真菌中COP9 信號復合體的研究進展

楊 曉, 王明爽, 李紅葉

(浙江大學 農業與生物技術學院生物所，杭州 310012)

蛋白質是生命活動的主要承擔者，其合成與降解的動態平衡，是細胞行使各種生物學功能的基礎。真核細胞內，蛋白質降解主要通過泛素蛋白酶系統(Ubiquitin-proteasome system, UPS)[1]進行，該系統由泛素分子(ubiquitin)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)以及 26S 蛋白酶體(Proteasome)組成。泛素連接酶 (Cullin-RING ubiquitin ligases, CRLs) 是 E3中最大的家族，它在真核生物的細胞生長、分化、繁殖、生物節律等生命過程中發揮重要作用[2]，一個典型的CRL復合體包括 Cullin 蛋白、RING 蛋白、調節蛋白和底物識別蛋白[3]。

COP9 信號復合體(COP9 signalosome, CSN)是真核細胞內高度保守的多亞基蛋白復合物，最早作為光形態建成中重要的轉錄因子發現于擬南芥中，它在黑暗環境下能抑制多種基因轉錄，隨后哺乳動物、果蠅、線蟲、酵母等真核生物中相繼發現CSN的存在。

CSN主要的生物學功能是調節泛素介導的蛋白降解，目前已知的調控方式有4種：1)Nedd8是一種類泛素蛋白，它與Cullin蛋白結合后(稱為Neddylation)能加速CRLs復合體的組裝，促進底物泛素化從而加速蛋白降解，而CSN作為一個異肽酶能將Nedd8從Cullin蛋白上切除，造成Cullin蛋白的脫Nedd8修飾(稱為Deneddylation)從而影響蛋白降解[4]；2)CSN能與CAND1配合來調控CRLs復合體的組裝、分解，維持CRLs組分的活性及穩定性[5]；3)CSN能與CRLs復合體進行物理結合，這會阻礙靶標基質與泛素結合酶E2的互作，從而降低CRLs復合體的活性[6]；4)CSN能與脫泛素酶UBP12/USP15結合來抑制CRLs組分的泛素化，從而維持 CRLs復合體的穩定性[7]。

除調控泛素相關的蛋白降解外，CSN也參與多種生理生化過程的調節。在植物中，CSN參與調控光形態發生、花器官發育、信息素信號轉導、植物抗病性等眾多生理過程，在動物中，CSN參與調控細胞周期、腫瘤形成、心肌細胞存活等多種生命活動。高等真核生物中，任何一個CSN亞基的缺失突變株都會致死，而低等真核生物中，對應的突變株能夠存活且遺傳信息能在子代中穩定遺傳，因此真菌成為研究CSN在系統進化、結構組成、生物學功能方面的理想材料[8]。本文對真菌中CSN的結構組成、生物學功能進行了詳細介紹，以期為真菌及其他真核生物中CSN的研究提供一定的參考數據。

1 真菌CSN的亞基組成

傳統研究認為CSN最多包含 8 個亞基，即CSN1-8，但最新研究發現CSN包含第九個亞基CSNAP[9-10]，其中CSN1-4，CSN7-8含有 PCI 結構域(proteasome, COP9 Signalosome, initiation factor 3)，這6個亞基形成馬蹄形環狀結構，而CSN5和CSN6 含有MPN 結構域(Mpr1-Pad1-N-teminal domain)，這2個亞基以異源二聚體的形式位于馬蹄環當中[11]。另有研究認為，CSN1/2/3/8 和CSN4/5/6/7是兩個相互對稱的模塊，兩者通過 CSN1 和 CSN6 間的互作進行連接[12]。CSN中富含α螺旋的PCI結構域可以介導各亞基間的互作，使各亞基形成一個整體，而每個亞基的穩定性又依賴于CSN整體的存在。

