慢病毒介導環狀RNA mmu-circ-0001033過表達抑制低氧性小鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的實驗研究

王堅 胡明冬 唐曉丹 葛海燕 彭正羽 宋元林 夏世金

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是極高致死率和極高致殘率的病理生理綜合征，被冠以“假惡性”腫瘤之稱[1]，嚴重危害人們的健康，尚沒有根治的方法。低氧性肺血管結構重建(hypoxic pulmonary vascular structural remodeling, HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一[2-3]。平滑肌細胞是組成肺血管壁最重要的細胞，低氧所致的肺平滑肌細胞結構與功能異常是HPH形成的一種主要病理生理機制。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscular cells, PASMC)是組成肺動脈結構的主要細胞之一，在HPH形成中的作用至關重要。低氧能導致PASMC異常增殖，促進HPVSR，加速HPH發生與發展[2，4-6]?；赑ASMC結構異常在HPH發生和發展中的關鍵作用，抑制PASMC異常增殖已成為HPH靶向治療的研究熱點。

近年來備受關注的環狀RNA(circular RNA, circRNA)有可能為闡明HPH的機制提供新方法。circRNA通過與疾病關聯的miRNA相互作用在疾病中發揮著重要的調控作用，為闡明疾病發生機制、干預靶點和新型診斷標志物提供了新手段和新策略[7-9]。

我們前期的研究發現，對HPH模型小鼠肺組織進行circRNA芯片篩選和qRT-PCR驗證，結果表明HPH模型組(與常氧組比較)小鼠肺組織中環狀RNA mmu-circ-0001033表達顯著下調[10]，由此推測環狀RNA mmu-circ-0001033可能參與HPH發生機制。為了闡明 mmu-circ-0001033在HPH形成中的作用，我們進行環狀RNA mmu-circ-0001033過表達對低氧性PASMC增殖的影響實驗。本實驗通過慢病毒介導mmu-circ-0001033轉染體外培養的小鼠PASMC，觀察增強mmu-circ-0001033表達對低氧性PASMC增殖的影響，為進一步研究mmu-circ-0001033在調節HPH中的作用與機制提供實驗依據。

材料與方法

一、材料及主要試劑

10只健康雄性C57BL/6小鼠(購自上海杰思捷動物有限公司)。CCK-8(Cell Counting Kit)試劑盒(上海碧云天)、DMEM高糖培養基(Gibco，USA)、0.25%胰蛋白酶(Gibco，USA)、胎牛血清(Gibco，USA)、細胞培養板和培養瓶(Corning，USA)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，USA)；Nanovue的分光光度計(美國GE公司)；自動常壓缺氧孵箱(德國賀氏公司)。其余試劑是國產分析純。

二、實驗方法

1. 原代PASMC的培養與分組: 采用貼塊法培養細胞。取健康雄性C57BL/6小鼠，10%烏拉坦腹腔注射麻醉后，在無菌條件下打開小鼠胸腔取出肺動脈干和左右肺動脈，縱向剪開血管壁，用眼科彎鑷鈍性刮除殘余的血管內膜，用含有抗菌素的PBS反復沖洗，將中膜剪成1 mm×1 mm大小，用彎頭滴管移入到培養瓶內，組織塊之間距為0.5 cm左右。將植塊面翻轉，置于培養箱中。2 h后輕輕翻轉并加入含20%胎牛血清的DMEM培養液，組織塊浸泡在培養液，靜置1周。1周后觀察及換液。用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養細胞。當細胞生長至鋪滿瓶底80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。細胞在光鏡下呈典型的峰-谷狀表現，免疫細胞化學染色觀察抗α-平滑肌肌動蛋白抗體染色陽性，鑒定細胞。取3～5代細胞用于本實驗。低氧處理：置入自動常壓缺氧孵箱(德國賀氏公司)進行低氧處理。氧濃度：常氧21% O2，低氧2.5% O2。實驗分4組：常氧組、低氧組、mmu-circ-0001033過表達慢病毒轉染+低氧組、空白載體慢病毒轉染+低氧組。

