腺癌患者和肺移植供者下呼吸道菌群對比研究

張鑫 熊葉 馬可 李強,3

近年來通過新一代測序技術分析，人們發現機體擁有非常多樣化的微生物群落，而這些微生物群落被認為對人體健康至關重要。已有證據顯示人體不同部位微生物菌群的改變與癌癥的發生發展相關[1-4]。但到目前為止關于肺部菌群與肺癌之間關系的研究相對較少，是否會像其它部位的菌群一樣，變化的肺部菌群影響著肺癌的發生發展目前仍不明確。本研究旨在觀察對比腺癌患者下呼吸道和健康肺下呼吸道菌群結構是否存在差異。

對象與方法

一、一般資料

收集12例在上海長海醫院胸外科行肺葉切除術的肺腺癌患者作為疾病組(DT組)。12例患者術前經血清學及影像學檢查除外合并肺炎，其中男性6例，女性6例，年齡51～73歲(平均64.3歲)。12例患者術后經病理證實均診斷為肺腺癌，臨床分期Ⅰb期1例，Ⅱa期6例，Ⅱb期3例，Ⅲa期2例。同時收集5例在無錫市人民醫院手術室行雙肺移植手術過程中修剪下來的健康肺氣管組織作為健康對照組(H組)，5例患者均為男性，年齡34～50歲(平均40.5歲)，影像學檢查無明顯感染病灶。所有樣本在收集前由本人或家屬簽署知情同意書。

二、呼吸道組織收集及處理

手術室內獲取組織后，放入2 ml的無菌Eppendorf管，并做好標記，立即放入液氮中瓶中，之后轉運至我科實驗室-80°下凍存。干冰下運送至派森諾醫藥科技有限公司，無菌技術下對組織進行研磨、均漿、DNA提取。

三、測序與分析

本研究采用前引物(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和后引物(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，對樣本DNA進行PCR擴增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，利用Iliumina MiSeq測序平臺對對細菌的16S rDNA基因V4區進行高通量測序。對原始下機數據根據序列質量進行初步篩查，并去除嵌合體等疑問序列。應用UCLUST序列比對工具[5]，對獲得的高質量序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分。通過QIIME軟件將OTU代表序列與Greengenes數據庫[6]的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應的分類學信息。之后對每個樣本α多樣性指標(Chao1、ACE、Simpson及Shannon指數)進行計算，同時計算各樣本在門及屬水平上的OTU數。使用Mothur軟件，調用Metastats對門和屬水平的各個分類單元在樣本(組)之間的序列量(即絕對豐度)差異進行兩兩比較檢驗。通過Galaxy在線分析平臺提交屬水平的相對豐度矩陣進行LEfSe分析。使用PICRUSt軟件，根據KEGG數據庫中微生物代謝功能的類別對群落樣本進行預測。

四、統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件，對符合正態分布的兩組數據應用t檢驗；對不符合正態分布的數據，則進行非參數秩和檢驗。

結 果

一、樣本菌群群落概況

17例組織樣本中產生了總共623,370個高質量序列，平均每個樣本有36,668個序列。對前述獲得的高質量序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分，通過去除一些豐度和出現頻率都非常低的“稀有”OUT(當于菌群數據中的“背景噪音”)后，共計產生38,220個OUT，平均每個樣本具有2,248個OUT。23個高豐度(大于1%)的OTUs占所有序列的80%，大多數剩余的OTUs以低豐度存在(<1%)。根據樣本OUT劃分和各分類水平微生物類群數統計后發現，兩組患者下呼吸道組織標本中4個最豐富的菌門包括：Proteobacteria(65%)，Firmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)，共占了總序列的94%；最豐富的屬主要包括：Burkholderia(20%)、Sediminibacterium(7.4%)、Lactobacillus(6%)、Acinetobacter(3.8%)、Pseudomonas(3.7%)、Lactococcus(3.3%)、Caulobacter(3%)、Ralstonia(2.7%)共占了總序列的50%，見圖1。

圖1 DT組與H組在菌門(左圖)及菌屬水平(右圖)相對豐度情況

二、兩組菌群多樣性及主要菌群豐度比較結果

兩組α多樣性指數：Chao1，ACE，Shannon和Simpson如表1所示。從反映菌群豐度的Chao1和ACE指數來看，H組明顯高于DT組(P<0.01)。Shannon和Simpson指數反應了菌群的多樣性，H組Shannon指數高于DT組(P<0.05)，Simpson指數H和DT組間并沒有發現明顯區別。Shannon指數對群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指數對均勻度和群落中的優勢OTU更敏感。以上結果說明，與DT組相比H組菌群豐度、多樣性更高。

表1 兩組多樣性指數比較

注：aP=0.003，bP=0.006，cP=0.043

對兩組樣本菌群最豐富4個菌門的相對豐度進行比較后發現(圖1及表2)，Proteobacteria和Firmicutes在H組豐度明顯高于DT組(P<0.01)，Bacteroidetes和Acidobacteria在DT組豐度明顯高于H組(P<0.01)。對差異菌門中的菌屬進行進一步分析，通過LEfSe分析計算出兩組豐度差異值最大的菌屬，見圖2。發現Vibrio、Bifidobacterium、Megamonas、Streptomyces、Collinsella、Achromobacter等菌屬在DT組豐度明顯高于H組，Lactobacillus、Erysipelotrichaceae、Oscillospira、Caulobacter、Flavobacterium、Thermoactinomyces、Ruminococcus、Coprobacillus、Dorea等菌屬在H組豐度明顯高于DT組。

圖2 兩組間具有顯著差異的分類單元(橫坐標則以條形圖展示對應分類單元的LDA差異分析對數得分值，長度越長表明該分類單元的差異越顯著)