一些低等真核生物會缺少某些CSN亞基，甚至擁有自己獨特的亞基，說明CSN的亞基組成具有物種特異性[8]，擬南芥、人、小鼠和果蠅等真核生物的CSN包含8個亞基，秀麗隱桿線蟲的CSN缺少CSN8亞基。真菌中，釀酒酵母CSN的亞基組成最為特殊，包括CSN11、CSN10、RPN5、CSN5、CSI1和CSN9共6個亞基，分別是高等真核生物中CSN1、CSN2、CSN4、CSN5、CSN6和CSN7的同源亞基[13]，除CSN5外，其他各亞基與其同源亞基的同源性都非常低。裂殖酵母的CSN缺少CSN6、CSN8這2個亞基[14]，粗糙脈孢菌的CSN缺少CSN8亞基[15]，構巢曲霉的CSN包含完整的8個亞基[16]。Barth等從進化角度對61種真核生物的基因組進行分析發現，包括復細胞動物、變形蟲和一些真菌在內的真核生物中能夠檢測到CSNAP的同源亞基[10]。

2 真菌CSN的生物學功能

與高等真核生物不同，真菌CSN亞基缺失突變株不致死，而是出現各種異常的表型，主要表現在真菌的生長發育、生物鐘、代謝調控、敏感性、對細胞核物質的影響、CSN的脫Nedd活性6個方面。目前真菌中CSN的研究對象包括釀酒酵母、裂殖酵母、粗糙脈胞菌和構巢曲霉，此外其他真菌中暫無研究。鑒于CSN功能的保守性，真菌與其他真核生物中的研究成果可以相互啟發，一些無法在高等真核生物中展開的研究也可將真菌作為替代對象。

2.1 真菌的生長和發育

不同CSN亞基對真菌菌絲生長、子實體發育的作用不同。構巢曲霉中，CSN4或CSN5缺失突變株雖能起始有性發育形成原基，但細胞壁和子囊孢子的進一步分化和成熟受阻，并且在生長后期出現短且高度分枝的菌絲，說明CSN能影響構巢曲霉的有性發育及菌絲的頂端延伸[17]。隨后Busch等補充發現，CSN1、CSN2及CSN5中的JAMM結構域對構巢曲霉的有性發育也非常重要[16]。除影響有性發育外，CSN也會影響有性發育和無性發育間的平衡，構巢曲霉中PPOA、PPOC兩個基因能對類激素信號PSI因子進行調控，其中PPOA促進有性發育，PPOC促進無性發育，CSN通過調控PPOA 和 PPOC 的比例來調節構巢曲霉的有性發育和無性發育[18]。

粗糙脈孢菌的CSN包含CSN1-7共7個亞基，只有CSN3缺失突變株表型與野生型一致，其余各亞基的缺失都會使菌絲生長、分生孢子發育出現不同程度的缺陷[19]。Zhou等進一步發現，對CSN5 JAMM結構域中關鍵位點(EXnHXHX10D)進行點突變會破壞CSN的脫Nedd活性，但并不影響脈孢菌的生長發育，且點突變的CSN5亞基能恢復CSN5缺失突變株中的表型缺陷，說明對脈胞菌的生長發育而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要[20]。

2.2 真菌的生物鐘

粗糙脈孢菌中，除CSN3外任何亞基的缺失突變株生理節律都表現出不同程度的缺陷，其中CSN2、CSN5的缺失使SCFFWD-1復合物中FWD1蛋白、CUL1蛋白的含量及穩定性降低，導致生物鐘蛋白FRQ的泛素化及降解受阻，從而出現異常的產孢節律。與此相反，CSN5 JAMM 結構域的點突變株雖喪失脫Nedd活性，但生物鐘未受影響，說明對粗糙脈胞菌的生物鐘而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要[15, 19-21]。值得一提的是，脈孢菌和動物中對生物鐘的調控是保守的，而人類Smith-Magenis綜合征病人中CSN3存在共同缺陷，根據脈胞菌中的研究成果推測，該病中生理節律混亂、睡眠擾亂的癥狀可能源于CSN功能的缺失。

2.3 真菌的代謝調控

Chen[22]和Licursi[23]等通過轉錄組和蛋白組分析發現，釀酒酵母CSN5缺失突變株中蛋白合成相關基因普遍上調、糖運輸相關基因明顯下調、氨基酸合成相關蛋白明顯增多，此外CSN5還參與脂類代謝、麥角甾醇合成相關基因的調控，其他CSN突變株中也存在相似的基因調控模式，說明CSN在釀酒酵母代謝中具有重要作用[22-23]。次級代謝與真菌發育密切相關，Nahlik[8]和Busch等[16-17]發現，敲除CSN4、CSN5或者對CSN5亞基JAMM活性核心中3個保守的氨基酸位點進行定點突變，均會影響構巢曲霉的次級代謝，其中CSN5的缺失會導致氧化還原酶相關基因表達上調、發育過程中葡聚糖酶的激活受阻且細胞壁功能相關基因表達下調、雜色曲霉素合成途徑失調、苷色酸及其衍生物的積累，具體表現為：突變株氧化壓力應答受損并積累不常見的次級代謝產物，發育過程中細胞壁的重塑受阻，積累各種雜色曲霉素的中間產物及向培養基中釋放紅色物質等。這些結果表明CSN5能協調多種代謝途徑來保證構巢曲霉的生長發育正常進行。