2. mmu-circ-0001033過表達慢病毒構建

(1)慢病毒包裝：制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，使用質粒載體進行高純度無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h更換為完全培養基，培養48 h和72 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，4 ℃，2 000×g，離心10 min，去除細胞碎片，然后收集病毒上清液，再行超離。4 ℃，82 700×g，離心120 min，對其超離，最后得到高滴度的慢病毒超離液。

(2)滴度檢測：①細胞準備：將生長狀態良好的293T細胞消化計數后稀釋至1×105/ml，加入96孔板，100 μl/孔，為每個病毒準備6個孔。放入37 ℃，5% CO2培養箱中培養; ②加病毒：第2天，準備6個1.5 ml EP管，第一個EP管中加入10 μl病毒液，然后做3倍梯度稀釋，共6個稀釋度; ③追加培養液：第3天，有需要加嘌呤霉素篩選的孔，先吸去100 ml含病毒培養基，加入100 μl含1.5 μg/ml 嘌呤霉素的10% FBS完全培養基; ④觀察結果并計算滴度：第5天，在熒光顯微鏡下觀察結果，在觀察結果前6 h需更換新鮮10%胎牛血清的完全培養基，從孔中吸出80 μl培養基，然后加入80 μl新鮮10%胎牛血清的完全培養基，放入37 ℃，5% CO2培養箱中培養。6 h后熒光顯微鏡下觀察結果，熒光百分比在10～30%的孔計算病毒滴度。滴度(TU/ml)=細胞數×熒光百分比×MOI×病毒稀釋倍數×103。

3. 慢病毒載體轉染: 取PASMC鋪于96孔培養板，每組設3個重復孔。mmu-circ-0001033過表達慢病毒經擴增、鑒定、純化后用于本實驗。待細胞長至80%時，培養24 h后棄培養液，然后吸出培養液，加入mmu-circ-0001033過表達慢病毒或空白載體慢病毒轉染液，在37 ℃、5% CO2細胞孵箱培養1 h后棄轉染液。未轉染組不加慢病毒轉染液，其余同轉染組。后續在常氧(21% O2)和低氧(2.5% O2)條件下進行相應指標檢測，重復實驗3次。

4. qRT-PCR技術檢測細胞mmu-circ-0001033的表達水平： 采用Trizol法分別提取各組細胞的總RNA。用Nanovue的分光光度計測定各組RNA濃度。運用Takara逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA以用于后續的qRT-PCR檢測。應用Bio-Rad公司的PCR儀進行qRT-PCR檢測。引物序列如下：GAPDH-F: 5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；GAPDH-R：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′；mmu-circ-0001033-F： 5′-CTGTCCCAACTGTAAAGAAGGTG-3′；mmu-circ-0001033-R：5′-CATCGGTTTGGTGCTCCTC-3′。

5. CCK-8法檢測細胞增殖: 主要操作步驟：①在96孔板中配置100 μl的細胞懸液。將培養板放在培養箱預培養24 h(37 ℃，5% CO2)；②向培養板加入10 μl不同濃度的待測物質；③將培養板在培養箱孵育所設定的時間；④向每孔加入10 μl CCK-8溶液；⑤將培養板在培養箱內孵育1～4 h；⑥用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

三、統計學方法

結 果

一、 低氧下調PASMC中mmu-circ-0001033的表達

低氧誘導PASMC中mmu-circ-0001033的表達明顯下調，且呈時間依賴性。見圖1。

圖1 低氧誘導PASMC中mmu-circ-0001033的表達下調；與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01，n=3

二、 mmu-circ-0001033過表達慢病毒轉染結果

與對照組比較，慢病毒轉染組中mmu-circ-0001033表達顯著上調(P<0.05)，提示mmu-circ-0001033過表達慢病毒成功轉染入PASMC，且并高效表達，見圖2。