表2 兩組主要菌門間相對豐度比較

注：aP=0.013，bP=0.0001,cP=0.028,dP=0.0001

三、兩組在菌群代謝功能通路上的差異。

通過將現有的群落組成數據與已知的參考基因組數據庫相比較，并對原始數據中的微生物豐度數據進行校正，通過PICRUSt軟件，根據KEGG數據庫中微生物代謝功能的類別對群落樣本進行預測。由圖3可以預測，外來物質降解與代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、其他氨基酸的代謝、脂質代謝及氨基酸代謝等代謝功能在H組要高于DT組， 輔助因子與維生素代謝，聚糖生物合成與代謝，酶家族，能量代謝，碳水化合物代謝等代謝功能在DT組要高于H組。

圖3 群落樣本的代謝功能預測圖(圖形的長度反映了該樣本中編碼相應功能的基因豐度的高低)

討 論

過去一直認為健康肺是無菌的，但隨著技術的發展，越來越多的研究顯示，肺部存在微生物群落，并且這些微生物群落與多種肺部疾病相關(哮喘、COPD、間質性肺炎、支氣管擴張等)[7-10]。在做肺部菌群研究時，許多實驗樣本都是通過BAL和防污染毛刷獲取的，支氣管鏡通過上呼吸道進入下呼吸道，存在上呼吸道污染下呼吸道樣本的風險，但也有研究顯示經氣管鏡(經鼻或經口)取得的BAL中的菌群卻未受影響[11]。痰液作為一種無創的并且易獲取的標本已經被廣泛應用于許多肺部疾病中(如：COPD、哮喘、支氣管擴張)[12-15]， 但痰液標本更容易被污染。在手術室通過無菌手術獲取肺組織可以避免樣本經過上呼吸道，是目前來說最能客觀反映肺部菌群的理想樣本，因此為了能客觀反映腺癌患者下呼吸道菌群結構特點，我們采用了收集手術室肺切除組織作為研究對象。

目前關于非疾病部位肺組織的主要菌門報道相似，主要是以Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria四大菌門為主。我們的研究也顯示肺組織中豐度最高的4個菌門是Proteobacteria(65%)，Firmicutes(18%)，Bacteroidetes(9%)和Acidobacteria(2%)。但關于菌屬的相關報道差異較大，Yu等[16]采用illumina測序方法，分析了165例腫瘤患者非腫瘤肺組織樣本，發現相對豐度較高核心菌屬：Acinebobacter(11.9%)，Comamonadaceae(11.6%)，Thermus(8.7%)，Pseudomonas(7.1%)，Oxalobacteraceae(5.5%)，Ralsonia(2.1%)，Staphylococcus(2.1%)，Streptococcus(2.0%)。而本研究顯示除了Acinebobacter、Ralsonia、Streptococcus三種菌屬豐度相似外，另外三種Burkholderia、Sediminibacterium、Lactobacillus菌屬豐度均較高，Comamonadaceae，Thermus及Oxalobacteraceae菌屬豐度較低。Bassis等[11]收集了28例健康人群的BALF，通過454焦磷酸測序的方法分析菌群結構，發現健康人群BALF核心菌屬主要是：Prevetella、Streptococcus、Neisseria、Fusobacterium、Veillonella、Porphyromonas、Lactobacillus、Halomonas、Capnocytophaga、Actinomyces等。目前關于肺部菌群的研究大部分集中在西方人，而中國人肺部菌群研究相對較少。Hosgood等[17]收集了8例健康中國女性痰液樣本，通過454焦磷酸測序后分析，痰液中核心菌屬主要是：Streptococcus、Neisseria、Gemella、Granulicatella、Actinomyces、Veillonella、Prevotella等?？梢姺羌膊〔课环谓M織在不同的研究中菌屬差異較大，考慮可能是受人群，生活區域，取材部位，樣本類型，16SrDNA靶測序區，數據庫和數據分析方法等影響。目前已有研究顯示非疾病部位菌群α多樣性與人口密度，空氣PM10顆粒物及家用煤燃燒相關[16-17]。

我們選取了12例肺葉支氣管開口處作為DT組，5例肺移植者健康肺氣管組織作為H組。早期有報道顯示非癌組織α多樣性要顯著高于癌組織，腺癌組織癌組織α多樣性要顯著高于鱗癌組織[16]。我們的研究顯示健康肺呼吸道內菌群α多樣性要顯著高于腺癌患者呼吸道組織，并且在主要的菌門及菌屬豐度兩組間差異明顯。根據預測兩組在菌群代謝通路上亦有諸多不同，這些改變會不會像腸道菌群一樣，在癌癥的發生、發展過程中起一定作用亦或是由于肺癌的進展導致局部微環境的變化進而影響肺部菌群，目前來看肺部菌群亦有這樣的趨勢，但還需要更多的研究來探討這一問題。

本研究的不足是病例數較少，在未來我們需要更大樣本的研究來分析中國人在肺內不同位置的菌群結構特征，另外其它的病理類型如鱗癌組織局部的菌群結構特征是否又有所不同，本研究并未涉及。

本研究應用高通量測序的方法，通過在無菌條件下收集樣本，分析了我國腺癌患者及健康肺下呼吸道內細菌菌群結構特征，以Proteobacteria(65%)、Bacteroidetes(18%)、Firmicutes(9%)和Acidobacteria(2%)菌門為主。另外本研究發現健康肺呼吸道內菌群α多樣性要顯著高于腺癌患者呼吸道組織，并且在主要的菌門及菌屬豐度兩組間差異明顯。通過軟件預測兩組在菌群代謝通路上亦有諸多不同。這些菌群結構的改變對肺腺癌到底有何影響，還需要我們進一步研究。

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