2.4 真菌的敏感性

真菌的敏感性既包括對激素等內部信號的敏感程度，也包括對金屬離子、化學試劑、氧化壓力等外部信號的敏感程度。釀酒酵母中，不同的CSN缺失突變株對信息素的敏感程度不同，從而對交配效率產生不同的影響，這種影響與CSN的脫Nedd活性無關，具體表現為：與野生型菌株相比，CSN5、CSN9、CSN12缺失突變株交配效率提高了100%；CSN10、PCI8缺失突變株交配效率無變化；CSI1缺失突變株交配效率顯著降低[24]。此外，Licursi等發現釀酒酵母中CSN5能對鋅代謝相關基因進行調控，CSN5缺失突變株細胞內鋅濃度增加且對培養基中低濃度的鋅、鎳、鎘變得敏感，突變株對酮康唑敏感性增強，對制霉菌素抗性增強[23]。

構巢曲霉發育過程中CSN5的缺失會影響至少15%的基因的轉錄，并伴隨蛋白質組的改變，導致突變株氧化還原調控受損并對氧化壓力高度敏感。此外，敲除CSN5或對CSN5 JAMM 結構域進行突變均會增強突變株對激素的敏感性[8, 15]。

2.5 對細胞核物質的影響

核苷酸還原酶是由2個大亞基(CDC22)和2個小亞基(SUC22)組成的異質四聚體，一般情況下CDC22位于細胞質，而SUC22被錨定蛋白SPD1固定于細胞核，大小亞基分離，一旦細胞進行DNA復制，錨定蛋白SPD1將被泛素蛋白酶系統降解，使細胞核中的SUC22釋放到細胞質中從而與CDC22結合成有活性的核苷酸還原酶。裂殖酵母中CSN1或CSN2的缺失會阻礙錨定蛋白SPD1的泛素化及降解，使SUC22與CDC22無法結合成完整的核苷酸還原酶，導致突變株S階段延遲并對DNA損傷、UV變得敏感，過量表達SUC22或敲除SPD1均能恢復這些表型缺陷，再次證明CSN能影響核苷酸還原酶的活性[14, 25]。此外，CSN能與Brc1以一種獨立且互補的方式在裂殖酵母DNA損傷修復及基因組穩定性方面共同發揮作用[26]，且CSN1、CSN2 的缺失會使異染色質產生缺陷[27]，而其他的CSN缺失突變株沒有可識別的表型。

面對不同的DNA損傷藥劑，構巢曲霉野生型菌株中CSN4、CSN5的mRNA穩定性增強且含量增加，而CSN4、CSN5缺失突變株生長減慢且對DNA損傷藥劑變得敏感，說明CSN與構巢曲霉DNA損傷應答相關，進一步研究發現DNA損傷應答過程中CSN4、CSN5與NPKA、UVSBATR存在遺傳互作[28]。

2.6 CSN的脫Nedd活性

釀酒酵母中的CSI1與哺乳動物中的CSN6功能相同，CSI1中的S6CD 結構域與CSN6中的羧基末端有明顯的同源性但缺少氨基末端的MPN--結構域，這并不影響釀酒酵母CSN的脫Nedd活性[29]，但任何一個CSN亞基的缺失都會使釀酒酵母喪失脫Nedd活性[24]。對哺乳動物CSN6突變株(包含羧基末端的S6CD結構域，但缺少MPN--結構域)進行研究發現，MPN--結構域的缺失不會影響CSN的組裝及脫Nedd活性，這與釀酒酵母中的情況相同[29]，再次說明MPN--結構域對于脫Nedd活性是非必需的。此外，Cirigliano等經過一系列研究和驗證發現了2種未命名的小分子片段能夠抑制釀酒酵母CSN5的脫Nedd活性[30]。