圖2 mmu-circ-0001033過表達慢病毒成功轉染PASMC；與Control組比較，*P<0.05，n=3

三、 CCK-8法檢測細胞增殖結果

與常氧組比較，低氧組和空白載體慢病毒轉染+低氧組PASMC增殖明顯增多(P<0.05)，而mmu-circ-0001033過表達慢病毒轉染+低氧組PASMC增殖顯著下降。說明過表達的mmu-circ-0001033 顯著抑制低氧所誘導的PASMC的增殖，見圖3。

圖3 細胞增殖檢測結果；注：1～4：常氧組、低氧組、空白載體慢病毒轉染+低氧組、mmu-circ-0001033過表達慢病毒轉染+低氧組；與Control組比較，**P<0.01，n=3

討 論

本實驗研究首次發現，低氧可導致PASMC異常增殖和mmu-circ-0001033的表達明顯下調，而慢病毒介導的mmu-circ-0001033過表達能顯著抑制低氧所誘導的PASMC的增殖，提示增強mmu-circ-0001033表達可抑制PASMC的增殖，這為mmu-circ-0001033過表達改善HPVSR，從為而防治HPH提供了實驗依據。

circRNA作為RNA家族成員，具有特征性的共價閉合環結構的特征性。circRNA具有種屬、組織、疾病及發育階段等的特異性，與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發生發展密切相關。circRNA的主要功能是通過海綿吸附miRNA發揮生物學功能，同時還具有調控轉錄和轉錄后過程、可變剪接、編碼蛋白以及充當蛋白誘餌等作用。目前多種預測方法被提出用于發現circRNA[8]。

目前認為，circRNA是存在于生物中具有共價閉合環結構特征的非編碼RNA[11]。circRNA曾經被認為是RNA剪切所形成的錯誤產物而輕視為“垃圾”[12-13]。然而，科學家們應用高通量測序確認circRNA是細胞基因表達的一種形式[14]。研究還發現circRNA具有保守性、穩定性、多樣性和豐富性，參與調節胞內其他RNA的功能，在惡性腫瘤、心血管疾病、神經精神性疾病、先兆子癇以及2型糖尿病等發生發展中發揮著關鍵的作用[8]。

circRNA在心血管疾病發生和發展過程中發揮了重要作用。Burd等[15]發現，在動脈粥樣硬化性血管疾病中來自INK4A/ARF位點的環狀RNA(cANRIL)的表達量與INK4A/ARF的轉錄以及動脈粥樣硬化性血管病發生風險密切相關，其機制可能是cANRIL募集PcG復合物導致INK4A/ARF的沉默，增加了動脈粥樣硬化性血管病發生的易感性。Wang等[16]發現，環狀RNA(HRCR)能夠海綿吸附miR-223，抑制miR-223的活性，促進ARC蛋白表達上調，進而抑制心肌肥厚和心衰的發生。Foxo3 circular RNA能夠抑制抗衰老和抗應激相關蛋白，促進阿霉素誘導的心肌病的發生[17]。 Geng等[18]發現環狀RNA(Cdr1as)能夠海綿吸附miR-7a上調PARP和SP1蛋白的表達，進而增加心梗的面積，提示Cdr1as有望作為心梗的治療靶點。本研究提示，環狀RNA mmu-circ-0001033在肺動脈高壓發生中可能具有重要作用。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1 (human immunodeficiency virus-1，HIV-1) 來源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉染和穩定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統的主要組成部分。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現外源基因在細胞或活體組織中表達。體外和體內實驗中慢病毒己經成為表達外源基因的常用載體之一， 且正在獲得越來越廣泛的應用?；诼《据d體的優勢，本研究構建了mmu-circ-0001033過表達慢病毒載體，實現了mmu-circ-0001033在PASMC中進行穩定且高效的表達，為研究mmu-circ-0001033的生物學功能提供強有力的手段。

然而，本研究僅僅觀察到低氧下調PASMC mmu-circ-0001033表達，以及慢病毒介導的mmu-circ-0001033過表達能顯著抑制低氧所誘導的PASMC的增殖，但對其機制尚不清楚；此外，本研究的結論也需要進行動物實驗，更需要用HPH臨床樣本進行驗證。

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