作用，分化成特定細胞，修復受損組織的生物學功能。很多研究都證實了MSCs向炎癥、創傷、缺血和腫瘤等疾病受損部位遷移和定殖的能力，主要在受損點增殖而不是在無損傷的部位[15-20]。同樣，很多研究證實急性肺損傷鼠模型明顯比正常對照鼠模型干細胞移植效果好[3, 21]。近來其它研究中也有證實經典Wnt/β-catenin信號通路在MSCs遷移中的積極作用[22-23]。通過細胞遷移實驗研究發現Wnt3a和LiCl刺激經典Wnt信號通路促進骨髓MSCs遷移到受損肺組織[11]。與以上研究一致，本實驗結果表明β-catenin過表達的MSCs相比對照MSCs明顯增加其在AWI-ALI鼠模型肺內的定殖。

經典Wnt/β-catenin信號通路除了促進干細胞遷移和定殖到急性肺損傷大鼠肺組織，對干細胞移植到復雜的體內環境還有一個積極的保護作用，可以降低干細胞存活率的不利因素，如氧化物、炎癥因子、缺氧和缺血等。有研究發現經典Wnt信號通路保護骨髓MSCs抗氧化應激，明顯增加干細胞存活率和抑制細胞凋亡[11]。此外體外實驗表明β-catenin過表達MSCs比對照組促進增殖。所有這些機制可能促進MSCs在海水吸入型受損肺內的定殖作用。

圖3 體外近紅外光譜成像的肺組織熒光信號表達(SW+MSCs control：MSCs治療組；SW+MSCs-Ctnnb1：MSCs-Ctnnb1治療組)

很多研究指出MSCs可以調控大部分免疫細胞的活性[24-26]，在本實驗中也證實了MSCs能夠抑制ALI鼠模型體內炎癥，多方面的證據支持這個結論：促炎因子如干擾素-γ、IL-1β、IL - 6的分泌減少，而抗炎細胞因子IL - 10增加[5, 21]，β-catenin過表達的MSCs放大這種效應，然而基本機制尚不清楚，值得進一步探索。

以上結果表明通過β-catenin過表達激活經典Wnt/β-catenin通路提高間充質干細胞的增殖及向受損肺組織的遷移能力，增加MSCs在肺內的定殖、緩解病理損傷，能夠提高MSCs對SWI-ALI的治療效果。

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