裂殖酵母中CSN1-5均會影響CUL1蛋白和CUL3蛋白的Nedd化狀態[14]，但只有CSN1 和CSN2 會影響CUL4蛋白的Nedd化狀態[25]，說明CSN對不同的Cullin蛋白有不同的作用機制。此外，CSN能協助脫泛素酶UBP12p定位于細胞核中的Cullin蛋白，從而維持CRLs的穩定[31]。

粗糙脈孢菌中除CSN3外，其他任何亞基的缺失均會影響CSN的脫Nedd活性及CUL3、CUL1、BTB蛋白的穩定性[19-20]，而CSN5 JAMM結構域的點突變株雖喪失脫Nedd活性，但CSN的組裝、CSN與Cullin蛋白的互作及SCFFWD-1復合物穩定性均不受影響，說明對于維持CRLs的穩定性而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要。值得一提的是，CSN3的缺失會減少CSN復合物的數量并形成CSN4/5/6和CSN4/5/6/7等一些亞復合物[19-20]。

構巢曲霉中任何CSN亞基的缺失均會導致脫Nedd活性喪失，其體內7個亞基(CSN1-4, 6-8)的CSN復合物只有與CSN5整合后才具有脫Nedd活性，表明CSN5的融合是構巢曲霉CSN組裝的最后一步，這與LID亞復合物的組裝順序有明顯區別[32-33]。

2.7 其他

PCI家族包括CSN、LID亞復合物、真核翻譯起始因子(EIF3)，它們共同調控從蛋白翻譯到蛋白降解的整個過程，三者間具有序列同源性、相似的結構排布并且彼此互作[34]，相對于EIF3，CSN與LID的聯系更加緊密且具有極高的相似性，但也有明顯的區別及不同的組裝順序[35]。釀酒酵母中CSN11能與EIF3互作，CSN9 和CSI1能與LID中的RPN5互作[36]，除了三者間的互作，各CSN亞基會影響彼此的定位，野生型菌株中CSN5以復合物的形式聚集在細胞核，而CSN12缺失突變株中CSN5以單體形式存在，說明CSN12對于維持CSN的穩定性非常重要，此外，CSN12、CSN10、PCI8/CSN11、CSI1均會影響CSN5在細胞內的定位[36]。裂殖酵母中也有相似的結論，CSN4與CSN復合物的結合需要CSN1、CSN2和CSN5的協助，而任何一個CSN亞基的缺失都會影響到其余亞基特異性的核定位[14]。

許多真核生物中除CSN外，還有另外的脫Nedd酶DEN1，兩者間的明確分工還未徹底明確，構巢曲霉中兩者參與不同的生活史，CSN主要調控有性生活史及次級代謝，而DEN1主要影響無性生活史[37]，兩者間的互作與平衡會影響細胞內蛋白的穩定性、脫Nedd活性及發育中的光反應等，CSN5/DEN1雙敲菌株結合了兩個單敲菌株的表型，即多細胞發育嚴重受損、主要進行營養生長并產生紅色色素。此外，CSN3、CSN5、CSN6、CSN7和CSN8能調控細胞核內DEN1的穩定性[37-38]。

3 小結與展望

本文對真菌中CSN的亞基組成及生物學功能進行了總結，雖然有很多突出成果，但仍有很多問題亟待解決，未來可就以下幾個方面做進一步研究：1)CSN與真菌致病性的關系。目前的研究多集中在模式真菌，CSN在其他病原真菌及真菌致病性方面的功能尚未研究，開展這方面的工作可為控制真菌病害提供新思路。2)CSN與生物工程。真菌發育與次級代謝密切相關，一些次級代謝基因簇在常規生長條件下保持沉默，而一些CSN突變菌株能將這些基因激活從而獲得新的次級代謝產物或增加已知的次級代謝物的產量，這可以為生物制藥、病害防治等提供新的思路[8, 39-40]。3)CSN與VEA、CAND1基因的確切關系。構巢曲霉中，VEA、CAND1、CSN突變株間有相似的表型，這些基因間的確切關系有待深入研究[17, 41]。

此外，由于CSN的功能具有保守性，因此真菌中的很多研究成果，如CSN對生物鐘的調控、CSN對脂類代謝的調控、CSN與DEN1間的互作形式等，可以為其他真核生物中CSN的研究提供一定的參考。

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